CN103773731A

CN103773731A - 一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法

Info

Publication number: CN103773731A
Application number: CN201410005648.8A
Authority: CN
Inventors: 梅乐和; 赵伟睿; 黄�俊; 胡升; 雷引林; 金志华; 姚善泾
Original assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Current assignee: Ningbo Institute of Technology of ZJU
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明公开了一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，包括：将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种至培养基中，振荡培养，获得种子液；将种子液接种至培养基中，振荡培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，加入诱导剂的同时向培养基中加入细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂来干扰重组菌细胞壁或（和）细胞膜的合成，达到增强菌体通透性、提高菌体表观催化活力的目的；诱导培养结束后收集菌体，即得到表观催化活力提高的谷氨酸脱羧酶重组工程菌。本发明避免了常规菌体培养后再进行透性化处理所需的多步工艺步骤，为改善高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力提供一种简便、高效和低成本的方法。

Description

一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法。

技术背景

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有降血压、利尿、抗惊厥、预防癫痫、改善睡眠、抗抑郁、促进激素分泌和保肝利肾等多种生理功能。此外，GABA可作为前体物质用于合成生物可降解材料聚酰胺-4和环境有好的塑料溶剂N-吡咯烷酮等化工产品。因此，GABA在食品、医药和化工领域有着广阔的应用价值。

制备GABA的方法主要是化学合成法和生物合成法两大类，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法两种。生物法合成GABA是利用生物体内的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)作为催化剂，将L-谷氨酸或钠盐α-脱羧生成GABA。化学合成法普遍受到反应条件苛刻、原料成本高和产品安全性问题的制约。生物法制备GABA具有原料来源丰富、过程简单、转化效率高，条件温和以及环境友好优点，因而更具有商业化开发前景。

微生物GAD是胞内酶，需要经过细胞破碎、提取与纯化才能获得高活力的GAD制剂。而在破胞、提取与纯化过程中，都不避免的导致酶蛋白的损失，这无疑会导致生产成本的增加，同时提取与纯化步骤复杂、耗费巨大。利用微生物细胞制备GABA，可以省去提取和纯化酶的冗长工序和时间的耗费，大大降低成本。目前国内外学者已经筛选出许多具有GAD活性的菌株用于GABA的制备。但是如何有效提高细胞催化活力、降低生产成本仍然是工业化制备GABA所研究的热点。通过基因工程技术，将GAD基因在大肠杆菌中进行表达，可以有效提高菌体的催化活性。但是由于菌体细胞壁及细胞膜的屏障作用限制了底物及产物在细胞内外的交换，使菌体胞内的GAD活力难以充分发挥，严重了影响了工程菌的表观催化活力，使底物转化速率降低。因此，有效改善细胞壁和细胞膜对底物的传质阻力来提高GAD工程菌的表观催化活力对于制备GABA具有重要意义。

细胞透性化技术（cell permeabilization）可以在不造成细胞裂解以及不破坏细胞内部结构的情况下改善细胞的通透性，使得小分子物质和一些较大分子物质能够自由地进出细胞，从而提高菌体的表观催化活力。将培养好的细胞用有机溶剂或者表面活性剂等透性化试剂或者超声、冻融等物理方法进行处理，虽然可以有效提高菌体表观催化活力，但是对培养好的细胞进行处理，无疑会增加多步工艺步骤，增加生产成本，对于规模化生产尤为不利。例如利有机溶剂对培养好的细胞进行透性化处理的典型步骤包括，菌体收集，菌体清洗，透性化试剂处理，透性化试剂的去除和菌体回收等。

发明内容

本发明提供了一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，实现谷氨酸脱羧酶工程菌培养与透性化处理过程的耦合，避免了常规菌体培养后在进行透性化处理的多步工艺步骤，为改善高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力提供一种简便和低投入方法。

一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，包括：

（1）将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种至培养基中，振荡培养，获得种子液；

（2）将种子液接种至培养基中，振荡培养至OD为0.6～0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，加入诱导剂的同时向培养基中加入细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂；

其中，所述的谷氨酸脱羧酶工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的谷氨酸脱羧酶基因，所述的宿主细胞为大肠杆菌；

（3）诱导培养结束后收集菌体，即得到表观催化活力提高的谷氨酸脱羧酶重组工程菌。

本发明将谷氨酸脱羧酶工程菌培养与透性化处理过程相耦合，在谷氨酸脱羧酶重组工程菌的诱导培养过程中加入细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂，干扰细胞壁的合成，改善菌体细胞壁和细胞膜对催化反应中底物和产物的传质限制，另外，细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂与诱导剂的加入时间相同：菌液的OD为0.6～0.8，此时，细菌处于对数生长期，细菌最活跃，生长旺盛且繁殖速度快，可达到较好的处理效果，且此时细菌对外界环境的敏感程度低，可降低表达产物、细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂对细胞的伤害作用，避免细胞死亡或生长停滞。

所述的谷氨酸脱羧酶工程菌通过常规的基因工程技术得到，一般先将谷氨酸脱羧酶基因连入表达载体，构建得到重组表达载体，再将重组表达载体转入宿主细胞中。其中，表达载体可以为pET-28a、pET-29、pET-30、pET-34等非氨苄青霉素抗性的表达载体。

本申请中，所述的宿主细胞为大肠杆菌，具体可以为（E.coli）BL21、大肠杆菌（E.coli）BLR、大肠杆菌（E.coli）Origami、大肠杆菌（E.coli）NovaBlue或大肠杆菌（E.coli）Rosetta等。

所述的谷氨酸脱羧酶基因具体可源自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），唾液链球菌（Streptococcus salivarius）和大肠杆菌等。

在谷氨酸脱羧酶重组工程菌诱导培养过程中的某些培养条件可参照常规的选择，如所述种子液的接种量为1～2%；步骤（1）和（2）中，所述振荡培养的温度为35～38℃，转速为200-220rpm；步骤（1）中，振荡培养的时间为12～16小时。

所述的诱导剂根据重组载体上的启动子相应的选择。

所述诱导培养的温度为20～30℃，转速为100～150rpm，时间为6～12h，优选的，所述诱导培养的温度为30℃，转速为150rpm，时间为6h。

所述的细胞壁合成抑制剂具体可以为氨苄青霉素。

所述的表面活性剂具体可以为十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。

所述细胞壁合成抑制剂或者细胞壁干扰剂的终浓度为1～10μg/ml，优选为2～10μg/ml。适宜剂量的细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂可达到理想的实验效果，终浓度过低，达不到透性化改造的目的，终浓度过高则可能导致细胞死亡或生长停滞。其中，氨苄青霉素的终浓度为2～7μg/ml，CTAB的终浓度为3～10μg/ml；优选的，氨苄青霉素的终浓度为3～5μg/ml，CTAB的终浓度为5～10μg/ml，。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明通过在GAD重组工程菌培养过程中加入细胞壁合成抑制剂或者干扰剂来提高重组谷氨酸脱羧酶工程菌细胞被膜的通透性，实现谷氨酸脱羧酶工程菌培养与透性化处理的耦合，可以在不需要对培养好的细胞进行后续透性化处理的情况下减小菌体细胞壁和细胞膜对底物和产物的传质限制，充分发挥菌体细胞内GAD的催化活力，提高工程菌的表观GAD催化活力。本发明可避免后续透性化处理细胞的步骤及相关设备运转的投入，为制备高GAD活性的菌体催化剂提供了一个简便方法。

（2）GAD重组工程菌在提高透性的同时，由于细胞整体结构完整，对胞内酶具有较好的保护作用，不仅可以充分发挥酶的催化活力，还延长了酶的使用寿命。此外，透性化GAD细胞可以看作是一种不溶性GAD酶源，可以用已知的各种固定化对透性化GAD工程菌细胞进行固定化，以适应特定生产过程的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。

菌种：E.coliBL21(DE3)/pET28a-gadB表达重组大肠杆菌（可参见“Cloning,sequencing and expression of a glutamate decarboxylase gene fromthe GABA-producing strain Lactobacillus brevis CGMCC1306[J].ANNALSOF MICROBIOLOGY.2012,62(2):689-698”），该表达重组大肠杆菌包含有来自保藏编号为CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的谷氨酸脱羧酶基因（gadB）。

LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L。

一个酶活力单位定义为在37℃条件下，1min生成1μmol GABA所需要的酶量（1U=1μmol GABA in1min at37℃）。GAD的比活力定义为每毫克干重细胞所具备的酶活力单位（U·mg-1cells，dry weight）。

实施例1

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，获得种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为3μg·mL^-1的氨苄青霉素，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加氨苄青霉素的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力为1.34U/mg。与相同培养条件下不加氨苄青霉素的培养的菌体相比，菌体表观催化活力提高2.35倍。

实施例2

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，获得种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为5μg·mL^-1的氨苄青霉素，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加氨苄青霉素的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力为3.55U/mg。与相同培养条件下不加氨苄青霉素的培养的菌体相比，菌体表观催化活力提高6.23倍。

实施例3

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为10μg·mL^-1的CTAB，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加CTAB的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力1.40U/mg。与相同培养条件下，不加CTAB的菌体相比，菌体表观催化活力提高2.46倍。

实施例4

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为5μg·mL^-1的CTAB，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加CTAB的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力0.74U/mg。与相同培养条件下，不加CTAB的菌体相比，菌体表观催化活力提高1.3倍。

对比例1

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为5-10μg·mL^-1的十二烷基磺酸钠，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加十二烷基磺酸钠的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力0.42-0.48U/mg。与相同培养条件下，不加十二烷基磺酸钠的菌体相比（0.57U/mg），菌体表观催化活力略有下降。

对比例2

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为0.1%-1%的吐温80，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不加吐温80的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力0.46-0.57U/mg。与相同培养条件下，不加吐温80的菌体相比（0.57U/mg），菌体表观催化活力没有明显变化。

对比例3

从活化的LB固体培养基上挑取单克隆菌体接入5mL含卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜，得到种子液。将种子液按体积分数1%接种量接种到含有卡那霉素（50μg·mL^-1）的LB培养基，置于37℃，200r/min培养至OD₆₀₀ 0.6-0.8时加入IPTG，使IPTG终浓度为0.5μM，同时加入终浓度为0.1%-1%的司班80，30℃，150r/min诱导培养6h。同时以不添加司班80的培养的菌体作为空白对照。

培养结束后，取一定量菌液于4℃，10000g离心5min收集菌体，用200mM醋酸缓冲液（pH4.8）清洗菌体1次，测定菌体表观催化活力0.48-0.60U/mg。与相同培养条件下，不加司班80的菌体相比（0.57U/mg），菌体表观催化活力没有明显变化。

Claims

1.一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌（E.coli）BL21、大肠杆菌（E.coli）BLR、大肠杆菌（E.coli）Origami、大肠杆菌（E.coli）NovaBlue或大肠杆菌（E.coli）Rosetta。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达载体不带有氨苄青霉素抗性基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为pET-28a、pET-29、pET-30或pET-34。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂的终浓度为1～10μg/ml。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞壁合成抑制剂为氨苄青霉素。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述氨苄青霉素的终浓度为2～7μg/ml。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述十六烷基三甲基溴化铵的终浓度为3～10μg/ml。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为20～30℃，时间为6～12h。