CN104593396A - 一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种编码丙氨酸异构酶基因的克隆与表达。本发明提供一种编码丙氨酸异构酶的基因，其是从已构建的酵母cDNA文库中获得，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该编码丙氨酸异构酶基因经过克隆后与表达质粒连接构建重组表达质粒，重组表达质粒线性化与纯化后转化受体菌，筛选获得基因工程菌，经过诱导表达、纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。本发明采用丙氨酸异构酶可实现一步酶法将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，既提高其转化效率、缩短D-丙氨酸的工艺路线、降低生产成本又减少环境污染。

Description

一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种编码丙氨酸异构酶的基因及其应用。

背景技术

丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，是血中氮的优良运输工具，又是一种有效生糖氨基酸。D-丙氨酸包含于大的有机组织中，作为细胞壁肽壁糖或肽抗生素。D-丙氨酸是一种非天然氨基酸，一种重要的有机手性源，主要应用于手性药物、手性添加剂、手性助剂等领域，在制药及食品行业作为手性合成的手性源。目前D-丙氨酸主要用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽合成过程的丙氨酸保护剂、食品添加剂以及化妆品。同时D-丙氨酸

也广泛应用在功能性食用甜味剂方面。D-丙氨酸是合成二肽甜味剂阿力甜的一种重要的原料。今年的研究还发现D-丙氨酸的新的生理活性的应用。D-丙氨酸可使体内氨基酸氧化酶(DAAO)在肿瘤细胞质中异位表达，阻止体内脂质氧化损伤，清除细胞毒性。D-丙氨酸还可以抑制致癌物质二甲基亚硝胺(DMNA)，抑制效果为72.4。

目前D-丙氨酸的制备方法主要为化学合成法，通过化学合成得到DL-丙氨酸的混旋体，再利用各种光学拆分方法得到D-丙氨酸。目前工业上生产DL-丙氨酸的方法主要是由乙醛为原料与氰化钠，氯化铵，氨作用合成2-氨基丙腈，再经过水解后制得DL-丙氨酸。然后在DL-丙氨酸消旋混合物的饱和溶液中加入D-丙氨酸晶种和少量表面活性剂，控制浓度和温度，使两种对映体的结晶速度产生差异，D-丙氨酸优先析出结晶。

但迄今，无论采用何种化学合成法制备D-丙氨酸，都有工艺流程长、步骤多、副产物去除过程复杂，收率低，成本高且易污染环境等缺点，从而限制了D-丙氨酸的生产和市场推广。因此，研究开发一种工艺路线短、成本低的D-丙氨酸生产方法变得十分迫切和必要。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述技术的不足，提供了一种编码丙氨酸异构酶的基因克隆及其表达，进而开发出一种工艺路线短、成本低的D-丙氨酸生产方法。

基于昆虫和节肢动物蜕皮机理的研究，从酵母cDNA文库中克隆一种新的编码丙氨酸异构酶的基因(以下简称maf)，并在真核细胞中表达。该丙氨酸异构酶能催化L-丙氨酸消旋，直接转化L-丙氨酸为D-丙氨酸。这样的结果，十分有利于下一步研究高酶活、低成本的异构酶制造方法，从而开发一种新的生物法合成D-丙氨酸工艺路线，降低D-丙氨酸生产成本。

本发明解决问题所采用的技术方案：

本发明提供一种编码丙氨酸异构酶的基因，是从已构建的酵母cDNA文库中获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明获得的丙氨酸异构酶为丙氨酸异构酶基因表达产物，该酶由399个氨基酸组成，其分子量为46880.57773Da，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供一种由表达质粒和编码丙氨酸异构酶的基因重组而得的重组表达质粒。

优选的是，所述重组表达质粒为真核表达质粒pPICZaA。

本发明还提供一种由重组表达质粒转化宿主菌而得的基因工程菌。

本发明还提供了一种利用编码丙氨酸异构酶基因制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)克隆编码丙氨酸异构酶的基因；

(2)将编码丙氨酸异构酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒；

(3)将重组表达质粒线性化与纯化；

(4)将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌；

(5)将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。

优选的是，步骤4)中所述的受体菌为毕赤酵母X-33。

优选的是，步骤(5)中所述的基因工程菌利用甲醇进行诱导表达。

优选的是，所述甲醇添加至终浓度为0.5％(v/v)。

本发明还提供了丙氨酸异构酶在D-丙氨酸生产中的应用，其特征在于：所述丙氨酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，其酶解反应条件是在温度37℃下反应12h。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明是从酵母中获取丙氨酸异构酶基因。

2、本发明涉及到该丙氨酸异构酶基因克隆、与之相对应的氨基酸序列及其在受体菌毕赤酵母X-33中的表达，该表达酶可以转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，为生物法合成丙氨酸异构酶提供了一种新的方法。

3、本发明提供的丙氨酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸的酶解法简单高效，可实现一步酶法转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，既提高其转化效率、缩短D-丙氨酸的工艺路线，又减少环境污染；由于L-丙氨酸来源广泛，还能降低生产成本。

附图说明

本发明涉及酵母丙氨酸异构酶的基因克隆与表达，将结合附图简要说明：

图1为重组质粒PmlI、XbaI双酶切和PCR鉴定图，是以重组克隆载体为模板进行PCR扩增，回收产物和pPICZaA分别经过PmlI和XbaI进行双酶切，其结果通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测；其中，M为MakerλHindⅢ；第1-4孔为PmlI/XbaI酶切质粒；第5孔为MakerDL2000；第6-9孔为PCR重组产物。

图2为重组子在毕赤酵母X-33中表达图，是用含空pPICZaA载体的重组菌作为空白对照，经诱导表达后提取菌体蛋白，经12％SDS-PAGE分析；其中，M为蛋白分子量标记；第1孔为阴性对照液；第2-8孔分别为重组maf诱导24、36、48、60、72、84、96h后的结果。

图3为标品D-丙氨酸高效液相色谱图，检测条件为：手性柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相甲醇体积为分数为33％，磷酸氢二钠浓度为0.01mol/L,PH＝6.0，柱温30℃，流速1.0mL/min，UV检测波长254nm。

图4为酶促反应液高效液相色谱图，是将酶促反应液预处理后采用用高效液相色谱法检测反应结果，其检测条件为：手性柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相流动相甲醇体积为分数为33％，磷酸氢二钠浓度为0.01mol/L，PH＝6.0，柱温30℃，柱温30℃，流速1.0mL/min，UV检测波长254nm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。

实施例：

1、文库来源和质粒

酵母cDNA文库和pPICZaA均由本实验室保存。

2、主要试剂

表达宿主菌P.pastoris X-33(野生型)、抗生素Zeocin均购自invitrogen公司。Pm ll酶和XbaI酶均购自TaKaRa生物工程公司。

3、方法

3.1、基因的克隆与测序

以自行设计的引物进行PCR扩增，上游引物：5-GCGCACGTGATGCTACTGGAACAGATTTGGG-3，下游引物为5-GCGTCTAGAGCCCAGTCAAAAATTGATTTTGCTT-3。采用25μL的反应体系：10×buffer 2.5μL，dTNP 0.5μL，正反向引物各0.5μL，cDNA模板0.5μL，RTaq酶0.25μL，补水至25μL。PCR条件为：第一步：95℃5min，第二步：94℃50s，第三步：52℃45s，第四步：72℃2min，第五步：72℃10min；其中第二步至第四步循环30次。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因后与pGM-T vector连接，得到重组质粒。连接体系为：pGM-T vector 1μL，PCR目的基因产物5μL，10×T4ligase buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，双蒸水2μL,16℃连接12h过夜。用10μL连接液转化100μL感受态E.coli DH5α，将装有感受态细胞的EP管在冰浴中静止30min,接着移至42℃水浴中热激90S，随后快速将EP管转移至冰浴2min，最后加900μL LB培养基混匀后37℃摇床震荡培养45min(150r/min)。取100μL感受态细胞涂布在含Amp(100μg/mL)、IPTG(0.5mmol/L)、X-gal(0.004％)的LB(0.5％酵母膏、1％胰蛋白胨、1％氯化钠)平板上37℃培养16小时后挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。

3.2、pPICZaA表达载体的构建

以重组克隆载体为模板进行PCR扩增，回收产物。将回收产物和pPICZaA分别进行PmlI和XbaI双酶切，双酶切体系如下：PmlI和Xba I各1.5μL，NEB Buffer2.13.0μL，0.1％BSA 3.0μL，pPICZaB 18.0μL，ddH2O 3.0μL，总体积30.0μL。37℃反应12h，回收目的基因、与目的基因有相同粘性末端的pPICZaA片段，将两者连接，连接反应体系如下：10×T4DNA Ligase Buffer2.0μL,maf片段8.0μL,pPICZaB酶切片段2.0μL,T4连接酶2.0μL,ddH₂O6.0μL,Tota l20.0μL,16℃反应12h，并转化E.coli DH5α，Amp抗性筛选，抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒pPICZaA-maf测序，进一步验证。双酶切及PCR结果见图1。

3.3、质粒pPICZaA-maf的线性化与纯化

线性化：选择Sac I作为酶切位点，反应体系如下：Sac I 10μL，10×L Buffer15μL，pPICZαA-maf 110μL，ddH₂O 15μL，总体积150μL。16℃反应3h。按照常规的苯酚抽提、乙醇沉淀洗涤进行质粒纯化，以无菌水溶解沉淀。加等体积的得酚/氯仿，混匀后10000rpm离心10min，小心取上清液至一干净EP管，加入两倍体积的冰冻无水乙醇，混匀后冰箱-20℃放置30min，10000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇清洗一次。

3.4、毕赤酵母X-33电转化和重组酵母筛选

吸取10μL已纯化化的表达质粒与80μL X-33感受态细胞混合，在1500V下电转5ms，然后取150μL菌液均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPD平板。挑取具有Zeocin抗性的菌落进行MD/MM快慢斑筛选。表达质粒在毕赤酵母X-33中表达结果见图2。

3.5、阳性转化子诱导培养

挑取阳性转化子接种于25mL BMGY，于30℃，200r/min摇床震荡培养至OD600为3时，收集菌体，用BMMY重悬细胞至OD600至1.0，每24h补加100％甲醇至终浓度为0.5％，诱导培养。

3.6、重组酵母菌粗酶液提取

重组酵母菌X33-pPICZαA-maf经甲醇诱导，离心除去菌体，取20μL上清液超滤浓缩得到10μL酶液。

3.7、以胆固醇为底物进行转化

将1g L-丙氨酸溶解于含10mL 1％Tween 80、0.01mol/Lp H 7.4的磷酸缓冲溶液中，加入10ml酶液混合，37℃反应12h。反应液用石油醚萃取，石油醚与反应液体积比为5：1，萃取温度40℃，萃取时间60min。收集反应液采用反相高效液相色谱法检测反应结果，检测条件为：手性柱(5μm，150mm×4.6mm)，流动相流动相甲醇体积为分数为33％，磷酸氢二钠浓度为0.01mol/L,PH＝6.0，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量为20μL，UV检测波长254nm。检测结果显示，反应液含有D-丙氨酸，其出峰时间与标品D-丙氨酸一致，结果参见附图3和附图4。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种编码丙氨酸异构酶的基因，其是从已构建的酵母cDNA文库中获得，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种丙氨酸异构酶，其特征在于：所述丙氨酸异构酶为编码丙氨酸异构酶基因表达产物，由399个氨基酸组成，其分子量为46880.57773Da，所述丙氨酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组表达质粒，其特征在于：它由表达质粒和权利要求1所述基因经重组而得。

4.根据权利要求3所述重组表达质粒，其特征在于：所述表达质粒为真核表达质粒pPICZaA。

5.一种由权利要求3或4所述重组表达质粒转化宿主菌而得的基因工程菌。

6.一种利用权利要求1所述编码丙氨酸异构酶基因制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)克隆编码丙氨酸异构酶的基因；

(2)将编码丙氨酸异构酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒；

(3)将重组表达质粒线性化与纯化；

(4)将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌；

(5)将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。

7.根据权利要求6所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：步骤(4)中所述受体菌为毕赤酵母X-33。

8.根据权利要求6所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：步骤(5)中所述基因工程菌利用甲醇进行诱导表达。

9.根据权利要求8所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：所述甲醇添加至终浓度为0.5％(v/v)。

10.根据权利要求2所述丙氨酸异构酶在D-丙氨酸生产中的应用，其特征在于：所述丙氨酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，其酶解反应条件是 在温度37℃，反应12h。