CN104212779B

CN104212779B - 一种新型核糖核酸酶a及其纯化生产工艺

Info

Publication number: CN104212779B
Application number: CN201410437404.7A
Authority: CN
Inventors: 刘艳杰; 陈铭璐; 董颖红
Original assignee: NINGBO MEICHENG BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NINGBO MEICHENG BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-08-29
Also published as: CN104212779A

Abstract

本发明提供一种新型核糖核酸酶A，它是以现有的牛胰腺核糖核酸酶A为基础、对其特定几个位点进行突变形成的，其纯化生产工艺为：对基因序列全基因合成后，构建毕赤酵母重组质粒，然后经过种子培养、发酵培养基扩增培养、甘油补料分批培养、甲醇补料诱导表达，再经过蛋白纯化得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。该方法得到的目的蛋白表达量高，容易纯化，且稳定性高，活性成分作用时间长，保存期长。

Description

一种新型核糖核酸酶A及其纯化生产工艺

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及一种新型核糖核酸酶A，以及该新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺。

背景技术

核糖核酸酶A(RNase A)是内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。核糖核酸酶A是脊椎动物所特有的蛋白质家族，除了水解RNA以外，它们还参与细胞成熟、细胞凋亡、血管生成以及宿主防御等过程，在疾病的诊断和治疗方面表现出重要的应用价值。

RNase A家族成员具有很高的序列相似性，它们大多含有6-8个半胱氨酸并形成分子内二硫键，以维持特有的空间结构。RNase A基因结构中不含有内含子，成熟的RNaseA的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF氨基酸序列(XX为任意氨基酸)。

核糖核酸酶A最早是在牛的胰腺中发现的，牛胰腺核糖核酸酶A包括一个374bp的开放阅读框，编码124个氨基酸的多肽链(如SEQ ID NO：4所示)，预测其等电点为8.30，分子量为14kD。

牛胰腺核糖核酸酶A是第一个被应用于动物肿瘤和白血病临床治疗的RNase A，并取得一定的效果。目前所用的RNase A多从牛胰腺中提取，虽然原料来源丰富，但纯化的技术要求较高，而且有DNA酶和病毒(如牛海绵状脑病病毒)污染危险，因此，WHO和FDA等国际权威机构明确规定动物源性的牛核糖核酸酶A不能用于制备人和动物基因治疗或基因免疫用途的重组质粒。

张泉等发表的论文“牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定”中提出利用RT-PCR从牛胰腺总RNA中扩增出大小和序列正确的RNase A cDNA，并在大肠杆菌中获得分泌性表达重组酶，为生物制品级核算疫苗或基因治疗用途质粒DNA的制备提供了借鉴。但是，使用该方法诱导表达的重组核糖核酸酶A蛋白表达量不高，且纯化困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新型核糖核酸酶A，以及该新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺。

本发明所采用的技术方案为：

一种新型核糖核酸酶A，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

编码上述新型核糖核酸酶A的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

上述新型核糖核酸酶A的纯化生产工艺，它包括以下步骤：

S1：对SEQ ID NO：2所示的基因序列进行全基因合成，得到新型核糖核酸酶A基因；

S2：将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体上，构建PPIC9K重组质粒；

S3：将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GS115中；

S4：筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒；

S5：将毕赤酵母重组质粒接种到YPD液体培养基，30℃、280rpm震荡培养12-24h，获得一级种子液；

S6：将一级种子液按10％的体积比接种到YPD液体培养基，30℃、220rpm震荡16-24h，获得二级种子液；

S7：将二级种子液按5％的体积比接种到含发酵培养基的发酵罐，设定搅拌转速为300rmp、通气量为30％、温度30℃，开始发酵培养，通过调节搅拌速度、通气量、罐压使DO维持在20％～35％，当DO陡然上升至95-100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，立即进入下一步骤；

S8：以12ml/h/L的速率流加50％甘油(甘油与去离子水按体积比1︰1配比而成)到发酵罐中，维持4h，同时提高搅拌速度、通气量、罐压使DO维持在20％～35％，停止补加甘油后，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态1h；

S9：以1ml/h/L的低速流加甲醇(100％甲醇)4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳源的环境，再以每半小时增加10％的流速增到3ml/h/L至诱导结束，通过调节搅拌速度、通气量、罐压和甲醇流加速率使DO值维持在20％～35％，每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD₆₀₀，当OD₆₀₀为400时结束诱导；

S10：纯化目的新型核糖核酸酶A，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。

所述步骤S7中发酵培养基的配方为：在无机盐培养基中添加4.35ml/LPTM₁微量元素溶液，初始pH5.0。所述无机盐培养基的配方为：磷酸26.7mL、CaSO40.93g、K₂SO418.2g、MgSO4·7H2O14.9g、KOH4.13g、甘油40.0g(31.67mL)、PTMI4.35ml，氨水调节pH至4.5，溶剂为去离子水，配制量为1升。

所述PTM₁微量元素溶液的配方为：CuSO₄·5H₂O6.0ml/L、KI0.08ml/L、MnSO₄·H₂O3.0ml/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.2ml/L、H₃BO₃0.02ml/L、CoCl₂0.5ml/L、ZnCl₂20.0ml/L、FeSO₄·7H₂O65.0ml/L、Biotin0.2ml/L、H₂SO₄5.0ml/L，溶剂为去离子水，混匀过滤除菌。

所述步骤S10中纯化目的新型核糖核酸酶A融合蛋白具体包括以下步骤：

S1：将诱导后的菌液用管式离心机离心，收集上清液；

S2：用陶瓷膜进行过滤处理，去除菌体等碎片；

S3：将上清液上清超虑浓缩，同时除盐并交换成20mMTris-HCL缓冲液，将上清液浓缩十倍；

S4：60℃加热浓缩液，去除热不稳定杂蛋白，离心收集浓缩上清液；

S5：采用亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下：

1)平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，

2)上样：将浓缩上清液用平衡缓冲液稀释5倍后上样，结束后继续用平衡缓冲液冲洗色谱柱，

3)洗脱：用洗脱缓冲液将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品，

4)将搜集到的样品透析，然后进行冷冻干燥，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。

所述亲和层析柱的填料为镍亲和层析填料。所述平衡缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.8；所述洗脱液缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.8。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)本发明提供一种新型核糖核酸酶A，该新型核糖核酸酶A是以现有的牛胰腺核糖核酸酶A为基础、对其特定几个位点进行突变形成的，该新型核糖核酸酶A经过实验验证，其稳定性，无论在高温环境下，还是在低温环境下，比现有的牛胰腺核糖核酸酶A都要高，这不仅有效延长了其活性成分作用时间，直接延长了其作用时效，而且也使保存时间更为长久。

(2)本发明针对基因阶段，提供一种合适、有效、成功的带有编码新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建方法，针对蛋白质阶段，提供一个分阶段不同培养基、特定添加物、特殊处理方法形成的菌体扩增和诱导表达目的蛋白方法，两种方法合理组合，很好地完成了新型核糖核酸酶A的基因克隆和表达，使得诱导表达得到的新型核糖核酸酶A表达量高，且容易纯化。

附图说明

图1所示的是本发明实施例3中得到的纯化后目的新型核糖核酸酶A蛋白的检测图，其中M3：蛋白质分子量标记；1：浓缩上清液；3：洗脱收集液；

图2所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A的诱导表达产量比较；

图3所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A在60度条件下的活性比较；

图4所示的是本发明突变前后牛胰腺核糖核酸酶A在冷冻条件下的活性比较。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建

本实施例对SEQ ID NO：2所示的基因序列进行重组质粒的构建。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，我们将其称之为新型核糖核酸酶A。新型核糖核酸酶A与现有的牛胰腺核糖核酸酶A氨基酸序列(SEQ ID NO：4所示，其碱基序列如SEQID NO：3所示)相比，其突变位点为第38位、第88位、第109位、第120位，分别由D突变为R、由G突变为D、由A突变为R、由F突变为G。新型核糖核酸酶A由124个氨基酸残疾组成，属碱性蛋白质，其具有核糖核酸酶A家族的典型结构，如由8个半胱氨酸形成的四个分子内二硫键和CKXXNTF特征结构，属于核糖核酸酶A家族。

含有新型核糖核酸酶A基因的重组质粒的构建，包括以下步骤：

S1：对SEQ ID NO：2所示的基因序列进行全基因合成(由华大基因合成)，得到新型核糖核酸酶A基因。

S2：将新型核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体(购自invitrogen)上，构建PPIC9K重组质粒。

S3：将重组质粒从大肠杆菌中提取出来，将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GS115(购自invitrogen)中。

质粒DNA线性化(5×0.5mLEP管中酶切体系)：

混合，稍离心，37℃，酶切150min左右，电泳检测质粒酶切程度，以未酶切质粒作为参照，线性化后质粒位于未酶切质粒上方。

酵母电转化法感受态细胞制备：

1)在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30度过夜，取0.1-0.5ml过夜培养物，接种含100ml新鲜培养基的500mL摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5(早7点挑单菌落至5mlYPD培养基中，260rpm摇菌，晚10点转接至500ml摇瓶中，250rpm摇菌，次日下午可做感受态)；

2)在4度，1500g离心5min收集细胞，用100ml预冷的灭菌水悬浮细胞；

3)如上离心，用50ml预冷的灭菌水悬浮细胞；

4)如上离心，用4ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞至4×1.5mL离心管中；

5)如上离心，用200ul预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约400ul。

转化：采用电转杯，去离子水洗净，紫外灯照射过夜：

1)取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；

2)在冰上放置5min；

3)根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击，参数：1500V、400Ω、25uF、5msec；

4)立即加入1ml预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；

5)分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上；

6)在30度孵育平板至克隆产生，按P41筛选Mut+/Muts表型。

S4：筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒。

筛选：分别配制四个G418浓度梯度(1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL)的YPD筛选平板(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，1.5％琼脂)。进行培养的MD平板，用无菌牙签各挑取70个酵母单菌落，点在上述四个G418浓度梯度的YPD筛选平板中，并作相应编号。每个克隆均做4个梯度的筛选。

实施例2：新型核糖核酸酶A融合蛋白的诱导表达

种子培养基：YPD液体培养基(购自安琪酵母股份有限公司)；

发酵培养基：无机盐培养基、4.35ml/LPTM₁微量元素溶液，初始pH5.0；

无机盐培养基：磷酸26.7mL、CaSO40.93g、K₂SO418.2g、MgSO4·7H2O14.9g、KOH4.13g、甘油40.0g(31.67mL)、PTMI4.35ml，氨水调节pH至4.5，溶剂为去离子水，配制量为1升。

PTM₁微量元素溶液：CuSO₄·5H₂O6.0ml/L、KI0.08ml/L、MnSO₄·H₂O3.0ml/L、Na₂MoO₄·2H₂O0.2ml/L、H₃BO₃0.02ml/L、CoCl₂0.5ml/L、ZnCl₂20.0ml/L、FeSO₄·7H₂O65.0ml/L、Biotin0.2ml/L、H₂SO₄5.0ml/L，混匀过滤除菌，4℃避光保存。

新型核糖核酸酶A蛋白的诱导，包括四个阶段：

1、种子培养：

将毕赤酵母重组质粒接种到YPD液体培养基，30℃、280rpm震荡培养12-24h，获得一级种子液；将一级种子液按10％的体积比接种到YPD液体培养基，30℃、220rpm震荡16-24h，获得二级种子液。

2、甘油分批培养阶段扩增菌体：

将二级种子液按5％的体积比接种到含发酵培养基的发酵罐，设定搅拌转速为300rmp、通气量为30％、温度30℃，开始发酵培养，通过调节搅拌速度、通气量、罐压使DO维持在20％～35％，当DO陡然上升至95-100％时，说明培养基中甘油已经消耗殆尽，立即进入下一步骤(菌体浓度达到90～150g/L)。

3、甘油补料分批培养阶段扩增菌体：

以12ml/h/L的速率流加50％甘油(甘油与去离子水按体积比1︰1配比而成)到发酵罐中，维持4h，同时提高搅拌速度、通气量、罐压使DO维持在20％～35％，停止补加甘油后，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态1h，然后转入甲醇诱导表达阶段，诱导过程中流加氨水维持pH恒定，同时氨水也用作氮源(菌体浓度达到180～220g/L)。

4、甲醇补料分批诱导表达阶段：

“饥饿”期结束后以1ml/h/L的低速流加甲醇(100％甲醇)4h，以使工程菌适应以甲醇为唯一碳源的环境，再以每半小时增加10％的流速增到3ml/h/L至诱导结束，通过调节搅拌速度、通气量、罐压和甲醇流加速率使DO值维持在20％～35％(菌体浓度达到350～450g/L)，开始诱导表达后每4h取样一次，测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD₆₀₀，当OD₆₀₀为400时结束诱导。

实施例3：新型核糖核酸酶A融合蛋白的纯化

平衡缓冲液：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.8；

洗脱液缓冲液：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，300mM咪唑，pH7.8；

亲和层析柱填料为镍亲和层析填料(购自北京中科院过程工程研究所)。

新型核糖核酸酶A融合蛋白的纯化，包括以下步骤：

S1：将诱导后的菌液用管式离心机离心，8000rpm，收集上清液；

S2：用陶瓷膜进行过滤处理，进一步纯化上清液，去除菌体等碎片；

S5：采用亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下：

4)将搜集到的样品透析，然后放到冰箱冷冻，然后进行冷冻干燥；得到纯化的目的蛋白新型核糖核酸酶A-His Tag融合蛋白(SEQ ID NO：5所示)。对该样品蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，其中3为洗脱收集液，大小约在20kD左右，与新型核糖核酸酶A分子量(14kD左右)加His标签的分子量(6kD左右)总和(20kD左右)吻合。

对比例：

对现有的牛胰腺核糖核酸酶A基因(SEQ ID NO：3所示)，进行全基因合成(由华大基因合成)，得到牛胰腺核糖核酸酶A基因，然后按照实施例1的方法构建牛胰腺核糖核酸酶A-毕赤酵母重组质粒。

对牛胰腺核糖核酸酶A-毕赤酵母重组质粒进行核糖核酸酶A蛋白的诱导表达，方法同实施例2。

对得到的诱导后的菌液进行蛋白纯化，方法同实施例3。

比较实验：

1、蛋白产量比较：

对实施例2(称为突变后)和对比例(称为突变前)中目的蛋白诱导表达阶段，每隔一段时间测目标蛋白的产量，实验结果如图2所示。

由图2可以看出，突变后(本发明新型核糖核酸酶A)和突变前(现有牛胰腺核糖核酸酶A)的核糖核酸酶A以同样的方法构建重组质粒后，在同样的条件下进行目的蛋白的诱导表达，结果显示突变后的本发明新型核糖核酸酶A构成的重组质粒其目的蛋白诱导量在后期(30小时以后)均明显高于现有的牛胰腺核糖核酸酶A构成的重组质粒。

2、稳定性比较：

对实施例3(称为突变后)和对比例(称为突变前)得到的目的蛋白分别在60℃和-20℃条件下保存，然后分别测量突变前和突变后的核糖核酸酶A的活性比率，进而比较其稳定性，结果如图3、图4所示。

由图3、图4可知，无论是在60℃的高温环境下，还是在-20℃的低温环境下，经过特定位点突变的本发明新型核糖核酸酶A，其活性比现有的牛胰腺核糖核酸酶A降低的速率都要慢，故经过突变的本发明新型核糖核酸酶A无论在高温环境下，还是在低温环境下，其保存期更长，有效活性时间更长，稳定性更好。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为生物化学的普通市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种核糖核酸酶A，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的核糖核酸酶A的基因，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于包括以下步骤：

S1：对SEQ ID NO：2所示的基因序列进行全基因合成，得到核糖核酸酶A基因；

S2：将核糖核酸酶A基因连接到PPIC9K载体上，构建PPIC9K重组质粒；

S3：将PPIC9K重组质粒线性化，然后电转化到毕赤酵母GS115中；

S4：筛选重组子，获得毕赤酵母重组质粒；

S6：将一级种子液按10％的体积比接种到YPD液体培养基，30℃、220rpm震荡培养16-24h，获得二级种子液；

S7：将二级种子液按5％的体积比接种到含发酵培养基的发酵罐，设定搅拌转速为300rmp、通气量为30％、温度30℃，开始发酵培养，使DO维持在20％～35％，当DO陡然上升至95-100％时，立即进入下一步骤；

S8：以12ml/h/L的速率流加50％甘油到发酵罐中，维持4h，同时使DO维持在20％～35％，停止补加甘油后，观察DO值上升至100％后，继续维持“甘油饥饿”状态1h；

S9：以1ml/h/L的低速流加甲醇4h，再以每半小时增加10％的流速增到3ml/h/L至诱导结束，使DO值维持在20％～35％，同时实时测定发酵液中酵母菌体细胞光密度OD₆₀₀，当OD₆₀₀为400时结束诱导；

S10：纯化诱导得到的目的核糖核酸酶A融合蛋白，

其中，步骤S7中发酵培养基的配方为：在无机盐培养基中添加4.35ml/L PTM₁微量元素溶液，初始pH 5.0，所述无机盐培养基的配方为：磷酸26.7mL、CaSO40.93g、K₂SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g、甘油40.0g、PTM I 4.35ml，氨水调节pH至4.5，溶剂为去离子水，配制量为1升；所述PTM₁微量元素溶液的配方为：CuSO₄ 5H₂O 6.0ml/L、KI 0.08ml/L、MnSO₄H₂O 3.0ml/L、Na₂MoO₄ 2H₂O 0.2ml/L、H₃BO₃0.02ml/L、CoCl₂0.5ml/L、ZnCl₂20.0ml/L、FeSO₄ 7H₂O 65.0ml/L、Biotin 0.2ml/L、H₂SO₄5.0ml/L，溶剂为去离子水，混匀后过滤除菌。

4.根据权利要求3所述的核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述步骤S10中纯化目的核糖核酸酶A融合蛋白具体包括以下步骤：

S1：将诱导后的菌液用管式离心机离心，收集上清液；

S2：用陶瓷膜进行过滤处理，去除菌体等碎片；

S3：将上清液超滤浓缩，同时除盐并交换成20mMTris-HCL缓冲液，将上清液浓缩十倍；

S5：采用亲和层析柱进行纯化，纯化过程如下：

4)将搜集到的样品透析，然后进行冷冻干燥，得到目的核糖核酸酶A融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述亲和层析柱的填料为镍亲和层析填料。

6.根据权利要求4所述的核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述平衡缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH 7.8。

7.根据权利要求4所述的核糖核酸酶A的纯化生产工艺，其特征在于：所述洗脱液缓冲液的配方为：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，300mM咪唑，pH 7.8。