CN102604899A - 一种包含l-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用。该菌株包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。本发明的基因工程菌可以通过消旋L-丙氨酸生产DL-丙氨酸，且用量少、反应时间短、可以多批次重复利用，通过本发明的基因工程菌，消旋过程的转化率达到99.0％以上，产品纯度达到99.5％以上，具有良好的产业化前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种包含L-丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌及其应用。
背景技术
随着L-丙氨酸生产工艺的日臻成熟，利用L-丙氨酸生产高附加值衍生产品的需求与日俱增，其中DL-丙氨酸的高效和绿色生产工艺正得到业界的重视。DL-丙氨酸是L-丙氨酸的结构消旋物，其化学名称是DL-α-氨基丙酸(简称丙氨酸)，分子式为CH3CH(NH2)COOH，成品是无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末，有较强的甜味，易溶于水、无旋光性。
DL-丙氨酸的用途广泛。目前主要用作食品工业中的营养强化剂和调味品，同时也是一种非常重要的医药中间体和维生素B6的生产原料，此外还可以用于新型农药的合成等技术领域。在国外，DL-丙氨酸已经产业化，其年需求量很大，且增长迅速；当今的主要生产国为日本，主要生产企业有武藏野化学株式会社和味之素公司等。在我国，DL-丙氨酸的生产基本采用化学合成法，例如Strecker法、Buchere法、α-卤代羧酸氨化法、相转移催化合成法以及L-丙氨酸化学消旋法等。但这些合成方法成本偏高，而且使用了如氰化物、甲醇、氯仿等人体危害物、副产物分离也十分困难；与此同时还暴露出合成路线长、收率低、“三废”问题严重等缺陷。
在提倡低碳经济的新政策背景下，利用生物法生产DL-丙氨酸的工艺在近年来得到了学者们的研究。其中以L-丙氨酸为原料、以从自然界中筛选得到的含有L-丙氨酸消旋酶的微生物作为生物催化体，消旋L-丙氨酸生产DL-丙氨酸的工艺逐步崭露头角；该方法所需的微生物培养成本低廉、反应条件温和、生产工艺清洁，因而具有良好的应用前景。当前国内仅有安徽华恒生物工程有限公司和淮北新旗氨基酸有限公司通过此法生产DL-丙氨酸。
随着基因工程技术的迅速发展，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高某种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有普通微生物难以企及的酶催化效率；利用基因工程菌株生产DL-丙氨酸的工艺在国内尚没有报道，本发明选择一株从自然界筛选得到的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921(中国发明专利号ZL200910025982，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏号No.2921)作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了L-丙氨酸消旋酶的编码基因(alr基因)，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效表达L-丙氨酸消旋酶的基因工程菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单、条件温和，能大幅度降低生产成本的基因工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题，是提供上述基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种L-丙氨酸消旋酶，其特征在于，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
一种权利要求1所述的L-丙氨酸消旋酶的编码基因(alr基因)，其特征在于，它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
一种外源表达L-丙氨酸消旋酶的基因工程菌，它包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
上述基因工程菌的构建方法，它包括以下步骤：
(1)构建含有L-丙氨酸消旋酶基因(alr基因)的表达载体：
提取发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA作为模板，以包含EcoRI和NotI酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：
引物1：5’-GGAATTCATGGTAAGTGCAC-3’(下划线处为EcoRI酶切位点)；
引物2：5’-AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC-3’(下划线处为NotI酶切位点)；
PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 4μL，10×Taq缓冲液(含Mg2+)5μL，Taq酶1μL，ddH2O 34μL；
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后50℃退火1min，72℃延伸1min，循环25次；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-alr。
(3)将重组质粒pET-alr转化至宿主细胞中：
将重组质粒pET-alr转化至感受态大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂，pH 7.0)，37℃培养12～16h得到单克隆；
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：
分别挑取单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/LNaCl，pH 7.0)中，37℃、200rpm培养过夜；提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI酶切；根据电泳结果判断含有与alr基因相同分子量大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-alr，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
上述L-丙氨酸消旋酶的表达方法，将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0)中培养过夜(37℃、200rpm)，然后以0.5～10％(v/v)的接种量转接入发酵培养基中，20～40℃发酵培养1～3h，再加入终浓度0.1～10g/L的乳糖或终浓度0.1～1.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并置于20～40℃下诱导表达3～48h。
其中，所述的发酵培养基，其碳源的是L-丙氨酸，浓度为10～50g/L；氮源是蛋白胨或酵母粉，浓度为5～40g/L；盐离子是七水硫酸镁、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的任意一种或几种的组合，浓度为0.1～10g/L；发酵培养基用氨水或NaOH调整培养基pH值到4～10，经高压湿热灭菌后即可使用。
上述基因工程菌在制备DL-丙氨酸中的应用。
具体的方法是：将L-丙氨酸加入到经过诱导表达的基因工程菌的发酵液中，使得L-丙氨酸终浓度达0.1～20kg/L，维持反应温度4～60℃，反应3～24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为0时，停止反应，加入活性炭在20-80℃脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品。或者，将经过诱导表达的基因工程菌发酵液离心并收集菌体，加入L-丙氨酸水溶液，L-丙氨酸水溶液中L-丙氨酸浓度为0.1～20kg/L，重新悬浮菌体，调整溶液pH值为7～14，维持反应温度4～60℃，反应3～24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为0时，停止反应，离心收集菌体，加活性炭至上清液中，在20-80℃脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品；二次收集的菌体可以重复用于DL-丙氨酸的生产直至酶活性完全丧失。
有益效果：本发明的基因工程菌可以通过消旋L-丙氨酸生产DL-丙氨酸，且用量少、反应时间短、可以多批次重复利用(30个批次内未见转化率明显下降)，通过本发明的基因工程菌，消旋过程的转化率达到99.0％以上，产品纯度达到99.5％以上，具有良好的产业化前景。
附图说明
图1Lactobacillus fermentum CGMCC2921基因组的琼脂糖凝胶电泳图。
图2PCR产物的琼脂糖凝胶电泳验证。
图3pET-28a质粒(Novagen)图谱。
图4重组质粒pET-alr的单-双酶切验证。
图5利用基因工程菌株多批次生产DL-丙氨酸的转化率变化图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921基因组DNA的提取。
按照生产商提供的使用说明书，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大连)抽提处于对数生长期的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA，并用1％(10g/L)琼脂糖凝胶电泳对所获得的基因组DNA进行检测。结果见图1。
实施例2：L-丙氨酸消旋酶基因(alr基因)的克隆和基因工程菌的构建。
2.1L-丙氨酸消旋酶基因(alr基因)的PCR扩增：
根据Genbank上已报道的发酵乳杆菌来源L-丙氨酸消旋酶基因的序列，运用VectorNTI软件设计引物1和引物2，引物序列为：
引物1：5’-GGAATTCATGGTAAGTGCAC-3’(下划线处为EcoRI酶切位点)
引物2：5’-AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC-3’(下划线处为NotI酶切位点)
以实施例1获得的发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。
PCR(聚合酶链式反应)的扩增体系为：基因组DNA2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 4μL，10×Taq缓冲液(含Mg2+)5μL，Taq酶1μL，ddH2O 34μL；
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后50℃退火1min，72℃延伸1min，循环25次；最后72℃延伸10min；
将PCR产物于1％(10g/L)琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图2。发现与预期分子量(1122bp)大小相符的DNA条带后用Axygen公司的柱式割胶回收试剂盒回收。
2.2用于L-丙氨酸消旋酶表达的重组质粒的构建：
利用pET-28a质粒(Novagen)(图3)构建表达载体。
2.2.1限制性酶切反应，纯化及连接反应：
用预先设计在引物序列中酶切位点所对应的限制性内切酶对实施例2.1获得的PCR产物进行酶切反应。本实验中，所用的限制性内切酶是EcoRI和NotI。酶切体系为：PCR产物50μL，EcoRI 2.5μL，NotI 2.5μL，10×缓冲液10μL，ddH2O 35μL，总体积100μL。将酶切后的PCR产物经过DNA纯化试剂盒纯化。
使用同样的限制性内切酶和酶切体系对pET-28a质粒进行酶切，由于所选用的两个酶切位点在pET-28a质粒的多克隆位点(Multiple Cloning Site，MCS)上相距很近(约20bp)，因此酶切之后的质粒只需要经过DNA纯化试剂盒即可达到纯化的目的。
将经过纯化的PCR产物和pET-28a质粒进行连接。连接反应体系为：酶切纯化的PCR产物4μL，酶切纯化的pET-28a质粒4μL，T4连接酶1μL，10×T4连接酶缓冲液1μL。在37℃连接2h后即可获得重组质粒pET-alr。
2.2.2重组质粒pET-alr的转化：
质粒转化感受态大肠杆菌细胞使用氯化钙法。
(1)取10μL重组质粒pET-alr于50μL大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，快速置于冰上2～3min。
(3)加入新鲜LB液体培养基800μL，于37℃振荡培养45min。
(4)取200μL菌体涂布于含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基表面。37℃培养12～16h至单菌落出现。
2.2.3重组子的鉴定：
将单菌落接种于含有卡那霉素(25μg/mL)的LB液体培养基中37℃过夜培养并提取质粒，按照“限制性酶切反应，纯化及连接反应”中的酶切体系和条件分别用EcoRI、NotI和NotI对重组质粒pET-alr进行单-双酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果见图4，实验结果说明获得的重组质粒pET-alr是正确的。
经电泳结果证实，该阳性克隆菌落含有DNA片段插入质粒pET-alr，含此重组质粒pET-alr的重组大肠杆菌即为转化的重组大肠杆菌BL21-alr。测序结果显示插入片段含有一个长1122bp的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)。
实施例3：L-丙氨酸消旋酶的诱导表达。
配制种子液1L，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，用NaOH调节pH值为7.0)，经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL广口三角瓶中。用接种针向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有L-丙氨酸10g/L、蛋白胨(或酵母粉)10g/L、七水硫酸镁0.25g/L、磷酸二氢钠1.5g/L、磷酸氢二钠2g/L的发酵培养基1000mL，用NaOH调节pH值为7.5，分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL；将上述发酵培养基于121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液1mL，将三角瓶置于37℃摇床以200rpm的转速培养，约1.5h后加入终浓度为0.2g/L的乳糖，或者加入终浓度为0.3mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，并置于37℃摇床以200rpm转速进行诱导作用6h。
实施例4：L-丙氨酸消旋酶的诱导表达。
配制种子液1L，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，用NaOH调节pH值为7.0)，经121℃高压湿热灭菌30min后装入数个500mL广口三角瓶中。用接种针向种子液接入一环基因工程菌菌种，并置于37℃摇床以200rpm的转速过夜培养。配制含有L-丙氨酸50g/L、蛋白胨(或酵母粉)40g/L、七水硫酸镁6g/L、磷酸二氢钠2g/L、磷酸氢二钠2g/L的发酵培养基1000mL，用NaOH调节pH值为4，分装于容量500mL的广口三角瓶中，每瓶的装液量为100mL；将上述发酵培养基于121℃高压湿热灭菌30min。待培养基冷却后接入过夜培养的种子液1mL，将三角瓶置于20℃摇床以200rpm的转速培养，约3h后加入终浓度为10g/L的乳糖，或者加入终浓度为1.5mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，并置于20℃摇床以200rpm转速进行诱导作用48h。
实施例5：利用基因工程菌制备DL-丙氨酸。
向收集有1L基因工程菌发酵液(实施例3)的三角瓶中投入5kg L-丙氨酸进行消旋反应，反应条件是温度25℃，摇床转速150rpm。每半小时用旋光仪检测一次发酵液的旋光值，待旋光值为0后停止反应(约3h)。将反应后的液体进行活性炭吸附脱色60min，活性炭使用量为0.1％(w/v)，脱色温度50℃；待过滤后用旋转蒸发仪进行真空浓缩干燥，得到DL-丙氨酸产品4.95kg，转化率为99.0％；产品的化学纯度为99.5％。
实施例6：利用基因工程菌规模化生产DL-丙氨酸。
在大型反应罐中进行DL-丙氨酸的规模制备，泵入基因工程菌发酵液(实施例3)1000L并投入5000kgL-丙氨酸，保持反应液温度25℃，反应罐搅拌转速100rpm；每小时用旋光仪检测一次发酵液的旋光值，待旋光值为0后停止反应(约5～6h)。停止反应后直接加入0.1％(w/v)的活性炭，提高反应温度至50℃，继续搅拌1h。将反应液通过板框过滤器除去菌体和活性炭，对过滤后的DL-丙氨酸转化液进行蒸发结晶，得到DL-丙氨酸产品约4900kg，转化率约为98％；产品的化学纯度为99％以上。
实施例7：利用基因工程菌多批次生产DL-丙氨酸的方法以及与野生菌的比较
取实施例3所得的基因工程菌发酵液1L于9000rpm离心15min(4℃)，收集菌体并加入到1L L-丙氨酸水溶液(5kg/L)中，重新悬浮菌体并进行消旋反应3h；反应条件是温度25℃，摇床转速150rpm。将反应后的液体于9000rpm离心15min(4℃)，收集菌体以便重复利用。而将不含菌体的上清液进行活性炭吸附脱色60min，活性炭使用量为0.1％(w/v)，脱色温度50℃；待过滤后用旋转蒸发仪进行真空浓缩干燥，得到产品4.95kg，转化率为99.0％；用旋光仪检测发现比旋光度为0，产品的化学纯度为99.5％。将离心收集的菌体以相同的转化条件重复用于DL-丙氨酸的生产，在30个批次内未见转化率出现明显的下降(见图5)。
作为基因工程菌的参照，将野生菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921以同样的方法培养，取1L发酵液于9000rpm离心15min(4℃)，收集菌体并加入到1L L-丙氨酸水溶液(5kg/L)中，重新悬浮菌体并进行消旋反应3h；反应条件是温度25℃，摇床转速150rpm。将反应后的液体于9000rpm离心15min(4℃)，收集菌体以便重复利用。而将不含菌体的上清液进行活性炭吸附脱色60min，活性炭使用量为0.1％(w/v)，脱色温度50℃；待过滤后用旋转蒸发仪进行真空浓缩干燥，得到产品4.5kg，转化率为90.0％；用旋光仪检测发现比旋光度为0，产品的化学纯度为95.0％。将离心收集的菌体以相同的转化条件重复用于DL-丙氨酸的生产，反应5个批次酶活力仅剩50％，下降十分显著。
Claims (9)
1.一种L-丙氨酸消旋酶，其特征在于，它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的L-丙氨酸消旋酶的编码基因，其特征在于，它具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。
3.一种外源表达L-丙氨酸消旋酶的基因工程菌，其特征在于，它包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)构建含有L-丙氨酸消旋酶基因的表达载体：
提取发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum CGMCC2921的基因组DNA作为模板，以包含EcoRI和NotI酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，进行PCR扩增：
引物1：5’-GGAATTCATGGTAAGTGCAC-3’；
引物2：5’-AAGCGGCCGCGCCTAGGTAGC-3’；
PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL，引物1和引物2各2μL，dNTP 4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH2O 34μL；
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后50℃退火1min，72℃延伸1min，循环25次；最后72℃延伸10min；
回收PCR扩增产物，经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-alr。
(2)将重组质粒pET-alr转化至宿主细胞中：
将重组质粒pET-alr转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：
分别挑取单克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜；提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和NotI酶切；根据电泳结果判断含有与alr基因相同分子量大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-alr，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。
5.一种L-丙氨酸消旋酶的表达方法，其特征在于，将包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的基因工程菌接种于LB液体培养基中培养过夜，然后以0.5～10％(v/v)的接种量转接入发酵培养基中，20～40℃发酵培养1～3h，再加入终浓度0.1～10g/L的乳糖或终浓度0.1～1.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，并置于20～40℃下诱导表达3～48h。
6.根据权利要求5所述的L-丙氨酸消旋酶的表达方法，其特征在于，所述的发酵培养基，其碳源的是L-丙氨酸，浓度为10～50g/L；氮源是蛋白胨或酵母粉，浓度为5～40g/L；发酵培养基用氨水或NaOH调整培养基pH值到4～10，经高压湿热灭菌后即可使用。
7.权利要求3所述的基因工程菌在制备DL-丙氨酸中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将L-丙氨酸加入到经过诱导表达的基因工程菌的发酵液中，维持反应温度4～60℃，反应3～24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为0时，停止反应，加入活性炭在20-80℃脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将经过诱导表达的基因工程菌发酵液离心并收集菌体，加入L-丙氨酸水溶液，重新悬浮菌体，调整溶液pH值为7～14，维持反应温度4～60℃，反应3～24h，反应过程检测反应液的比旋光度，待比旋光度为0时，停止反应，离心收集菌体，加活性炭至上清液中，在20-80℃脱色反应10-120min，抽滤除去活性炭后真空浓缩结晶，即得到DL-丙氨酸精制样品；二次收集的菌体可以重复用于DL-丙氨酸的生产直至酶活性完全丧失。
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| CN (1) | CN102604899B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103275918A (zh) * | 2013-06-07 | 2013-09-04 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用 |
| CN104593396A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-05-06 | 广西大学 | 一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用 |
| JP2016503650A (ja) * | 2012-12-28 | 2016-02-08 | アンホエ ファホン バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド | Ｄｌ−アラニンを生産する遺伝子操作細菌、及び前記遺伝子操作細菌を用いることによってｄｌ−アラニンを生産する方法 |
| CN108517326A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-09-11 | 天津科技大学 | 一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法 |
| CN110669751A (zh) * | 2019-07-29 | 2020-01-10 | 河北师范大学 | 一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580858A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-18 | 安徽华恒生物工程有限公司 | 一种dl-丙氨酸的酶法生产工艺 |
-
2012
- 2012-03-21 CN CN201210077566.5A patent/CN102604899B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101580858A (zh) * | 2009-06-11 | 2009-11-18 | 安徽华恒生物工程有限公司 | 一种dl-丙氨酸的酶法生产工艺 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MORITA,H.等: "alanine racemase [Lactobacillus fermentum IFO 3956]", 《NCBI DATABASE》 * |
| ULRICH STRYCH 等: "Characterization of the Alanine Racemases from Pseudomonas aeruginosa PAO1", 《CURRENT MICROBIOLOGY》 * |
| 蒋玉光: "DL_丙氨酸生产工艺的研究进展", 《精细与专用化学品》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016503650A (ja) * | 2012-12-28 | 2016-02-08 | アンホエ ファホン バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド | Ｄｌ−アラニンを生産する遺伝子操作細菌、及び前記遺伝子操作細菌を用いることによってｄｌ−アラニンを生産する方法 |
| CN103275918A (zh) * | 2013-06-07 | 2013-09-04 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用 |
| CN103275918B (zh) * | 2013-06-07 | 2015-08-26 | 安徽华恒生物科技股份有限公司 | 高产dl-丙氨酸的生产菌株及其应用 |
| CN104593396A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-05-06 | 广西大学 | 一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用 |
| CN108517326A (zh) * | 2017-12-22 | 2018-09-11 | 天津科技大学 | 一种利用透性化细胞制备利巴韦林的方法 |
| CN110669751A (zh) * | 2019-07-29 | 2020-01-10 | 河北师范大学 | 一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法 |
| CN110669751B (zh) * | 2019-07-29 | 2022-06-14 | 河北师范大学 | 一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法 |
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