CN103880948A - 人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（ngal）的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在毕赤酵母中制备人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的方法，包括如下步骤：提供编码NGAL的核苷酸序列；将所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表达载体中；将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主；诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL；纯化经步骤（4）处理后的NGAL。该方法表达量高，表达产物无需经过变性和复性，即可得到有活性的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL），并且后续的纯化步骤也简单方便。制备的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）可用于检测急性肾损伤的NGAL检测试剂盒。

Description

人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，具体地说，涉及一种在酵母中制备重组人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的方法。

背景技术

一、人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）

人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin)为lipocalin（载脂蛋白）家族的一个新成员，是Kjeldsen等人1993年在研究中性粒细胞明胶酶，基质金属蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9；即明胶酶B）时发现的。随后，NGAL cDNA及其全基因序列分别于1994和1997年被克隆鉴定。NGAL蛋白由一条多肽链构成，其分子量为25kD的糖蛋白，含有178个氨基酸残基。多肽链由N端的310-螺旋、C端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成了一个lipocalin家族特有的β折叠桶结构。NGAL既能够自身聚合形成46kD的同源二聚体,也能够与MMP-9聚合形成135kD的异源二聚体。在中性粒细胞中NGAL和MMP-9既有独立存在的方式,又有联合存在的方式。这提示NGAL和MMP-9既可以独立发挥作用，又可以相互结合在一起联合发挥功能。

NGAL参与多样的生化过程，涉及胚胎发育、细胞分化、炎症免疫应答、细胞凋亡、脂质代谢、肿瘤的发生发展，特别是肿瘤的浸润转移等等。其主要功能为：1）参与炎症与天然免疫反应；2）保护调节基质金属蛋白酶-9的活性；3）作为一种新型的铁离子转运载体，介导新的独特的跨膜转铁通路等等。此外，NGAL可能是人类的一种十分重要的癌蛋白，与食管癌等肿瘤密切相关。近年来,随着NGAL蛋白在人体组织细胞中广泛分布的认识,特别是在一些肿瘤组织细胞中该基因异常过度表达的发现，有关NGAL蛋白新功能的研究呈现出活跃发展趋势。

二、基因重组方法制备NGAL

传统方法从病人尿液中提取NGAL具有难以克服的缺点，例如：得率很低；批间差很大；存在生物安全隐患，难于工业化生产等。而基因工程方法来表达，生产重组蛋白质不会存在这些问题。最常用的基因工程蛋白表达系统包括大肠杆菌和酵母系统。

1、大肠杆菌表达系统

在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。其主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒）转化细菌（通常选用的是大肠杆菌），通过IPTG等诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。

对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因mRNA的AUG为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的DNA序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。

作为发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，大肠杆菌表达系统优点在于遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

大肠杆菌系统表达重组蛋白的操作步骤包括：

1）目的基因的取得：目的基因可以从适当的供体生物包括微生物、动物或植物中提取，也可以由化学合成法合成有特定功能的目的基因。

2）载体系统的选择：一个优良的载体必须具备几个条件：是一个具自我复制能力的复制子；能在受体细胞内大量增值；只有一个限制性内切核酸酶的切口；其上必须有一种选择性遗传标记。对于大肠杆菌表达系统来说，载体主要是一些松弛型细菌质粒。

3）目的基因与载体DNA的重组：采用限制性内切酶处理产生粘性末端，经过退火后在连接酶的作用下，目的基因就与载体DNA结合形成重组载体。

4）重组载体导入受体细胞：在大肠杆菌表达系统中通过转化法将质粒导入受体细胞，如CaCl₂转化法，电穿击法、热击法等。

5）重组菌株的筛选鉴定：对表达的重组菌株进行抗生素筛选，电泳鉴定后才能大规模培养。

6）重组菌株的大规模培养：通过在摇瓶及发酵罐上采用单因子及正交试验进行条件的优化，在最佳培养条件下大规模发酵。

7）重组蛋白的分离纯化：常用的有离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、膜分离等方法，或将几种方法联合起来。

2、酵母表达系统

酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用。最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母。但与新型酵母体系相比，酿酒酵母表达系统存在不适合高密度培养、缺乏强有力的严格调控的启动子，而且分泌效率较低，尤其是许多分子量大于30kD的外源蛋白几乎不分泌等缺点，通常不被看作是重组蛋白的理想宿主。后来人们又相继开发了裂殖酵母、甲醇酵母等。

甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种，并以Pichia Pastoris应用最多。甲醇酵母的表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母染色体中。大部分甲醇酵母的表达载体中都含有甲醇酵母醇氧化酶基因(AOX1)，在该基因的启动子(PAOX1)作用下，外源基因得以表达。PAOX1是一个强启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时。甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时PAOX1可被诱导激活，因而外源基因可在其控制下表达,将目的基因多拷贝整合入酵母染色体后可以提高外源蛋白的表达水平及产量。甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长。培养至高浓度。再以甲醇为碳源。诱导表达外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达克级。

酵母系统表达重组蛋白的操作步骤包括：

1）目的基因的克隆：选用合适的限制性内切酶将外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。

2）重组载体线性化：重组载体只有被酶切线性化，整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。

3）酵母转化：电穿孔，原生质球，PEG，或醋酸锂，选用上述四种方法中的任何一种转化。一般选用原生质球或电穿孔，因为这两种方法转化效率较高。

4）筛选：转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子。转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选，可用原位点杂交进行。

5）鉴定表型：筛选出的转化子需鉴定表型，即确定是Mut,还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两种平板上。在MD和MM平板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Muts。

6）诱导表达：外源蛋白在甲醇酵母中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以甘油为碳源的培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以甲醇为碳源的培养基中诱导表达。每隔一段时间加一次甲醇，以弥补甲醇的损失。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大，从摇瓶培养转至大规模发酵。

国内外已有运用大肠杆菌（原核系统）和酵母细胞来表达NGAL的文章和专利。王小中等人（NGAL原核表达及多克隆抗体的制备，国际检验医学杂志，2011,32（16）：1789-1791）把NGAL基因克隆到pet28a载体，在大肠杆菌中表达该蛋白。但实际上由于大肠杆菌系统缺乏翻译后的糖基化修饰，NGAL的表达产物为非糖基化蛋白。而NGAL本身为糖蛋白，糖基对蛋白有保护作用。汕头大学医学院李恩民等人（重组毕赤酵母及其表达NGAL蛋白的方法，专利申请号：200610123677.X）在毕氏酵母菌中表达了NGAL，表达产物为糖蛋白，具有生物学活性。该专利利用酵母表达载体pPIC9，表达量大于100mg/L。但在菌落筛选时，只采用了菌落PCR方法，如果筛选表达量更高的重组菌株，需要从成百甚至上千个重组菌株才能筛选出来，此外，即使是用G418筛选，当菌落密度高时，会产生很多假阳性；而且，其在蛋白纯化时，纯化繁琐，需要经过硫酸铵沉淀，脱盐，阳离子交换等等。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物活性高，表达量高，菌落筛选更为简单且杂蛋白少纯化更为简便的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其包括如下步骤：

（1）提供编码NGAL的核苷酸序列；

（2）将所述NGAL的核苷酸序列克隆到不同的酵母表达载体中；

（3）将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主；

（4）诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL；

（5）纯化步骤（4）处理后的NGAL。

所述人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

所述酵母表达载体为能够用以表达外源蛋白的穿梭载体。

优选的是，所述酵母表达载体为pPICZαB。

所述酵母宿主为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母或光滑球拟酵母中的任意一种。

优选的是，所述酵母宿主为毕赤酵母。

优选的是，所述组氨酸标签是含有六个连续的组氨酸的氨基酸序列。

优选的是，所述步骤（4）中的诱导表达使用甲醇作为唯一碳源，并使甲醇的终浓度为发酵液体积的0.5%～3%（V/V）。

优选的是，所述步骤（5）中的纯化操作在Ni²⁺-NTA基质中进行，并采用咪唑溶液进行洗脱。

本发明的有益效果为：

1.在酵母真核表达系统中进行重组表达，表达产物NGAL无需变性和复性，诱导表达后收集培养基上清即可得到有活性的NGAL。

2.表达量很高，杂蛋白很少。表达量可达至少150mg/L（摇瓶中），即使不纯化，蛋白纯度可达80%以上。预计在发酵罐中，由于通气量，甘油，甲醇含量更容易得到控制，表达量可以至少比摇瓶中提高4倍以上。

3.表达生成C端带有组氨酸标签（His tag）的NGAL，使得在后续的亲和层析过程中，只需一步纯化步骤即可得到纯品。

4.如根据酵母偏好密码子提供编码的NGAL的核苷酸序列，还可以进一步提高表达量。

5.如在诱导表达过程中使甲醇的终浓度达到0.5%至3%（V/V），能够更高效的表达NGAL。

附图说明

图1为NGAL在酵母中的诱导表达结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1-5为不同重组转化子X-33/pPICZαB-NGAL诱导表达3天的上清；

图2为重组NGAL的纯化结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1、2为NGAL亲和层析产物；

图3为重组NGAL的免疫学活性测定结果示意图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1为NGAL，泳道2为对照。

具体实施方式

材料：

菌株和质粒：克隆菌种Escherichia coli(DH5a)是基因工程常用工具菌种；巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS-115、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）KM-71、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）KM-71H、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）SMD-1168、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）SMD-1 168-H；质粒pPICZαB购于invitrogen公司。

酶和试剂：

实施例中涉及分子生物学操作所用的酶均购于北京经科宏达公司。

PCR纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒（全式金）、酵母DNA提取试剂盒均购于北京天根公司(TianGen)。

NGAL兔源多克隆抗体（H-130）购于santa公司，驴抗兔带HRP标记的二抗购于北京博奥森生物技术有限公司。

实施例中所涉及的编码NGAL的核苷酸序列的合成、引物的合成和DNA的测序工作由赛诺基因完成。

抗生素zeocin购于invitrogen公司。

培养基如下：

LB培养基、Amp抗性LB培养基、YPD培养基、MD培养基、zeocin抗性YPD培养基以上培养基为液体培养基；

zeocin-YPD固体培养基、BMGY培养基、BMMY培养基；

以上培养基是基因工程领域常用培养基，各培养基的配方可参见分子克隆第三版下册附录2以及invitrogen公司的毕赤酵母操作手册（Multi-Copy PichiaExpression Kit）第64页-第70页；及pPICZαA,B,and C第17-第18页。

实施例1

本实施例人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其包括如下步骤：

1、pPICZαB-NGAL表达载体的构建

（1）NGAL全基因合成：按照毕赤酵母密码子偏好性化学合成NGAL基因的核苷酸序列，最终基因为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

（2）以上述合成的碱基序列作为模板，以设计的三条引物为上下游引物，进行巢式PCR扩增，其中首次PCR所需引物如下：

上游引物NGAL-U1(下划线为5’His)：

GAAGCTCATCACCACCATCACCATCAAGACTCCACCTCTGACTT

下游引物NGAL-R(下划线为NotI位点)：

TTCTTGCGGCCGCTTATCAACCGTCGATACATTGGTCGA

首次PCR反应体系为：

扩增条件为：

94℃ 5min；

94℃ 30s、60℃30s、72℃50s35个循环；

72℃ 10min。

上述PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化后一千倍稀释作为二次PCR的模板。二次PCR所需引物如下：

上游引物NGAL-U2（下划线为XhoI位点）：

ATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCACCACCATCAC

下游引物同NGAL-R

二次PCR反应体系同首次PCR反应体系。

（3）将步骤（2）中得到的最终的PCR产物用PCR纯化试剂盒进行纯化。

（4）使用限制性内切酶NotI和XhoI对上述PCR纯化产物进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

（5）使用限制性内切酶NotI和XhoI对质粒pPICZαB进行双酶切，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收。

（6）使用T4连接酶连接步骤（4）和步骤（5）中回收的片段，其中载体酶切产物与NGAL基因酶切产物的浓度比为1:3-5。

（7）将步骤6中的连接产物通过转化的方法导入到Escherichia coli(DH5a)中，并涂布于LB培养基，在摇床中200rpm，37℃培养1小时，然后取菌液铺于zeocin抗性LB培养基，37℃培养过夜。

（8）挑选8至20个转化子，分别接入zeocin抗性LB培养基，培养过夜。第二天再从这些过夜培养物中用质粒抽提试剂盒提取质粒。NotI和XhoI双酶切克隆鉴定，筛选的阳性克隆送到北京诺赛基因公司进行序列测定，选出测序结果正确的NGAL重组质粒。

（9）大量提取重组质粒，SacI或PmeI线性化质粒，然后使用PCR产物纯化试剂盒纯化，得到线性化重组质粒pPICZαB-NGAL。

2、重组NGAL酵母工程菌的构建

将上述线性化后的重组NGAL表达载体pPICZαB-NGAL电转化至X-33毕 赤酵母感受态细胞中。然后将转化后的X-33毕赤酵母涂布于不同zeocin抗性浓度的YPD固体培养基上，zeocin浓度分别为0.1mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，3mg/ml。29℃孵育3-4天。

从上述固体培养基上挑取转化子，依次转接到0.1mg/ml YPD zeocin，0.5mg/mlYPD zeocin，1mg/ml YPD zeocin，3mg/ml YPD zeocin固体培养基上，29℃培养，以筛选高拷贝的转化子。待高拷贝转化子生长起来后，挑取单菌落接种于5ml YPD液体培养基中，29℃，200rpm培养，制成可表达NGAL的工程菌。

3、重组NGAL表达工程菌的诱导表达

将上述工程菌按照1%接种量接种于10ml BMGY液体培养基中，29℃，200rpm培养，待菌生长起来后，将其按照1%接种量接种于0.4L BMGY液体培养基中，29℃，200rpm培养，待OD600nm为约2时，离心，弃上清，用0.4L BMMY液体培养基重悬菌体，装于2L摇瓶中，29℃，200rpm，添加甲醇至1%（V/V）进行培养，并且每24小时再次补充甲醇至1%（V/V），直至第3天诱导完毕。重组NGAL被分泌表达至液体培养基中。

如图1所示，图1中的M表示蛋白质分子量标准，图1中的1-5表示不同重组转化子X-33/pPICZαB-NGAL诱导表达3天的上清。从SDS-PAGE图来看，酵母表达后的上清中明显地存在NGAL的表达，纯度至少在80%以上，杂蛋白的含量明显地要少很多，非常利于下一步的纯化，这一点是常规的大肠杆菌表达外源蛋白时所不能比拟的。另一方面来说，该电泳时的样品是直接取自酵母发酵液的上清，没有经过任何离心、重悬、超滤、硫酸铵沉淀等相应的浓缩处理，所以该酵母系统表达的外源蛋白的表达量已经是非常高,每升发酵液可获得大约170mg的重组NGAL。

重复发酵5批，每批次获得的发酵菌体中，每升发酵液均可获得大于150mg的重组NGAL

4、重组NGAL的纯化和鉴定

将步骤3中的培养液上清用NTA-Ni预装柱（GE公司）进行纯化，首先使用浓度为20mmol/L咪唑进行冲洗以除去杂蛋白，然后250mM咪唑洗脱目的蛋白（NGAL），收集组分峰，得到含有咪唑的NGAL溶液。

将上述含有咪唑的NGAL溶液用脱盐柱去除咪唑，洗脱液为1×PBS，其包含：浓度为137mmol/L的NaCl、浓度为2.7mmol/L的KCl、浓度为10mmol/L的Na₂HPO₄·12H₂O和浓度为1.8mmol/L的KH₂PO₄，pH为7.4的溶液，收集组分峰，得到纯品NGAL溶液。最终每升发酵液可获得大约120mg的重组NGAL。所述脱盐柱为GE公司生产。

将重复发酵5批NGAL培养液，用同样于步骤4的方式进行纯化，最终每批发酵液中，每升发酵液均可获得大于110mg的重组NGAL，重复性非常好，有利于蛋白的大规模纯化。

SDS-PAGE电泳检测重组NGAL的纯度，结果见图2，图2中的M表示蛋白质分子量标准，图2中的1、2表示NGAL的亲和层析产物，所得重组NGAL纯度很高，大于95%。

5、重组NGAL的免疫学活性测定（Western Blotting）

材料：

重组NGAL溶液，包含：根据实施例中的1～4步骤制备的重组NGAL，1×PBS，并调节pH值为7.4。

一抗（NGAL兔源多克隆抗体）：稀释度=1/500

二抗（HRP标记）：稀释度=1/1000

显色液包括：浓度为10mmol/L、pH为7.6的Tris-Cl，浓度为0.6%的DAB，浓度为0.03%的H₂O₂。

仪器：电泳仪（DYCZ-40A）、电转仪（DYCZ-40D）及电泳仪电源（DYY-6C）均购于北京市六一仪器厂

SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶中的蛋白半干转膜到PVDF上。转膜完毕后封闭。封闭完成后，漂洗，一抗孵育，室温2小时。洗涤三次，每次5～10分钟。然后二抗孵育，室温1～2小时。洗涤三次，每次5-10分钟。然后显色：显色液将膜完全覆盖，避光显色3～5min。所述一抗孵育操作中所用的一抗（NGAL兔源多克隆抗体）：稀释度=1/500；所述二抗孵育操作中所用的二抗（HRP标记）：稀释度=1/1000。

其结果如图3所示，表明产物具备免疫学活性。图3中M表示蛋白质分子量标准，1是重组NGAL，2是对照。

比较酵母表达的NGAL和自己实验室用大肠杆菌表达的NGAL的免疫原性。双抗体夹心法检测，选取不同的NGAL的用量，从实验结果来看，酵母表达的NGAL的免疫原性要好，大概是大肠杆菌表达的NGAL免疫原性的1.8倍左右。

备注：取0.05ug的NGAL做实验，大肠杆菌表达的NGAL相应数值为0.073，数值太小导致免疫原性比较比例相差太悬殊，可信度不高，但该组对照也一定程度上说明了酵母表达的NGAL免疫原性要比大肠杆菌表达的NGAL免疫原性要好很多。

酵母及E.coli表达的NGAL免疫原性比

我们将本公司自己制备的酵母表达的NGAL和大肠杆菌表达的NGAL同时免疫兔子，试验结果表明：酵母表达的NGAL抗体的效价要远远高于大肠杆菌表达NGAL的效价。

该专利方法提及的用酵母表达的NGAL以及用它制备的相应的NGAL抗体可以用于检测急性肾损伤的NGAL检测试剂盒。

本方法在酵母系统中表达NGAL优势在于：酵母真核表达系统所产生的NGAL能糖基化并具备生物学活性，表达量高，每升发酵液均可获得大约170mg重组NGAL，在菌落筛选时，可以通过高浓度Zeocin抗性体内筛选多拷贝质粒，大大简化工作量而达到相同筛选高产量菌株的目的；并且是以分泌表达的方式存在于培养基中，培养液中杂蛋白极少，十分有利于蛋白的纯。经镍柱一步亲和层析，回收率大于70%，纯度在90%以上，完全能满足抗体制备的需要。

实施例2

本实施例用到的方法与实施例1用到的方法基本相同，这里所述的方法主要包括引物设计、PCR及其产物纯化、限制性内切酶的酶切处理、T4连接酶连接、转化克隆菌株及鉴定、诱导表达、表达后纯化、酶活性检测方法等等。

不同于实施例1的是在重组NGAL工程菌的构建完成后，此次选用的是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS-115来表达NGAL。

前期的PCR、克隆鉴定、蛋白表达及蛋白纯化结果与实施例1基本相同，这里不再赘述。

将构建的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白的酵母系统的重组表达载体NGAL-pPICZαB导入GS-115毕赤酵母感受态细胞中，进行甲醇诱导表达、纯化以及免疫原性检测等实验，得到的蛋白表达量、蛋白纯度和免疫原性，与在X-33（实施例1）酵母细胞中表达的NGAL无明显差异，表达量可以达到每升发酵液可获得大约177mg的重组NGAL，比大肠表达的NGAL各方面实验结果都要好，尤其是在免疫原性的对比方面。

Claims (8)

1.一种人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：

（1）提供编码NGAL的核苷酸序列；

（2）将所述NGAL的核苷酸序列克隆到pPICZαB酵母表达载体中；

（3）将所述酵母表达载体转化至同一酵母宿主；

（4）诱导所述酵母宿主表达C端带有组氨酸标签的NGAL；

（5）纯化经步骤（4）处理后的NGAL。

2.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述酵母宿主为汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母或光滑球拟酵母中的任意一种。

4.根据权利要求3所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述酵母宿主为毕赤酵母。

5.根据权利要求4所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母为X-33或G-115。

6.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述组氨酸标签是含有六个连续的组氨酸的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的诱导表达使用甲醇作为唯一碳源，并使甲醇的终浓度为0.5%～3%(V/V)。

8.根据权利要求1所述的人中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（NGAL）的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中的纯化操作在Ni²⁺-NTA基质中进行，并采用咪唑溶液进行洗脱。

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