CN104694524A - 一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体 - Google Patents

一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体，该方法包括：构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；针对该位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，获得定点突变文库；从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。该方法通过拉氏图提供的结构信息对酶进行理性设计，并结合定点突变技术，有效提高突变概率，节省时间，提高实验效率，并筛选得到催化活力优于野生型酶的突变酶，该突变酶可提高催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的反应速率，有利于GABA的工业化生产。

Description

一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体。
背景技术
定点突变(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术，是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。特别是在酶的理性设计中，或者利用随即突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸残基位点后，进行定点突变分析，将有利于更好的了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用。
谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15)是一种广泛地存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，简称GABA)。GABA是哺乳动物中枢神经系统的一种关键的抑制性神经递质，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压、改善免疫功能、延缓衰老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为“新资源食品”。
目前，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的高效生物合成正得到越来越多的重视。在工业生产中，往往希望提高反应速率，从而提高生物催化与转化的效率。GAD作为制备和生产GABA的关键酶，提高其催化活性有利于其在大规模生物反应器中的应用。
中国专利ZL200510049189.4和中国专利ZL200510049187.5公开了一种生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306，对该菌株的GAD基因进行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，可实现该基因的可溶表达。但是，该基因表达的GAD比活力不高，不利于该酶在GABA生物制备中的应用。
发明内容
本发明提供了一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体，该方法可有效提高突变的概率，节省时间，提高实验效率，采用该方法获得的突变体具有较高的酶活，可显著提高反应速率。
一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，包括：
(1)构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；
(2)针对所述处于构象不合理区的氨基酸残基位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(3)从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。
其中，具体地，构建谷氨酸脱羧酶三维结构模型的程序为MODELLER和Swiss Model；进行二面角合理性评价的程序为PROCHECK。
该方法通过MODELLER和Swiss Model两个程序构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，再利用PROCHECK程序进行该酶的二面角合理性评价，生成拉氏图(Ramachandran Plot)，拉氏图中的每个区域的颜色从深到浅排列的次序依次为最佳合理区、额外合理区、一般合理区和不合理区，从不合理区中找到构象不合理的氨基酸残基位点。
具体地，所述谷氨酸脱羧酶为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306的谷氨酸脱羧酶GAD1407。该谷氨酸脱羧酶GAD1407在拉氏图中处于构象不合理区的氨基酸残基位点为413位点，该位点的氨基酸为赖氨酸。
本发明采用上述方法得到了一个谷氨酸脱羧酶突变体，该突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。该突变体的编码基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明通过对谷氨酸脱羧酶GAD1407基因中对应413氨基酸残基位点的碱基进行定点突变将原编码赖氨酸的碱基序列AAA替换为ATT，编码的氨基酸为异亮氨酸，获得PCR扩增片段，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变的菌株文库，然后，将该文库中的菌株进行谷氨酸脱羧酶的表达与纯化，获得的突变酶分别置于20℃和55℃条件下处理，将55℃处理后的比活力对比20℃处理后的比活力，得到残余活力比值，将突变酶的该比值与野生型酶的残余活力比值进行比较筛选出活力高的突变酶，即谷氨酸脱羧酶突变体K413I。
本发明还提供了一种包含所述编码基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒以及转化子。
表达单元的启动子可以为常用的T7启动子、Iac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，谷氨酸脱羧酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。
本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法通过拉氏图提供的结构信息对酶进行理性设计，并结合定点突变技术，有效提高突变概率，节省时间，提高实验效率，并筛选得到催化活力优于野生型酶的突变酶，该突变酶的比活力是野生型酶的1.6倍，可提高催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的反应速率，有利于GABA的工业化生产，利于广泛推广。
附图说明
图1为质粒pET28a(+)-gad的基因图谱；
图2为MODELLER(左)和Swiss Model(右)模建结果的拉氏图；
图3为突变位点K413在GAD三级结构中的位置图(以球表示)；
图4为定点突变原理示意图；
图5为野生型GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱；
图6为突变酶和野生型GAD在pH4.8条件下的比活力。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实例进行具体说明：
本发明研究的基础是来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306中的GAD基因。其中短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306已在中国专利申请200510049189.4和中国专利申请200510049187.5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)。本申请使用的菌株由浙江大学馈赠。
表达宿主菌E.coli BL21(DE3)为浙江大学生物工程研究所保藏；pET28a(+)-GAD1407重组质粒由浙江大学保存；Fast Digest Dpn I限制酶、Easy Pfu DNA聚合酶购自FermentasInternational Inc.Canada；Fast Pfu DNA聚合酶、Ni-NTA agarose层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA Marker、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。种子培养基为LB培养基，表达培养基为TB培养基，均含有50μg/mL卡那霉素。
本发明通过MODELLER和Swiss Model构建GAD的三维结构模型，利用PROCHECK程序进行二面角合理性的评价，生成拉氏图(Ramachandran Plot)(如图2所示)。根据拉氏图氨基酸残基位点K413位于构象不合理区(如图3所示)，采用定点PCR方法对GAD基因K413位点进行定点突变，获得一种谷氨酸脱羧酶活力提高的突变体。定点突变原理的示意图，如图4所示。该突变体进过测序证实其基因为K413I，其核苷酸序列在第413位密码子处发生突变，由编码赖氨酸(Lys)的密码子AAA突变为编码异亮氨酸(Ile)的密码子ATT。研究发现，此位点密码子突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的比活力有显著增强。
实施例1
一、构建突变文库
根据短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306的谷氨酸脱羧酶基因设计19对定点突变引物，如下：
K413X_F 5’-CACCTATCCCTTACCAYYYAACATGACGGACCGC-3’
K413X_R 5’-GCGGTCCGTCATGTTYYYTGGTAAGGGATAGGTG-3’
注：其中X代表除赖氨酸外的其余19种氨基酸，YYY代表氨基酸X对应的密码子。
其中，扩增获得K413I的引物为：
上游引物：5’-CACCTATCCCTTACCAATTAACATGACGGACCGC-3’
下游引物：5’-GCGGTCCGTCATGTTAATTGGTAAGGGATAGGTG-3’
以含有GAD1407基因(Gene ID：4412752)的质粒为模板，进行定点PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，包含：10μL 5×PCR缓冲液，4μL dNTPs(2.5mmol/L)，1μL上游引物(10mmol/L)，1μL下游引物(10mmol/L)，1μL质粒模板(50ng/μL)，Fast Pfu DNA聚合酶5U，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。
PCR扩增程序为：94℃变性5min后，进入扩增循环，即94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，共循环30次，最后再72℃延伸4min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。
所得定点PCR产物经Dpn I消化0.5h，然后采用PCR产物纯化试剂盒纯化回收，纯化后按10％比例(体积比)用热激法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基中，于37℃培养12小时。
二、突变酶和野生型GAD的表达和纯化
从定点突变文库中随机挑取1-3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至生工生物工程(上海)股份有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变。将引入预期突变的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中，挑取单菌落接种至加有5mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以2％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的100mL的TB培养基(胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、甘油4mL/L、KH2PO417mmol/L、K2HPO4 72mmol/L)中，37℃，180r/min培养至OD600值为0.6～0.8时，加入适量体积的IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，然后在25℃，150r/min条件下诱导培养8h后收集菌体。
诱导结束后，4℃下4000×g离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀，用pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后，用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300W，工作3s，间隙6s)，在4℃、12000×g的条件下于离心30min，收集上清液，即得到含有GAD的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
所用缓冲液配制如下：
破胞缓冲液(disruption buffer)：2mmol/L磷酸二氢钾、10mmol/L磷酸氢二钠、2.7mmol/LKCl、lmmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、137mmol/LNaCl、pH7.4。
洗柱缓冲液(wash buffer)：20mmol/LTris-HCl、500mmol/LNaCl、40mmol/L咪唑，pH7.8。
洗脱缓冲液(elution buffer)：20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl、400mmol/L咪唑，pH7.8。
三、突变酶比活力的测定
取15μL纯酶，加入于48℃预热的400μL底物溶液(pH4.8，0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，含0.01mmol/L PLP，100mmol/L底物L-MSG)，迅速混匀后在48℃反应10min，反应结束后迅速放入沸水浴中10min以终止反应，离心，收集上清液，采用高效液相色谱(HPLC)法测定反应生成的GABA的量，以测定突变酶K413I的比活力。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为对照。
在采用HPLC法测定前需要对样品进行柱前衍生化处理，衍生化方法为：100μL反应液加100μL 0.5mol/L碳酸氢钠溶液，调节pH＞7.5，混匀后加入200μL的丹磺酰氯丙酮溶液(4g/L，约15mmol/L)，于40℃下避光衍生2小时以上，衍生后的样品经0.22μm微孔滤膜过滤后进样。
HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2C18(250mm×4.6mm)(伊利特公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10μL，控制柱温25℃，流动相A为甲醇，流动相B为：四氢呋喃∶甲醇∶0.05mol/L醋酸钠(pH6.2)(5∶75∶420，V/V/V)。梯度洗脱程序见表1：
表1HPLC梯度洗脱程序
结果如图6所示，在同样的处理条件下，突变酶K413I与野生型酶相比，在该酶的最适反应条件下比野生型酶具有更高的比活力，这一特性将有利于GAD在GABA大规模生物制备中的应用。
四、突变酶动力学参数测定
测定在不同底物浓度(L-MSG 1～100mmol/L)下的反应初速度。根据米氏方程，以1/[S]对1/[V]作图，计算相应的Km和Vmax值。然后根据kcat＝Vmax/[E0]，[E0]为酶初始浓度，单位μmol/L，计算求得kcat。计算结果见表2。
表2野生型GAD和突变酶K413I的酶学参数
Km(mM) kcat(s-1) kcat/Km(s-1*mM-1)
WT 23.99±0.69 19.13±0.63 0.79±0.01
K413I 25.24±1.09 30.85±0.28 1.22±0.03
Km代表酶与底物的亲和力大小。
kcat指转换数或催化常数，表示当酶被底物饱和时，每分子酶或每个酶活性中心每秒钟转换底物的分子数。kcat越大，酶的催化效率越高。
kcat/Km是酶与底物反应生成产物的表观二级速率常数，其大小可用于比较酶催化效率。
由上表可见，突变酶K413I与野生型GAD的Km值相差不大，表明突变酶K413I的专一性没有发生太大改变，但是突变酶K413I的kcat和kcat/Km值大小约为野生型GAD的1.6倍，表明突变酶的催化效率大于野生型GAD，突变酶K413I的催化活力也大大提高，这对于利用GAD进行GABA的生物制备是非常有利的，是本发明的显著实质性贡献。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：
(1)构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；
(2)针对所述处于构象不合理区的氨基酸残基位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(3)从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306的谷氨酸脱羧酶GAD1407。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，构建谷氨酸脱羧酶三维结构模型的程序为MODELLER和Swiss Model。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，进行二面角合理性评价的程序为PROCHECK。
5.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求5所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因，其特征在于，碱基序列如SEQID NO.1所示。
7.一种包含权利要求6所述的编码基因的谷氨酸脱羧酶表达单元。
8.一种包含权利要求6所述的编码基因的重组质粒。
9.一种包含权利要求6所述的编码基因的转化子。
10.如权利要求5所述的谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸中的应用。
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