CN102911927B - 一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶及其用途，该谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了一种编码该谷氨酸脱羧酶的基因及含有该基因的表达单元、重组载体和转化子。本发明又公开该谷氨酸脱羧酶在生产γ-氨基丁酸中的应用。本发明谷氨酸脱羧酶的催化速率是野生型谷氨酸脱羧酶的2.5倍，能高效合成GABA，为利用谷氨酸脱羧酶进行γ-氨基丁酸的生物制备创造了更有利的条件。

Description

一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种谷氨酸脱羧酶及其编码基因和用途。

背景技术

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase，简称GAD；EC4.1.1.15)是一种广泛地存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的α-羧基脱羧反应生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，简称GABA)。GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统的一种关键的抑制性神经递质，约50％的中枢神经突触部位以GABA为递质，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生理功能。由于身心紧张会导致人体血压升高、免疫功能失调、代谢紊乱，因此GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压、改善免疫功能、延缓衰老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为“新资源食品”。

GABA虽然在生物体内广泛存在，但含量却很低，难以进行分离，需要对其进行合成制备。目前合成GABA的方法主要是化学合成法和生物合成法。与化学合成相比，生物合成GABA主要是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶作为催化剂，以L-谷氨酸钠为底物生产GABA。该法的优点在于合成条件温和，不需要昂贵的原材料，能耗小，污染小。因此，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的生物制备正得到越来越多的重视。

中国专利申请200510049189.4和中国专利申请200510049187.5公开了一种生产γ-氨基丁酸的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCCNO.1306，该菌株具有高效生物合成GABA的能力，对该菌株的gad基因进行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，可实现可溶表达。但是，该基因表达的GAD的催化活力不高，不利于该酶在GABA生物制备中的广泛应用。

在工业生产中，往往希望提高反应速率，从而提高生物催化与转化的效率。GAD作为生物技术富集生产GABA的关键酶，提高其催化活性有利于其在大规模生物反应器中的应用。1989年，Leung等首次提出了一种能够简便、快速地在DNA序列中制造随机突变的方法：易错PCR(error-prone PCR)。其基本原理是利用在PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因随机诱变的技术。它是研究蛋白质结构与功能之间的复杂关系的有力工具，也是在实验室中改造基因的常用手段。

发明内容

本发明提供了一种谷氨酸脱羧酶，该酶具有高于野生型谷氨酸脱羧酶的酶活力，能高效催化合成γ-氨基丁酸。

一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种编码所述谷氨酸脱羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述基因为Q51H，该基因第51位编码谷氨酰胺(Gln)的密码子CAA突变为编码组氨酸(His)的密码子CAT(Gln⁵¹→His)。

本发明还提供了含有所述基因的表达单元、重组载体或转化子。

所述表达单元的启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这些启动子的作用下，谷氨酸脱羧酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。

所述重组载体的原始载体为pET-28a(+)。

本发明还提供了所述谷氨酸脱羧酶在生产γ-氨基丁酸上的应用。该酶具有高于野生型谷氨酸脱羧酶的酶活力，以该酶为催化剂，可将底物(L-谷氨酸钠或其盐)高效转化为γ-氨基丁酸。

所述谷氨酸脱羧酶的制备方法为：

(1)以gad基因为模板，进行易错PCR扩增，将PCR产物转入感受态细胞，构建突变文库；

(2)利用诱导物诱导突变文库表达，获得表达文库；

(3)对表达文库进行酶活分析和序列测定，筛选目的突变基因；

(4)构建含有目的突变基因的重组工程菌，诱导培养后对获得的粗酶液进行分离纯化，得到谷氨酸脱羧酶。

所述gad基因来自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。该菌株已在中国专利申请200510049189.4和中国专利申请200510049187.5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微生物保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，本发明使用的菌株由浙江大学馈赠。

所述易错PCR扩增所使用的引物为：

上游引物：5’-GGGGATCCATGGCTATGTTATATGGTAAAC-3’；

下游引物：5’-GGGAATTCTTAGTGAGTGAATCCGTATTT-3’。

所述易错PCR扩增体系为50μL，其中：5μL 10x易错PCR缓冲液，14μLMg²⁺(25mmol·L^-1)，4μL dNTP(2.5mmol·L^-1dGTP、2.5mmol·L^-1dATP、2.5mmol·L^-1dCTP和2.5mmol·L^-1dTTP混合物)，1μL上游引物(10pmol·μL^-1)，1μL下游引物(10pmol·μL^-1)，3μL 5mmol·L^-1MnCl₂，1μL质粒模板(10pmol·L^-1)，5U Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水补至为50μL。

所述易错PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。

易错PCR是在进行目的基因扩增的同时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTPs浓度或运用低保真度的DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

含易错PCR产物的重组载体转入感受态细胞后，在未加诱导物的情况下，细胞内的外源基因很难获得高效表达。IPTG可以作为具有lacZ或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。IPTG普遍用于原核表达系统，诱导外源基因表达，使其表达量增高，产物稳定，具有易鉴定、易纯化的优点。

本发明采用的高通量筛选技术是以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，以微孔板作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集试验结果，以计算机分析处理试验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转。具有微量、快速、灵敏和准确等特点。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的谷氨酸脱羧酶具有高于野生型谷氨酸脱羧酶的酶活力，其催化底物L-谷氨酸钠转化为产物γ-氨基丁酸(GABA)的速率是野生型谷氨酸脱羧酶的2.5倍，更有利于利用谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备。

附图说明

图1为易错PCR构建突变文库原理示意图。

图2为突变位点Gln⁵¹在GAD三级结构中的位置图(以球表示)。

图3为粒pET28a(+)-gad的基因图谱。

图4为易错PCR产物及pET-28a(+)载体经酶切纯化后的凝胶电泳图谱。

图5为变体酶和野生型GAD在pH 4.8条件下的比活力。

图6为变体酶和野生型GAD在不同pH条件下的比活力。

具体实施方式

为进一步说明本发明，结合以下实例具体说明：一、构建突变文库

突变文库构建原理如图1所示，突变针对的突变位点Gln⁵¹在GAD三级结构中的位置如图2所示，所用模板为质粒pET28a(+)-gad，其基因图谱如图3所示。

根据短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC NO.1306的谷氨酸脱羧酶基因设计引物：

上游引物：5’-GGGGATCCATGGCTATGTTATATGGTAAAC-3’(下划线处为BamHI的酶切位点)；

下游引物：5’-GGGAATTCTTAGTGAGTGAATCCGTATTT-3’(下划线处为EcoRI的酶切位点)。

以含有GAD1407基因(Gene ID：4412752)的质粒为模板，进行易错PCR扩增。PCR扩增体系为50μL，其中：5μL 10x易错PCR缓冲液，14μLMg²⁺(25mmol·L^-1)，4μL dNTP(2.5mmol·L^-1dGTP、2.5mmol·L^-1dATP、2.5mmol·L^-1dCTP和2.5mmol·L^-1dTTP混合物)，1μL上游引物(10pmol·μL^-1)，1μL下游引物(10pmol·μL^-1)，3μL 5mmol·L^-1MnCl₂，1μL质粒模板(10pmol·L^-1)，5U Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水补至50μL。

PCR扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30次循环，最后再72℃延伸5min。PCR产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。

将易错PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。纯化后的易错PCR产物用限制性内切酶BamHI、EcoRI和DpnI于37℃进行酶切。酶切条件为：DNA 40μL、10×green buffer 10μL、BamHI 2.5μL、EcoRI 2.5μL、DpnI 1μL、ddH₂O 44μL，37℃酶切30 min。酶切后的PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

pET-28a(+)用限制性内切酶BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切条件为：DNA 80μL、10×green buffer 10μL、BamHI 2.5μL、EcoRI 2.5μL、ddH₂O 5μL，37℃酶切30min。经酶切后的pET-28a(+)进行电泳纯化并回收。

回收产物通过凝胶电泳验证，其电泳结果如图4所示。

经酶切、纯化后的PCR产物与pET-28a(+)连接。连接条件为：10×T4 buffer 2μL、酶切后的PCR产物8μL、酶切后的质粒载体9μL、T4连接酶1μL，连接温度为22℃，连接25min。采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌BL21(λDE3)感受态细胞(氯化钙法)中。转化产物涂布于含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养14h。

二、GAD1407突变体的诱导表达

通过易错PCR方法构建的突变体，采用96微孔板进行表达。将LB固体培养基平板上的单菌落逐个挑到每孔含有600μL LB培养基(含50mg·L^-1Kanamycin)的96孔板(种子板)中，于37℃、200r·min^-1培养过夜。培养好的菌液按每孔10％的接种量，接种到新的每孔含有900μL TB培养基(含50mg·L^-1Kanamycin)的96孔板(表达板)中。同时，种子板中每个孔加入100μL 50％的甘油，-80℃保存。表达板于37℃，200r·min^-1摇床中进行培养，待每个孔中菌液的OD₆₀₀达到0.6左右时，每孔加入2μL 0.5mg·L^-1的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导。诱导8h后，4℃下，4100r·min^-1离心10min，弃上清液，再用PBS缓冲液洗涤2次，相同条件离心收集菌体。

三、突变文库的筛选

收集好的菌体放入-80℃冰箱过夜，然后每个孔加入150μL的裂解液(PBS缓冲液(pH 7.4)、lysozyme 0.5mg·mL^-1、DNase I2 U·mL^-1)，于37℃反应约30min，4500r·min^-1离心10min，收集上清液用于测定其反应活性，最终筛选得到反应活性最高上清液所对应的菌株，命名为Q51H株。

菌株筛选采用郁凯等在文献(A high-throughput colorimetric assay tomeasure the activity of glutamate decarboxylase，Enzyme and MicrobialTechnology，2011，49：272-276)中公开的高通量筛选方法。

四、对筛选得到的突变体基因进行测序

将步骤(三)获得的Q51H菌株于37℃，200 r·min^-1培养过夜。收集菌体并按常规的碱裂解方法提取质粒。提取得到的质粒送往上海生工进行测序，获得质粒中的突变基因Q51H的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，推导其编码的酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

五、变体酶Q51H和野生型GAD的表达和纯化

分别将含有Q51H突变基因和野生型gad基因的重组工程菌接种到20mL含有50μg/·mL^-1卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，180r·min^-1振荡过夜培养；以1％的接种量接种到含有50μg·mL^-1卡那霉素的100mL TB液体培养基(胰蛋白胨12g·L^-1、酵母提取物24g·L^-1、甘油4ml·L^-1、KH₂PO₄ 17mmol·L^-1、K₂HPO₄ 72mmol·L^-1)中，37℃，180 r·min^-1培养至OD₆₀₀为0.6～0.8；加入IPTG(终浓度为0.5mmol·L^-1)，25℃，150r·min^-1继续诱导8h。诱导结束后，4℃下4000×g离心10min，收集菌体沉淀。用pH 7.4的磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次(300W，工作3s，间隙6s)，12000×g离心10min收集上清，即得到含有GAD的粗酶液。

采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样(loading)、清洗(washing)和洗脱(eluting)，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。

所用缓冲液配制如下：

裂解缓冲液(disruption buffer)：2mmol·L^-1磷酸二氢钾、10mmol·L^-1磷酸氢二钠、2.7mmol·L^-1KCl、1mmol·L^-1苯甲基磺酰氟(PMSF)、137mmol·L^-1NaCl，pH 7.4。

洗柱缓冲液(wash buffer)：20mmol·L^-1Tris-Hcl、500mmol·L^-1NaCl、40mmol·L^-1咪唑，pH 7.8。

洗脱缓冲液(elution buffer)：20mmol·L^-1Tris-Hcl、500mmol·L^-1NaCl、400mmol·L^-1咪唑，pH 7.8。

五、变体酶催化活力的测定

取10μL纯酶，加入于48℃预热的400μL底物溶液(pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，0.1mol·L^-1柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，含0.01mmol·L^-1PLP，50mmol·L^-1底物L-MSG)，迅速混匀后在48℃反应10min，反应结束后迅速放入沸水中水浴10min以终止反应，离心，收集上清液，采用高效液相色谱法测定反应生成的GABA的量，以测定变体酶Q51H的比活力。在同样条件下，以野生型GAD的反应作为对照。

在采用HPLC法测定前需要对样品进行柱前衍生化处理。衍生化方法为：100μL反应液加100μL 0.5mol·L^-1碳酸氢钠溶液，调节pH＞7.5，混匀后加入200μL的丹磺酰氯丙酮溶液(4g/L，约15mmol·L^-1)，于40℃下避光衍生1h以上。衍生后的样品经0.22μm微孔滤膜过滤后进样。

HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18(250mm×4.6mm)(Thermo公司)，紫外检测波长为254nm，进样量为10μL，控制柱温25℃，流动相A为甲醇，流动相B为四氢呋喃∶甲醇∶醋酸钠(0.05 mol·L^-1，pH 6.2)(5∶75∶420，V/V/V)。梯度洗脱程序见表1。

表1 HPLC梯度洗脱程序

T/min	0	5	20	21	27	28	30
								A％	20	20	50	100	100	20	20
B％	80	80	50	0	0	80	80

由图5和图6可见，在同样的处理条件下，变体酶Q51H的比活力高于野生型GAD的比活力。其原因有可能是Q51H突变提高了酶的催化活力，也可能是该突变促进了酶的可溶表达。虽然具体原因有待通过测定野生酶和突变酶的催化反应动力学数据才能确定，但无论是何种原因，突变酶比活力的提高对于GAD在GABA大规模生物制备中的应用都是有利的。

六、变体酶动力学参数测定

测定在不同底物浓度(L-MSG，1～100mmol·L^-1)下的反应初速度。根据米氏方程，以1/[S]对1/[V]作图，计算相应的K_m和V_max值。然后根据K_cat＝V_max[E₀]，[E₀]为酶初始浓度，单位为μmol/L，计算求得K_cat。计算结果见表2。

表2野生型GAD与突变酶Q51H的酶学参数

K_m代表酶与底物的亲和力大小。

K_cat指转换数或催化常数，表示当酶被底物饱和时，每分子酶或每个酶活性中心每秒钟转换底物的分子数。K_cat值越大，酶的催化效率越高。

K_cat/K_m是酶与底物反应生成产物的表观二级速率常数，其大小可用于比较酶的催化效率。

由上表可见，突变酶Q51H与野生型GAD的K_m值相差不大，表明突变酶Q51H的专一性没有改变；但突变酶Q51H的K_cat值和K_cat/K_m值均大约为野生型GAD的2.5倍，表明突变酶Q51H的催化效率大于野生型GAD，突变酶Q51H的催化活力大大提高了。这对于利用GAD进行GABA的生物制备是非常有利的，是本发明的显著实质性贡献。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种编码如权利要求1所述谷氨酸脱羧酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有如权利要求2所述基因的表达单元。

4.如权利要求3所述的表达单元，其特征在于，启动子为T7启动子、lac启动子或araBAD启动子。

5.一种含有如权利要求2所述基因的重组载体。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，原始载体为pET-28a(+)。

7.一种含有如权利要求2所述基因的转化子。

8.如权利要求1所述谷氨酸脱羧酶在生产γ-氨基丁酸中的应用。

Images