CN102241756A - 黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中的高效表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开黄粉虫抗菌肽TmAMP3m及其在大肠杆菌中高效表达的方法。利用GenBank公布的黄粉虫抗菌肽序列设计特异引物，以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因，并将其突变成TmAMP3m，将基因TmAMP3m亚克隆至pET-30a表达载体中，转化到E.coli BL21中表达融合蛋白，经Ni²⁺柱亲和层析纯化融合蛋白，获得TmAMP3m。TmAMP3m具有广谱抑菌活性、能杀耐药菌、热稳定性强、耐强酸强碱。本发明为实现抗菌活性高、稳定性强，使得抗菌肽在产业化生产过程中不易失活，为大规模生产发酵提供了保障，具有广泛的应用价值。

Description

黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中的高效表达及其应用

发明领域

本发明涉及微生物次生物质代谢技术领域。具体的说，本发明涉及一种黄粉虫抗菌肽在大肠杆菌中的高效表达及其高效表达的应用。

背景技术

抗菌肽广泛存在于各种生物体内，如细菌、真菌、昆虫、植物和脊椎动物等，它们具有广谱抗菌活性，对细菌，真菌，病毒，原生动物都有抑杀活性，能保护机体抵御外源微生物的侵略，是宿主体内先天性免疫系统中的重要组成成分，因此，抗菌肽也被称作宿主防御肽。此外，抗菌肽在免疫反应(炎症反应、伤口愈合、获得性免疫系统调控)和维持稳态中也发挥多种功能。

目前，已经从多种生物体内分离鉴定出1200多种抗菌肽，它们通常作用于细胞膜：带正电荷的抗菌肽通过静电作用与磷脂双分子膜结合，同时折叠形成α螺旋或β折叠构象，然后两亲性的抗菌肽插入细胞膜，形成不同孔洞，比如“桶板”模型、“环形孔”模型、“毡毯”模型、“凝聚”模型等，导致内容物外泄，从而抑杀微生物。最近也有研究表明，抗菌肽还可以作用于胞内靶物质，如与DNA、RNA和一些蛋白相互作用，或抑制细胞壁形成，或影响细菌和真菌的细胞周期，或直接抑制一些依赖ATP酶的活性，从而发挥抗菌活性。

抗菌肽凭借其分子量小、具有广谱抗菌活性、能迅速抑杀外源微生物、不易使细菌产生抗性等众多优势受到广泛关注，抗菌肽已被应用于饲料添加剂、转基因动植物的培育、医药研发等各个领域。研究表明在肉鸡日粮中添加抗菌肽，可以增强肉鸡特异性免疫应答；将抗菌肽thanatin基因转入水稻，转基因水稻表现出明显的抗稻瘟病表型，提高了水稻抗病性；此外，抗菌肽ranalexin和溶葡萄球菌酶组合使用，能显著抑杀耐甲氧西林抗生素的葡萄球菌。虽然对抗菌肽的研究显示出其巨大的应用前景，但是它的推广应用也面临众多困难。生物体内天然抗菌肽含量相对很少，直接提取纯化过程繁琐，成本昂贵，得率不高；人工合成的抗菌肽很难保证其生物活性；基因工程手段表达抗菌肽，又面临表达的抗菌肽很可能对宿主菌产生毒害作用，或形成包涵体蛋白，或抗菌肽在纯化过程中丧失活性等问题。此外，小分子量的抗菌肽很容易在纯化过程中被蛋白酶降解，细胞毒性机制和药力学动力都不太清楚成为限制抗菌肽大规模应用的障碍。寻找一种简便高效经济的途径，生产高活性、无细胞毒害作用的抗菌肽成为研究热点。因此，寻求一种大规模制备高活性抗菌肽的途径成为亟待解决的问题。

近年来，对昆虫抗菌肽的研究已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。黄粉虫(Tenebrio molitor)又称面包虫，属鞘翅目拟步甲科粉虫族。虽然早在1995年就公布了黄粉虫抗菌肽基因tenecin3，但至今为止，有关黄粉虫抗菌肽的报道并不多，国内主要集中于饲养方法、诱导条件、初步分离进行了研究报道。虽然黄粉虫分布广，资源丰富，但是，由于天然抗菌肽含量少，提取得率低(0.005％)，成本高，未能实现工业化生产。随着现代生物技术的发展，获得黄粉虫抗菌肽基因的高效表达，为黄粉虫抗菌肽的研究和开发奠定基础，而开发一种经济、简便、高效地表达高活性黄粉虫抗菌肽的途径，对于大规模生产高活性重组抗菌肽具有重要的现实意义。

发明内容

针对现有技术天然抗菌肽含量少，提取得率低，重组抗菌肽的表达量不高的现状，本发明旨在实现突变的黄粉虫抗菌肽基因TmAMP3m在大肠杆菌中的高效表达，通过实现高抗菌活性、稳定性强使得抗菌肽在产业化生产过程中不易失活，为大规模生产发酵提供了保障。

本发明的技术方案：利用GenBank公布的黄粉虫(Tenebrio molitor)抗菌肽基因tenecin3序列设计特异引物，以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆到抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明在219位的碱基由G变为A，所编码的蛋白质富含甘氨酸、谷氨酰胺和组氨酸。为了获得黄粉虫抗菌肽的原核高效表达，本发明设计了特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的发挥，将成熟肽部分N端的一个脯氨酸、一个组氨酸和两个天冬氨酸突变成三个甘氨酸和一个谷氨酰胺；从而获得本发明用于原核细胞高效表达并具有高活性的抗菌肽基因237bp，命名为TmAMP3m。将TmAMP3m亚克隆至pET-30a表达载体中，转化到E.coli BL21中表达融合蛋白，SDS-PAGE检测证明黄粉虫抗菌肽基因TmAMP3m得到了可溶性高效表达，经Ni²⁺柱亲和层析纯化融合蛋白，获得的TmAMP3m。进一步通过对TmAMP3m进行抑菌活性、热稳定性、酸碱稳定性、抗菌活性进行测定，证明加入IPTG后，BL21转化菌生长受到一定程度抑制；TmAMP3m经100℃煮沸10h和强酸强碱处理后，抗菌活性几乎不变；TmAMP3m对耐药菌具有一定抑杀作用。

具体的，本发明提供了一种黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为237bp，其编码由序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中79个氨基酸组成的蛋白质，获得的重组黄粉虫抗菌肽富含甘氨酸、谷氨酰胺和组氨酸。

具体的，本发明提供了突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m基因在大肠杆菌中高效表达的方法，具体步骤如下：

(1)利用GenBank公布的黄粉虫(Tenebrio molitor)抗菌肽tenecin3基因序列(登录号为TMU21482)设计特异引物：

上游引物TF1：5′-ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3′，

下游引物TR1：5′-TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3′；

(2)以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明，与tenecin3相比在219位的碱基由G变为A。

(3)设计特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的发挥，将成熟肽部分N端的一个脯氨酸、一个组氨酸和两个天冬氨酸突变成三个甘氨酸和一个谷氨酰胺；从而获得本发明用于原核细胞高效表达的抗菌肽基因237bp，命名为TmAMP3m。

(4)将TmAMP3m亚克隆至pET-30a表达载体中，得到重组质粒pET30a-TmAMP3m；转化到E.coli BL21中表达融合蛋白；通过SDS-PAGE检测证明黄粉虫抗菌肽基因TmAMP3m得到了可溶性高效表达。

(5)超声波破碎细胞后，经Ni²⁺亲和层析柱纯化，获得TmAMP3m，进行功能活性检测。

进一步，本发明详细提供了突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中的高效表达的方法，具体步骤如下：

(1)PCR引物的设计及基因的扩增

根据GenBank中发表的黄粉虫抗菌肽基因tenecin 3序列(登录号为TMU21482)，设计特异引物：

上游引物TF1：5′-ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3′，

下游引物TR1：5′-TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3′。

向4龄黄粉虫腹部注射5μl金黄色葡萄球菌，注射后正常饲养16h，取一条黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有1mL Trizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡20s，20～25℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm，离心10min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.22mL抽提蛋白质，震荡20s，20～25℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm离心15min，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL，20～25℃室温放置15min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，沉淀部分加入75％乙醇溶液(无RNA酶水配置)1mL，洗涤，4℃，7500rpm，离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余-70℃保存。

反转录合成cDNA。EP管中配制下列模板RNA/引物混合液：10μL总RNA，10μL Oligo dT-Adaptor引物，31.5μL无RNase的水，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5μL上述RNA/引物变性溶液，20μL 5×M-MLV缓冲液，20μL dNTP，2.5μL RNase抑制剂，6μL RNase M-MLV(RNase H-)。42℃保温1h，70℃保温10min后，迅速在冰上急冷2min以上。反转录合成cDNA第一条链，最后以合成的cDNA为模板进行PCR扩增抗菌肽基因。反应条件为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

回收PCR产物，与克隆载体pBS-T过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞。挑取单克隆提取质粒，选用pBS-T载体上的酶切位点(BamH I和Hind III)进行酶切鉴定并进行序列测定。

(2)突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m成熟肽基因的PCR扩增

克隆TmAMP3m基因序列引物：

上游引物71F1-1：

5′-CGCGGATCCGGAGGCCATCAGGGCGGACATCTGGGTGGTCACC-3′

下游引物TR1：5′-TTAATGACCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3′。

PCR反应体系：13.9μL dd H₂O，2μL10×Taq缓冲液，1.5μL dNTPs，0.5μLMg²⁺，0.5μL Primer(71F1-1)，0.5μLPrimer(TR1)，1μLcDNA

PCR反应条件：94℃预变性1min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环。最后72℃温育10min。M为DNA标准分子量DL2000)；C为对照Control；1、2为引物TF1，TR1扩增TmAMP3m。

(3)原核表达载体的构建及鉴定

设计带有酶切位点的特异引物扩增突变黄粉虫抗菌肽成熟肽基因。

上游引物71F1：5′-CGCGGATCCGCTCCTGA CCATCACGACGGACATC-3′，下划线部分为BamH I酶切位点；

下游引物71R1：5′-CCGCTCGAGTTAATGACCATGTGTCTTGTACCC-3′，下划线部分为Xho I酶切位点，

PCR反应体系：14.9μL dd H2O，2μL10×Taq缓冲液，1.5μLdNTPs，0.5μLMg2+，0.5μLPrimer(71F1)，0.5μL Primer(71R1)，0.1μL质粒pBS-T-tenecin 3模板。

PCR反应条件：94℃预变性1min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环。最后72℃温育10min。M是标准核酸分子量Marker DL2000；泳道1是大约237bp大小的突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因TmAMP3m。

用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行PCR产物胶回收，按预先设计好的酶切位点，用Bam H I和Xho I双酶切回收的PCR产物TmAMP3m和表达载体pET30a，在一微量离心管中分别依次加入下列试剂：

轻弹管壁，混匀并离心，37℃酶切6小时。

采用TIANGEN生物公司的PCR产物回收试剂盒，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行回收，然后进行连接反应；在一个微量离心管中依次加入下列试剂：

16℃，过夜连接。

次日，取出连接产物，与35μL感受态细胞E.coli DH5α混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min(不要摇动EP管)。在每管中加入800μL不含抗生素的新鲜LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，4000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。

将过夜长出的阳性克隆挑取到5mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h。菌液PCR方法鉴定重组质粒正确。按照碱裂解法提取质粒DNA。

将提取的质粒pET30a-TmAMP3m与35μL感受态细胞E.coli BL21混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min。在每管中加入800μL不含抗生素的新鲜LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，4000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。次日，挑取单克隆至5mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h，再按1％～2％的体积比转接到新鲜培养基(含Kana)中，37℃，220rpm震荡培养菌液至OD600为0.4～0.6，吸取1mL菌液于干净EP管中，作为诱导前对照样品。然后，往剩余菌液中加入IPTG至终浓度0.8M，于37℃诱导4h。4℃，10000rpm，离心2min，收集菌体。冰浴进行超声波破碎细胞(工作5s，间歇5s，300w)，4℃，12000rpm，离心10min，取上清和沉淀作SDS-PAGE(12％的分离胶)检测。SDS-PAGE电泳检测结果见图4。M是标准蛋白质分子量marker；泳道1是没有诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP3m)；泳道2是0.5mM IPTG诱导的大肠杆菌(含有质粒pET30a-TmAMP3m)表达产物；泳道3是诱导后的上清；泳道4是诱导后的沉淀，表明黄粉虫抗菌肽已高效表达，且大部分是可溶的。

(4)融合蛋白的亲和纯化

将含重组突变的黄粉虫抗菌肽基因载体的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养2～3h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5～1M，于37℃诱导4h。10000rpm离心5min，收集沉淀。

将所收集的沉淀溶于50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，5mM imidazole，pH8.0缓冲液后，4℃下进行超声破菌，超声波超声破菌条件：400W，每5sec间隔5sec共50次。4℃，12000rpm，20min，离心后收集上清，0.45μm滤膜过滤备用。

亲和层析：将超声破菌后获得的上清，在4℃下通过装有预处理的Ni-NTA琼脂糖介质柱中，使其自然通过层析柱。用洗杂液洗涤杂蛋白，洗杂液成分：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0。使用含有500mM的咪唑缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，500mM imidazole，pH 8.0)洗脱抗菌肽。

凝胶过滤层析：将亲和层析所获得的抗菌肽上样于Superdex 75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长300mm，直径10mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0-9.0缓冲液进行洗脱，收集活性峰。将凝胶过滤层析所获得的样品上样于10kD浓缩超滤管中，4℃，3200rpm离心30min，获得重组突变的黄粉虫抗菌肽。

本发明也提供了上述纯化工艺所获得的重组突变黄粉虫抗菌肽相关的生物学特性。具体为，抗菌肽是一小分子肽，具有热稳定性，耐酸、碱特性，耐高盐特性、能杀耐药菌、抗菌谱广。

本发明提供的重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m可在制备治疗病原微生物感染的抗菌药物中具有广泛的应用。由于本发明提供的重组突变的黄粉虫抗菌肽具有广谱抗菌的功能，对所有微生物包括大肠杆菌、氨苄青霉素抗性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等微生物具有显著的抑制作用。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下技术效果：

1.本发明提供了一种突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中高效表达，并且在pH 2-12的环境中，在沸水中煮沸10h，重组黄粉虫抗菌肽的抗菌活力保持不变，说明其具有很强的酸碱稳定性、热稳定性，验证了重组黄粉虫抗菌肽能够在大肠杆菌中高效表达，而且强稳定性使得黄粉虫抗菌肽在产业化生产过程中不易失活，为大规模生产发酵提供了保障。

2.本发明采用基因工程手段，直接扩增不含信号肽的成熟肽序列构建至表达载体，高效表达抗菌肽，并获得了可溶性的抗菌肽，表达的融合蛋白存在于上清中，这就避免了处理包涵体蛋白的复杂步骤，降低了成本，更重要的是消除了在处理包涵体过程中抗菌肽生物活性丧失的危险。

3.现有技术表明，抗菌肽通常有选择性抑杀活性，产生的抗菌肽可以使原核表达菌株产生“自杀现象”，用原核表达系统诱导表达抗菌肽，测定的生长曲线显示诱导表达的抗菌肽对宿主菌产生一定的毒害作用。因此，抗菌肽的抑菌活性也成为采用原核表达系统表达抗菌肽所面临的瓶颈。但是，本发明对抗菌肽进行抑菌活性检测发现，含有抗菌肽基因的宿主菌经诱导后只是菌体生长受到抑制，但是诱导表达的抗菌肽并没有对宿主菌产生毒害作用，这就为抗菌肽的大规模发酵奠定了良好基础。

4.利用突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的热稳定性，本发明将表达的蛋白煮沸10min，离心除去很多不耐热的杂蛋白，然后再上亲和柱纯化，提高了纯化效率，步骤简单，获得的目的蛋白比较纯，大大降低了纯化成本。

5.本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m具有广谱抗菌的功能，对微生物具有显著的抑制作用，所有微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等。重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染(包括耐药菌)的抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂等方面中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1所示为RT-PCR扩增TmAMP3m图，图中，M为DNA标准分子量DL2000)；C为对照Control；1、2为引物TF1，TR1扩增TmAMP3m。

图2所示为pBS-T-TmAMP3m的双酶切鉴定图，图中，M为DNA标准分子量DL2000；1为BamH I和Hind III双酶切鉴定。

图3所示为菌液PCR鉴定重组质粒图，图中，M为DNA标准分子量DL2000；C为对照Control；1为菌液为模板扩增TmAMP3m。

图4所示为融合蛋白的SDS-PAGE检测图，图中，M为蛋白分子量标准；1为未诱导含有重组质粒的BL21转化菌全蛋白；2为诱导含有重组质粒的BL21转化菌全蛋白；3为超声破碎细胞后的上清；4为超声破碎细胞后的沉淀；5为纯化后的融合蛋白。

图5所示为抑菌活性检测图。

图6所示为酸碱稳定性检测图。

图7所示为热稳定性检测图，图中，C为对照PBS Control；1-13为融合蛋白在0h、10min、30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h不同时间中煮沸。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中涉及到的主要原辅材料和设备有：

主要原辅材料：黄粉虫购自于花卉市场，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验室保存。4龄黄粉虫注射5μl金黄色葡萄球菌诱导16h后用于总RNA提取。

主要试剂：限制性内切酶、T₄DNA连接酶、M-MLV反转录酶购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自lnvitrogen公司；Taq酶，pBS-T克隆载体，质粒提取和胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；感受态细胞DH5α和BL21为北京全式金产品；His标签纯化树脂(Ni-NTA Resin)购自QIAGEN公司。其余常用试剂均为国产或进口分析纯。

主要仪器：PCR仪、高压灭菌锅、气浴恒温振荡器、电子天平、微波炉、超纯水仪、超净工作台、恒温培养箱、热空气消毒柜、台式冷冻离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中的高效表达

参见附图1-4：

(1)利用GenBank公布的黄粉虫(Tenebrio molitor)抗菌肽序列(登录号为TMU21482)设计特异引物：

上游引物TF1：5′-ATGAAAACATTCGTGATTTGCTTGATTCTGG-3′，

下游引物TR1：5′-TTAATGA CCATGTGTCTTGTACCCTCCTTGG-3′；

(2)以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽基因tenecin3

操作前实验台用紫外灯照射30min后，取一条大约5龄的黄粉虫幼虫，放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，粉末移入装有1mLTrizol试剂的Eppendorf管中，盖紧盖激烈震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000r/min离心15min，小心的将上清移入干净Eppendorf管中，加入氯仿0.22mL抽提蛋白质，震荡15s，15～30℃室温放置3～5min，4℃、12000rpm离心10min，溶液分成上、中、下三层，其中无色上层即为含RNA层。将此层移入洁净的1.5mL的Eppendorf管中，加入异丙醇0.5mL，15～30℃室温放置10min，4℃、12000rpm离心10min。弃上清，沉淀部分加入75％乙醇溶液(无RNA酶水配置)1mL，洗涤，4℃、7500r/min离心5min。弃上清，待沉淀干燥后，加入无RNA酶水，轻轻混匀，使其充分溶解，A260/A280鉴定RNA纯度，琼脂糖凝胶电泳检测，其余-70℃保存。

反转录合成cDNA。EP管中配制下列模板RNA/引物混合液：10μL总RNA，10μL Oligo dT-Adaptor引物，31.5μL无RNase的水，70℃保温10min后迅速在冰上急冷2min以上。离心数秒使模板RNA/引物的变性液聚集于管底。再加入51.5μL上述RNA/引物变性溶液，20μL5×M-MLV缓冲液，20μLdNTP，2.5μL RNase抑制剂，6μLRNase M-MLV(RNase H-)。42℃保温1h，70℃保温10min后，迅速在冰上急冷2min以上。反转录合成cDNA第一条链，最后以合成的cDNA为模板进行PCR扩增抗菌肽基因。反应条件为：95℃预变性1min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。取5μLPCR扩增产物加6×Loading Buffer，在1％琼脂糖凝胶进行电泳。采用TIANGEN生物公司的回收试剂盒，回收PCR产物，连接T载体，测序分析结果证明我们获得了与tenecin3相比，在219位的碱基由G变为A、约237bp大小的基因片段序列。

(3)突变的黄粉虫抗菌肽成熟肽基因的PCR扩增

上游引物71F1：5′-CGCGGATCCGCTCCTGA CCATCACGACGGACATC-3′，下划线部分为BamH I酶切位点；

下游引物71R1：5′-CCG CTCGAGTTAATGACCATGTGTCTTGTACCC-3′，下划线部分为Xho I酶切位点，

PCR反应体系：14.9μL dd H₂O，2μL10×Taq缓冲液，1.5μLdNTPs，0.5μLMg²⁺，0.5μL Primer(71F1)，0.5μLPrimer(71R1)，0.1μL质粒pBS-T-TmAMP3模板。

PCR反应条件：95℃预变性1min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸40s，30个循环。最后72℃温育10min。

(4)原核表达载体的构建

用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自TIANGEN生物公司)进行PCR产物胶回收，按预先设计好的酶切位点，用Bam H I和Xho I双酶切回收的PCR产物TmAMP3m和表达载体pET30a，在一微量离心管中分别依次加入下列试剂：

轻弹管壁，混匀并离心，37℃酶切6小时。

采用TIANGEN生物公司的PCR产物回收试剂盒，对双酶切的TmAMP1m，pET30a进行回收，然后进行连接反应；在一个微量离心管中依次加入下列试剂：

16℃，过夜连接。

次日，取出连接产物，与35μL感受态细胞E.coliDH5α混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min(不要摇动EP管)。在每管中加入800μL不含抗生素的新鲜LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，3000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。

将过夜长出的阳性克隆挑取到6mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h。菌液PCR方法鉴定重组质粒正确。按照碱裂解法提取质粒DNA。

获得的重组突变黄粉虫抗菌肽编码79个氨基酸，富含甘氨酸、谷氨酰胺和组氨酸。

其DNA碱基序列：

GGA GGC CAT CAG GGC GGA CAT CTG GGT GGT CAC CAA ACC GGT

CAC CAA GGC GGC CAA CAG GGT GGT CAT CTG GGG GGT CAA CAG

GGT GGA CAC CTA GGG GGT CAC CAG GGC GGC CAA CCA GGC GGA

CAT TTA GGA GGC CAT CAG GGC GGA ATC GGA GGC ACC GGA GGA

CAG CAA CAC GGG CAG CAT GGA CCT GGG ACC GGT GCA GGA CAC

CAA GGA GGG TAC AAG ACA CAT GGT CAT

其氨基酸序列：

GGHQGGHLGG    HQTGHQGGQQ    GGHLGGQQGG    HLGGHQGGQP

GGHLGGHQGG    IGGTGGQQHG    QHGPGTGAGH    QGGYKTHGH

实施例二：重组质粒pET30a-TmAMP3m的原核表达

将提取的质粒DNA DH5α/pET30a-TmAMP3m与35μL感受态细胞E.coliBL21混匀，冰浴30min，然后42℃水浴热休克45s，迅速取出冰浴3min(不要摇动EP管)。在每管中加入800μL不含抗生素的新鲜LB培养液，混匀，37℃温和振荡培养1h。4℃，3000rpm，离心1min，吸弃600μL上清，轻轻吹打混匀剩余菌液，在准备好的固体LB培养基(含卡那霉素)上均匀的涂布，37℃过夜培养。次日，挑取单克隆至6mLLB培养基(含卡那霉素)中培养12-16h，再按1％～2％的体积比转接到新鲜培养基(含Kana)中，37℃，220r/min震荡培养菌液至OD600为0.4～0.6，吸取1mL菌液于干净EP管中，作为诱导前对照样品。然后，往剩余菌液中加入IPTG至终浓度0.8M，于37℃诱导4h。4℃，10000r/min，离心2min，收集菌体。冰浴进行超声波破碎细胞(工作5s，间歇5s，300w)，4℃，12000r/min，离心10min，取上清和沉淀作SDS-PAGE(12％的分离胶)检测。

实施例三：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的抗菌活性检测方法

首先取出通过表达获得的抗菌肽3μl。以金黄色葡萄球菌为实验菌种，在LB液体培养基中，培养至OD600＝0.5，参照琼脂孔穴扩散法，取10μl菌悬液与3ml固体培养基(含0.8％琼脂)在45℃混匀，并铺在直径6cm无菌培养皿中，待凝固后于4℃保存备用；使用时，在平皿中打直径为2mm的若干小孔，并在孔中分别滴入3μl待测产物，37℃条件下培养12-16h。测量抑菌圈大小。根据抑菌圈的大小判定抗菌肽的活性，参见附图7。

实施例四：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的高效表达及纯化

将含重组突变的黄粉虫抗菌肽基因载体的阳性克隆在37℃培养过夜，再以1％比例接种，37℃培养2～3h，当菌液的吸光度(A₆₀₀)值达到0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5～1M，于37℃诱导4h。10000rpm离心5min，收集沉淀。

将所收集的沉淀溶于50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，5mM imidazole，pH8.0缓冲液后，4℃下进行超声破菌，超声波超声破菌条件：400W，每5sec间隔5sec共50次。4℃，12000rpm，20min，离心后收集上清，0.45μm滤膜过滤备用。

亲和层析：将超声破菌后获得的上清，在4℃下通过装有预处理的Ni-NTA琼脂糖介质柱中，使其自然通过层析柱。用洗杂液洗涤杂蛋白，洗杂液成分：50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，20mM imidazole，pH 8.0。使用含有500mM的咪唑缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，500mM imidazole，pH 8.0)洗脱抗菌肽。

凝胶过滤层析：将亲和层析所获得的抗菌肽上样于Superdex 75凝胶过滤柱，凝胶过滤柱长300mm，直径10mm，用10-100mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0-9.0缓冲液进行洗脱，收集活性峰。将凝胶过滤层析所获得的样品上样于10kD浓缩超滤管中，4℃，3300rpm离心30min，获得重组突变的黄粉虫抗菌肽，参见附图4。

实施例五：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的抑菌作用

抗菌肽通常有选择性抑杀活性，产生的抗菌肽可以使原核表达菌株产生“自杀现象”，用原核表达系统诱导表达抗菌肽，测定的生长曲线显示诱导表达的抗菌肽对宿主菌产生一定的毒害作用。因此，抗菌肽的抑菌活性也成为采用原核表达系统表达抗菌肽所面临的瓶颈。本发明将含有pET30a-TmAMP3m质粒的大肠杆菌BL21及BL21空白菌接种LB，37℃震荡培养2h，加IPTG诱导，每隔0.5h取菌液测其OD值并记录数据，并设未诱导的含pET-30a-TmAMP3m质粒的BL21转化菌为对照。对抗菌肽进行抑菌活性检测发现含有抗菌肽基因的宿主菌经诱导后只是菌体生长受到抑制，但是诱导表达的抗菌肽并没有对宿主菌产生毒害作用，这就为抗菌肽的大规模发酵奠定了良好基础，参见附图5。

实施例六：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的抗菌活性检测

参照实施例三的抗菌活性检测方法检测重组突变的黄粉虫抗菌肽的抗菌活性，本发明提供的一种重组突变的黄粉虫抗菌肽具有广谱抗菌的功能，对微生物具有显著的抑制作用，所有微生物包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、谷氨酸棒杆菌、苏云金杆菌、葡萄球菌、杆状菌、棒状杆菌等。重组突变的黄粉虫抗菌肽在制备治疗病原微生物感染(包括耐药菌)的抗菌药物、饲料添加剂、保鲜剂等方面中具有广泛的应用前景。

实施例七：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的酸碱稳定性

将融合蛋白与pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12缓冲液混合，静置10min后，4℃，12000r/min，离心10min，收集上清，进行抗菌活性检测。参照实施例三的抗菌活性检测方法进行抗菌活性检测。

本发明实现了突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中高效表达，并且在pH 2-12的环境中，重组黄粉虫抗菌肽的抗菌活力保持不变，说明其具有很强的酸碱稳定性，验证了重组黄粉虫抗菌肽能够在大肠杆菌中高效表达，而且强稳定性使得黄粉虫抗菌肽在产业化生产过程中不易失活，为大规模生产发酵提供了保障，参见附图6。

实施例八：重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的热稳定性

将重组突变的黄粉虫抗菌肽置于100℃沸水浴中，分别于1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，8h，9h，10h取样15μL，4℃，12000r/min，离心10min，收集上清，参照实施例三的抗菌活性检测方法进行抗菌活性检测。

本发明实现了突变黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在大肠杆菌中高效表达，并且在沸水中煮沸10h，重组黄粉虫抗菌肽的抗菌活力保持不变，说明其具有很强的热稳定性，验证了重组黄粉虫抗菌肽能够在大肠杆菌中高效表达，而且强稳定性使得黄粉虫抗菌肽在产业化生产过程中不易失活，为大规模生产发酵提供了保障，参见附图7。

Claims (3)

1.一种突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m，其特征在于，所述的突变的黄粉虫抗菌肽具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，全长为237bp，其编码由序列表中序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中79个氨基酸组成的蛋白质，所述的重组黄粉虫抗菌肽富含甘氨酸、谷氨酰胺和组氨酸。

2.一种如权利要求1所述的突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m的获得方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)利用GenBank公布的黄粉虫(Tenebrio molitor)抗菌肽tenecin3序列设计特异引物；以RT-PCR法从黄粉虫体内克隆了抗菌肽的cDNA分子，序列分析表明，与tenecin3相比在219位的碱基由G变为A；

(2)设计特异性突变引物用于扩增其成熟肽部分核酸序列，以利其高抗菌活性的发挥，将成熟肽部分N端的一个脯氨酸、一个组氨酸和两个天冬氨酸突变成三个甘氨酸和一个谷氨酰胺；从而获得本发明用于原核细胞高效表达的抗菌肽基因237bp，命名为TmAMP3m；

(3)将TmAMP3m亚克隆至pET-30a表达载体中，得到重组质粒pET30a-TmAMP3m；转化到E.coli BL21中表达融合蛋白；通过SDS-PAGE检测证明黄粉虫抗菌肽基因TmAMP3m得到了可溶性高效表达；

(4)超声波破碎细胞后，经Ni²⁺亲和层析纯化，获得TmAMP3m。

3.如权利要求1所述的重组突变的黄粉虫抗菌肽TmAMP3m在制备治疗病原微生物感染的抗菌药物中的应用。

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