CN110295158A

CN110295158A - 黄粉虫ym45蛋白、其编码基因及应用

Info

Publication number: CN110295158A
Application number: CN201910681661.8A
Authority: CN
Inventors: 杨伟; 王南溪; 杨桦; 杨春平; 方睿; 钱丽芝; 朱晓庆; 管凤荣; 王保新
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110295158B

Abstract

本发明公开了黄粉虫YM45蛋白、编码该蛋白的基因、及黄粉虫YM45蛋白及其编码基因的应用，YM45蛋白为能引起人体过敏的黄粉虫致敏蛋白。本发明黄粉虫YM45蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明的编码YM45蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明首次公开了黄粉虫特异性致敏蛋白及其编码基因，可实现培育无致敏系黄粉虫。通过该致敏蛋白的氨基酸序列和对应的基因序列可推测出其他资源昆虫的致敏蛋白，可在一定程度上降低由昆虫蛋白的潜在致敏性引发的虫源蛋白食品的开发与利用的风险。

Description

黄粉虫YM45蛋白、其编码基因及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及黄粉虫YM45蛋白、其编码基因及应用。

背景技术

鞘翅目，拟步行虫科，粉甲属的黄粉虫(Tenebrio molitor L.)俗称面包虫，是继家蚕和蜜蜂之后的第三大经济昆虫。具有体内蛋白含量高、种类丰富多样、营养保健功效好等优点，被认为是未被充分开发利用的新型蛋白源。但该类蛋白食物与其他含蛋白质的食品一样具有引起少数食用者过敏的潜在风险(Sicherer,2011)，如何预测诊断与解决这一局限性问题成为缓解蛋白资源短缺的迫切需要。目前已有的关于四目、十种常见食用昆虫的研究发现，在不讨论交叉过敏反应的情况下，原肌球蛋白和精氨酸激酶(tropomyosinand arginine kinase)几乎是大部分昆虫导致人体过敏的过敏原(de Gier andVerhoeckx,2018；Liu et al.,2009)；肌球蛋白(myosin)则是粉虫(黄粉虫、大麦虫(Zophobas atratus)、小粉虫(Alphitobius diaperinus))、蟑螂(Periplaneta americanaand/or Blatella germanica)、蝗虫(Locusta migratoria)等的致敏蛋白(Broekman etal.,2015；Huss et al.,2001)；丙酮酸激酶(pyruvate kinase)、血淋巴蛋白(hemolymphprotein)、糖蛋白(glycoprotein)、几丁质酶(chitinase)也被检测出可能是一些食用昆虫的致敏蛋白(Jeong et al.,2016；Phiriyangkul et al.,2015)；另外，卵黄蛋白原(vitellogenin)、血蓝蛋白(hemocyanin)可能是蟑螂和白蚁(Coptotermes formosanus)的特异性致敏蛋白(Mattison et al.,2017；Jiing-Guang et al.,2011)，角质层蛋白(cuticle protein)、六聚体1B(hexamerin 1B)分别是黄粉虫、蟋蟀(Acheta domesticus)的特异性致敏蛋白(Srinroch et al.,2015；Verhoeckx et al.,2014)。

现有技术中，关于昆虫致敏蛋白的研究甚少，且暂无黄粉虫近缘物种的相关研究作为参照进行比对研究。另外，在日常食用某一昆虫食品时，由于其他虫源蛋白或者含有过敏原的食物的交叉影响也会干扰过敏的预测与诊断。同时，已有的大多数研究未能明确吸入型过敏、接触型过敏和摄入型过敏之间是否存在相互影响，或者这类有过敏症状的个体是否存在有各种共存疾病的可能。上述情况增大了昆虫特异性过敏原的定位筛选的难度，并且导致了现有的大多数相关研究中测定的昆虫过敏原大多是在有交叉过敏的情况下检测出来的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了黄粉虫YM45蛋白及编码该蛋白的基因，该蛋白为能引起人体过敏的黄粉虫致敏蛋白。

本发明还提供了黄粉虫YM45蛋白及其编码基因的应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的黄粉虫YM45蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明所述的编码上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；或该核苷酸序列经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明所述的含有上述基因的载体、工程菌或转基因细胞系。

本发明所述的YM45蛋白在黄粉虫分子育种的应用。

本发明所述的基因在黄粉虫分子育种的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了黄粉虫特异性致敏蛋白及其编码基因，可实现培育无致敏系黄粉虫。通过该致敏蛋白的氨基酸序列和对应的基因序列可推测出其他资源昆虫的致敏蛋白，可在一定程度上降低由昆虫蛋白的潜在致敏性引发的虫源蛋白食品的开发与利用的风险。

附图说明

附图1为本发明的丙烯葡聚糖凝胶S-200层析分离纯化图；其中，Peak 1～5分别指丙烯葡聚糖凝胶S-200层析检测的5个峰。

附图2为本发明的AKTA explorer快速蛋白液相色谱系统分离纯化图；其中，Peak1Q1～Q7分别指PANEL A中AKTA explorer检测的7个峰；Peak2Q1～Q10分别指PANEL B中AKTAexplorer检测的10个峰；Peak3Q1～Q10分别指PANEL C中AKTA explorer检测的10个峰；Peak4Q1～Q5分别指PANELd中AKTA explorer检测的5个峰；Peak5Q1～Q5分别指PANEL E中AKTA explorer检测的5个峰。

附图3为本发明的黄粉虫纯化蛋白SDS-PAGE电泳图谱；其中附图3a中①～分别为总蛋白、peak1、peak1Q5、peak1Q6、peak2Q7、peak2Q8、peak2Q9、peak3、peak3Q4、peak3Q7、peak4、peak4Q3、peak4Q4、peak5，是蛋白标记；附图3b中①～分别为总蛋白、peak1、peak1Q5、peak4、peak2Q7、peak2Q8、peak3Q4、peak3、peak1Q7、peak2Q4、peak2Q5、peak3Q6、peak4Q2、peak5Q2，是蛋白标记。

附图4为本发明的分离纯化的黄粉虫蛋白组分与特异性人体血清样本的16阵列扫描图；其中注：a图及b图的左图均为16阵列图，每一个阵列对应右图一种血清样品，自上而下分别为空白对照、阳性对照、试验组；每一个点位对应右图中相应的一种蛋白。

附图5为本发明的分离纯化的黄粉虫蛋白组分与特异性人体血清样本的免疫印迹图；其中，①～分别为总蛋白、peak1、peak1Q5、peak4、peak2Q7、peak2Q8、peak3Q4、peak3、peak1Q7、peak2Q4、peak2Q5、peak3Q6、peak4Q2、peak5Q2，是蛋白标记。

附图6为本发明的peak3-20组分序列与来源于黄粉虫丝氨酸蛋白酶(ABC88745.1)的匹配图。

附图7为本发明的peak3-30组分序列与来源于黄粉虫丝氨酸蛋白酶(ABC88747.1)的匹配图。

具体实施方式

本发明的思路在于，先后采用液相色谱法(Sephacryl S-200液相柱层析和AKTAexplorer系统)分离纯化黄粉虫的总蛋白提取液，得到分离纯化的有效蛋白组分32种。然后，利用对黄粉虫蛋白质有过敏史和无过敏史的患者的血清样品，结合免疫学中的Microarray和Western免疫印迹法来先后分析检测32个蛋白组分后发现，有2个蛋白组分能与对黄粉虫蛋白质有过敏史的特异性人体血清产生免疫荧光反应，对应的纯化蛋白的相对分子质量分别约为20kDa和30kDa。最后，通过MALDI-MS的测序结果可知，这两个引起特异性人体血清样本产生免疫反应的黄粉虫蛋白组分均对应丝氨酸蛋白酶。

实施例1

本实施例公开了黄粉虫总蛋白提取、纯化，具体如下：

A、黄粉虫总蛋白提取

选取鲜活的黄粉虫老熟幼虫在液氮中急速冷冻干燥并研磨成粉末。然后，在10g虫粉中加入150mL裂解缓冲液(150mL pH为7.4的含0.5％TritonX-100的磷酸盐缓冲溶液和3片Thermo Fisher Scientific公司产的不含EDTA的蛋白酶抑制片剂)，使用MSE Soniprep150超声波匀浆仪超声破碎。使用超声波匀浆仪时，将虫粉和150mL的裂解缓冲液的混合液分装在4个50mL的离心管，整个超声破碎的过程离心管均放置在有冰的盒子里保持低温。同时，每处理15秒后暂停仪器冷却30秒，如此循环直到虫粉彻底溶解在裂解缓冲液中。

混合液在Allegratm 64R低温台式离心机中离心15分钟(1000rpm，4℃)后，取上清液，并将上清液通过0.45μm的Nalgene注射过滤器过滤。得到的黄粉虫总蛋白溶液放置在-20℃的冰箱里待用。

B、黄粉虫总蛋白分离纯化

获得的蛋白质溶液采用快速蛋白液相色谱法(FPLC)用丙烯葡聚糖凝胶液相柱(Sephacryl S-200)进行第一次分离纯化，预留足够量的黄粉虫总蛋白样品用于后续试验。整个过程用磷酸盐溶液(pH 7.4)为缓冲溶液，流速为120mL/h。将黄粉虫总蛋白溶液经过Sephacryl S-200层析后，由得到的分离纯化图谱的扫描图(附图1)可看出，检测器检测出了5个峰(Peak 1～5)。根据层析原理，5个峰分别对应5类大分子粗蛋白。收集这5个峰对应的样品，分别渗析72h(中间更换3次用于渗析的超纯水)后分装在50mL离心管。

将第一次分离纯化的得到的5个蛋白组分样品使用AKTA explorer快速蛋白液相色谱系统(Mono Q 55液相柱)再次进行分离纯化。第二次分离纯化的过程中，暂未使用的蛋白组分样品置于-20℃的冰箱里保存待用。分离纯化的过程中使用A、B两种缓冲液，缓冲液A为pH8的Tris缓冲液，缓冲液B为每1000mL中有20mM NaCl的Tris溶液，流速为60mL/h。AKTAexplorer系统运行后，先使用缓冲液A洗泵5min，进样后使用缓冲液B进行分离层析。每次加黄粉虫总蛋白样品前都要使用缓冲液A洗泵5min，一次加样5mL，加样次数根据需要得到的黄粉虫蛋白组分样品的量决定。将第二次分离纯化得到的蛋白组分样品经过渗析后装入25mL的平底离心管中，置于-80℃的冰箱中冷冻过夜，次日使用CRYODOS冷冻干燥机冷冻干燥得到黄粉虫蛋白组分粉末。用200μL超纯水溶解后将蛋白组分样品保存在-20℃。

将通过Sephacryl S-200层析分离纯化的5个黄粉虫大分子粗蛋白样品用AKTAexplorer快速蛋白液相系统分离纯化后，根据得到的分离纯化图(附图2)可知，Peak1(PANEL A)被检测出了7个峰(Peak1 Q1～Q7)；Peak2(PANEL B)被检测出了10个峰(Peak2Q1～Q10)；Peak3(PANEL C)被检测出了10个峰(Peak3 Q1～Q10)；Peak4(PANELd)被检测出了5个峰(Peak4 Q1～Q5)；Peak5(PANEL E)被检测出了5个峰(Peak5 Q1～Q5)。根据层析原理，每个峰分别对应1种蛋白组分，因此，经过AKTA explorer快速蛋白液相色谱系统分离纯化后获得了37个黄粉虫蛋白组分的样品。剔除其中5个浓度为负值的蛋白组分，得到32个黄粉虫蛋白组分样品。

实施例2

本实施例公开了蛋白样品的SDS-PAGE检测。

参照Thermo公司提供的实验操作手册的实验方法并优化改进，选取黄粉虫总蛋白样品、第一次分离纯化得到的蛋白组分样品(4个样)和第二次分离纯化后得到的浓度较高的蛋白组分样品(9个样)，共14个样。这14个样品分别为：总蛋白、peak1、peak1Q5、peak1Q6、peak2Q7、peak2Q8、peak2Q9、peak3、peak3Q4、peak3Q7、peak4、peak4Q3、peak4Q4、peak5。

每个样品取6.5μL加入3μL样品缓冲液(Pierce^TM SDS-PAGE Sample Prep Kit)和0.5μL二硫苏糖醇(DTT)，将混合液置于PCR仪中70℃加热12min。同时，配制1L电泳缓冲液(50mL NuPAGE SDS溶液和950mL超纯水)，用配制好的缓冲液清洗凝胶(NuPAGE 4-12％Bis-Tris)，然后将凝胶放入电泳仪并倒满配制好的缓冲液。用移液枪将加热好的14个混合样品(每个样品10μL)分别打入凝胶孔，最后一个孔打入10μL NOVEX sharp蛋白标准样，加样完毕后，200V恒压直至指示剂距离胶底部约1cm时结束电泳。

取出凝胶，放入考马斯亮蓝R250染色过夜，次日，脱色并扫描，结果如附图3a所示。

附图3a中①～分别为总蛋白、peak1、peak1Q5、peak1Q6、peak2Q7、peak2Q8、peak2Q9、peak3、peak3Q4、peak3Q7、peak4、peak4Q3、peak4Q4、peak5，是蛋白标记。

⑩～号蛋白样品的电泳图谱颜色较浅与分光光度计测定的浓度较低的结果一致，因此，再次结合两个结果挑选出6个蛋白样品进行替换，得到结果如附图3b所示。附图3b中①～分别为总蛋白、peak1、peak1Q5、peak4、peak2Q7、peak2Q8、peak3Q4、peak3、peak1Q7、peak2Q4、peak2Q5、peak3Q6、peak4Q2、peak5Q2；是蛋白标记。

其中，图3a中1、2、3、5、6、8、9、11和图3b中的1、2、3、5、6、8、4分别为两两相同的蛋白样品，由电泳图谱图3a、图3b可看出两次蛋白条带一致，说明试验可重复性较好。

同时，由附图3黄粉虫纯化蛋白SDS-PAGE电泳图谱可以看出，条带大小分布均匀、清晰，无弥散，说明经过两次分离纯化后得到了符合后续试验要求的黄粉虫蛋白样品。

实施例3

本实施例公开了试验用人体血清的抽提方法，具体为：

根据拟定的生物医学研究方案，筛选出有黄粉虫过敏史(试验组)和无黄粉虫过敏史(阳性对照组)的受试者各5名。具体方法为：通过自愿的原则筛查出具有食用黄粉虫经历的60名志愿者，询问了解他们在曾经食用黄粉虫后是否有与过敏相关的不良反应，且身体健康，无呼吸道疾病、血液系统疾病等不满足试验筛选条件的病史，志愿者不是嗜烟、酗酒者。同时，在本试验开始的四周内不参加任何其他临床试验。

使用10mL的真空玻璃抽血管(红帽)采集每位受试者的全血40mL(4管，10mL/管)，静置2小时后获得的每人不少于16mL的血清样本用2mL的血清管分装标号。所有血清样本标号后置于-80℃的冰箱保存。人体血清的采集及后续研究需获得伦理委员会的审批和监督，实验开展前应按照规定与受试者签订受试者知情同意书。

实施例4

蛋白微阵列试验

在Biomek自动化工作站中将20μL蛋白组分样品置于16孔硝化纤维素涂层载玻片中后，将含有蛋白组分的载玻片放入载玻片盒并将含有3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为封闭液倒满载玻片盒，避免有气泡。将载玻片盒置于37℃恒温箱中封闭载玻片表面的蛋白组分样品3h。3h后，在37℃的温度下用含有的0.05％PBST(Tween 20：PBS＝0.05％m/V，250mg/500ml)洗涤载玻片2min，重复3次。用超纯水洗涤5min，然后将载玻片取出，离心甩干10min。

将载玻片卡入加样盒，分别用150μL PBST湿润载玻片上16个含有蛋白组分的印样孔，倒掉PBST后3、6-14号孔分别加入100μL用含有2％BSA的0.2％PBST稀释的10位志愿者的人体血清(30％血清)，4、5号孔加入空白对照溶液(30％PBS)，用胶带密封。在加湿温控仪(Thermo Hybaid HyPro-20)中37℃震荡加热3h后，在洗板机(BioTek ELx50)中用0.05％PBST清洗载玻片3次。再在每个孔中加入100μL浓度为2mg/mL的稀释第二抗体(Anti-HumanIgE，购于Vector Laboratories，美国)，放入加湿温控仪中37℃震荡加热30min，取出。先用0.05％PBST清洗3次，再用超纯水清洗3次，离心甩干10min，用GenePix 4000B生物芯片扫描仪扫描读取数据。

将十位受试者的血清样品分别与32个黄粉虫蛋白组分样品结合(筛除了37个黄粉虫蛋白组分中5个蛋白质浓度为负值的样品)，其中，两位具有黄粉虫过敏史的受试者与蛋白样品产生了免疫反应。具体如附图4分离纯化的黄粉虫蛋白组分与特异性人体血清样本的16阵列扫描图所示。由附图4a可以看出，与空白对照、阳性对照相比，编号为HFC-05的受试者血清样品与蛋白样品peak2Q4产生了免疫荧光反应；由附图4b可以看出，编号为HFC-07的受试者血清样品与蛋白样品peak3Q6产生了免疫荧光反应。根据蛋白微阵列实验的免疫荧光原理，受试者的血清在与能引起其产生过敏反应的蛋白结合时，接触位点将产生能被扫描读取的免疫荧光。说明，蛋白样品peak2Q4和peak3Q6分别能引起受试者HFC-05和HFC-07产生过敏反应。

实施例5

Western免疫印迹试验

SDS-PAGE：将十位受试者的血清样品分别与包括蛋白微阵列试验中与人体血清产生特异性免疫荧光反应的两种蛋白样品在内的14种黄粉虫蛋白组分样品进行免疫印迹试验，结合蛋白微阵列试验的结果，两次实验筛选出的有较为明显的针对某些蛋白质组分产生免疫荧光反应的血清一致。具体实验结果只呈现产生免疫荧光反应的实验组(HFC-05、HFC-07)，任意挑选1个无任何免疫荧光反应的阳性对照(HFC-10)，不加入人体血清仅加入稀释液的空白对照(阴性对照组)。电泳大约需要40min。

蛋白筛选标准：分离纯化的蛋白组分样品SDS-PAGE检测中，第二次检测时所用的蛋白样品(包括蛋白微阵列试验中与人体血清产生特异性免疫荧光反应的两种蛋白样品)；

蛋白筛选结果：总蛋白、peak1、peak1Q5、peak4、peak2Q7、peak2Q8、peak3Q4、peak3、peak1Q7、peak2Q4、peak2Q5、peak3Q6、peak4Q2、peak5Q2。

电转移：在进行电泳的过程中，配制1L转移缓冲液(50mL NuPAGE Tansfer Buffer和950mL超纯水)，并准备好电转移模具，将硝酸纤维素膜用甲醇湿润后，与电转移板、滤纸一起浸泡在转移缓冲液中待用。

电泳结束后，将凝胶按照自下而上为转移板+滤纸+凝胶+硝酸纤维素膜+滤纸+转移板放入电转移模具后放置在电泳仪中并倒满配制好的转移缓冲液。30V恒压，约1h。

酶免疫定位：将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜从电泳仪中取出晾干，然后放入50mL的离心管，倒入PBS清洗2次倒掉溶液后加入5mL含有3％BSA的PBS，在37℃恒温下旋转加热3h。倒掉离心管中的溶液并用PBS清洗1次，加入5mL稀释人体血清后置于冷藏间低温过夜。

次日，倒出人体血清，硝酸纤维素膜用0.2％PBST在37℃下清洗3次，每次10min。然后，加入5mL稀释的第二抗体，放入37℃恒温箱中旋转加热3h。

3h后，用0.2％PBST清洗3次(37℃，每次10min)后，加入5mL链霉抗生物素蛋白(Streptavidin HRP，Bio-Rad)的稀释液(在含有1％BSA的0.2％PBST中以400:1的比例加入链霉抗生物素蛋白溶液)，置于37℃下1h。

1h后，倒出链霉抗生物素蛋白稀释液，用0.2％PBST在37℃下清洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。用Bio-Rad ECL化学发光底物(Clarity Western ECL Substrate)染色后在凝胶成像系统中扫描分析。

将所有的受试者血清分别与挑选出的14种蛋白组分样品进行免疫印迹试验，其中，两位具有黄粉虫过敏史的受试者与蛋白样品产生了相应的免疫反应。通过凝胶成像系统中扫描后得到的图谱(附图5)可以看出，附图5a中的实验组HFC-05与阳性对照组和阴性对照组相比，⑧号(peak3)条带中在相对分子质量约为20kDa的位置产生了免疫反应；附图5b中的实验组HFC-07与阳性对照组和阴性对照组相比，同样的在⑧号(peak3)条带中产生了免疫反应，产生免疫反应的蛋白组分的相对分子质量约为30kDa。

另外，与实验组的受试者的血清样品进行Western blotting试验后⑩号(peak2Q4)条带中均未产生免疫位点，说明无免疫印迹反应。

实施例6

基质辅助激光解析/电离质谱测序

将从SDS-PAGE凝胶中提取的蛋白样品浓缩液经过酶解(胰蛋白酶)后进行质谱检测，然后对获得的质谱数据进行解析和Mascot检索。

通过Mascot搜索，并在Non-redundant protein sequences数据库(NCBI)中进行Blast比对分析。结果表明免疫印迹测定中的peak3-20组分序列与来源于黄粉虫丝氨酸蛋白酶(ABC88745.1)的匹配度为12％，详见附图6中框线部分；peak3-30组分序列与来源于黄粉虫丝氨酸蛋白酶(ABC88747.1)的匹配度为21％，详见附图7中框线部分。推测两个引起特异性人体血清样本产生免疫反应的黄粉虫蛋白组分样品均为丝氨酸蛋白酶。

本发明黄粉虫致敏蛋白：黄粉虫YM45蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。通过利用在线分析平台ExPASy中的ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)分析可知，YM45的相对分子质量为27968.97，共265个氨基酸残基。分子式(Formula)为C₁₂₅₁H₁₉₈₃N₃₂₁O₃₈₅S₉，分子总原子数为3949个。各氨基酸含量如表1所示。理论等电点(Theoretical pI)为4.39；带电荷氨基酸残基共43个，其中带负电荷的氨基酸残基有28个(Asp+Glu)，带正电荷的氨基酸残基共15个(Arg+Lys)。

表1 ABC88745.1氨基酸组成

将YM45蛋白的氨基酸序列ABC88745.1导入黄粉虫蛋白组数据库，使用GO、COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、KEGG和IPR(Interproscan软件)数据库分别进行蛋白功能、结构、通路注释。可知YM45蛋白参与生物过程中的蛋白水解，且具有分子功能——丝氨酸型内肽酶活性(GO注释，即GeneOntology基因本体)。另外，该蛋白属于COG注释(即Cluster of Orthologous Groups原核生物直系同源)26大类中的翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣蛋白(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)中的分泌胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(serine proteinase)。

将测得的YM45蛋白的氨基酸序列导入黄粉虫转录组数据库，与组装得到的Unigenes的序列进行了blast比对，出现多个对应基因时选择得分最高的进行后续的Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)、Swiss-Prot(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)、NT(NCBInucleotide sequences)、NR(NCBI non-redundant protein sequences)、KOG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、GO(www.geneontology.org)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)注释分析可知，与该氨基酸序列(SEQ ID NO:1所示)最相似的基因是Cluster-24946.22118，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，同源性为100％。从结果来看，可以认为YM45蛋白的编码基因就是Cluster-24946.22118，该序列可编码阿法肽域、细胞黏附素、胰蛋白、短尾脲、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，参与生物过程中的通过质膜细胞粘附分子的嗜异性细胞—细胞粘附和蛋白水解，具有蛋白质结构域特异性结合和丝氨酸型内肽酶活性的分子功能，是细胞组分中膜的组成部分。

本发明黄粉虫致敏蛋白：YM47蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。通过利用在线分析平台ExPASy中的ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)分析可知，YM47蛋白相对分子量为28182.32，有266个氨基酸残基。分子式(Formula)为C₁₂₄₁H₁₈₉₇N₃₃₅O₃₉₇S₁₀，分子总原子数为3880。、各氨基酸含量如表2所示。理论等电点(Theoretical pI)为4.57；带电荷氨基酸残基共51个，其中带负电荷的氨基酸残基有35个(Asp+Glu)，带正电荷的氨基酸残基共16个(Arg+Lys)。

表2 ABC88747.1氨基酸组成

将YM47蛋白的氨基酸序列ABC88747.1导入黄粉虫蛋白组数据库，使用GO、COG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、KEGG和IPR(Interproscan软件)数据库分别进行蛋白功能、结构、通路注释。可知YM47蛋白参与生物过程中的蛋白水解，且具有分子功能——丝氨酸型内肽酶活性(GO注释，即GeneOntology基因本体)。另外，该蛋白属于COG(即Cluster of Orthologous Groups原核生物直系同源)26大类中的翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣蛋白(Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)中的分泌胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(serine proteinase)。

将测得的YM47蛋白的氨基酸序列导入黄粉虫转录组数据库，与组装得到的Unigenes的序列进行了blast比对，出现多个对应基因时选择得分最高的进行后续的Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)、Swiss-Prot(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)、NT(NCBInucleotide sequences)、NR(NCBI non-redundant protein sequences)、KOG(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)、GO(www.geneontology.org)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)注释分析可知，与该氨基酸序列(SEQ ID NO:3所示)最相似的基因是Cluster-24946.17391，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，同源性为87.76％。该核苷酸序列可编码胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，参与生物过程中的蛋白水解，具有丝氨酸型内肽酶活性分子功能。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> 黄粉虫YM45蛋白、其编码基因及应用

<130> 2019

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Arg Ile Ala Ile Phe Cys Leu Cys Phe Val Leu Val Trp Ala

1 5 10 15

Thr Pro Leu Gln Lys Ser Leu Leu Lys Glu Val Ser Val Lys Asp Ile

20 25 30

Asp Ser Arg Ile Leu Asn Gly Ala Gln Ala Ala Leu Gly Gln Phe Pro

35 40 45

Trp Glu Ala Ala Leu Tyr Val Asn Ile Gly Thr Thr Thr Tyr Phe Cys

50 55 60

Ser Gly Asn Ile Ile Ser Glu Glu Trp Ile Leu Thr Val Ala Gln Cys

65 70 75 80

Ile Ile Gly Ala Asp Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly Leu Ile Asp Leu

85 90 95

Asn Gly Ser Gly Thr Val Ala Arg Gly Thr Glu Ile Val Leu His Gly

100 105 110

Asp Tyr Asp Pro Asp Ala Phe Asn Asn Asp Ile Gly Leu Ile Lys Leu

115 120 125

Ser Thr Pro Ile Thr Phe Asn Val Asn Val Ala Pro Ile Ala Leu Ala

130 135 140

Glu Thr Leu Leu Glu Asp Gly Ile Asp Val Arg Val Ser Gly Trp Gly

145 150 155 160

Ala Thr Ser Asp Val Gly Gly Val Ser Glu Phe Leu Ser Tyr Val Asp

165 170 175

Leu Val Thr Ile Arg Asn Ser Glu Cys Ile Ala Val Tyr Gly Asn Thr

180 185 190

Ile Val Asp Ser Ile Val Cys Ala Gln Ser Ala Thr Ala Leu Leu Lys

195 200 205

Ser Val Cys Lys Gly Asp Gly Gly Ser Pro Leu Val Ile Asp Ala Gly

210 215 220

Ile Ser Pro Val Leu Val Gly Leu Val Ser Phe Ile Ser Thr Asp Gly

225 230 235 240

Cys Glu Ser Gly His Pro Thr Gly Phe Thr Arg Thr Ala Ala Tyr Arg

245 250 255

Asp Trp Ile Arg Thr Asn Ser Gly Val

260 265

<210> 2

<211> 1532

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaaaatga aacgtatcgc cattttttgt ctatgctttg tgctagtgtg ggctacgccc 60

ttgcagaaaa gcctattgaa agaggtatct gtaaaggaca tagattccag aattctcaat 120

ggtgctcaag cggccttagg tcaatttcct tgggaagcag ctctatacgt aaatataggg 180

accactacgt atttttgtag tggtaacata ataagcgaag aatggatcct taccgttgcc 240

caatgtatta ttggagccga ttctattgat gttctggcag gattgataga tttgaatggc 300

tctggtacgg tggcacgggg tactgaaatc gtccttcacg gggattatga tcccgatgct 360

tttaataacg atattggtct tattaaacta tcgacaccaa ttacatttaa tgtcaacgta 420

gccccaatag ctcttgcgga aacccttctt gaagacggaa tcgatgttag agtaagtgga 480

tggggcgcaa caagcgacgt cggtggtgta agcgaatttt tgagctatgt ggatctagta 540

acgattcgca acagtgaatg tatagcagtt tacggaaata ccattgtgga ttcaatcgtt 600

tgcgcacaat cagcaacggc tctcttgaag agcgtttgca agggtgacgg tggttcgcca 660

ttagtcattg atgctggcat cagtcctgta ctcgttggtc ttgttagttt tatcagcacc 720

gacggttgtg aatctgggca tcctactgga tttacaagaa ctgctgctta cagagactgg 780

atacgaacta attccggtgt gtaaattaca tgagaaccaa acgcaattaa ttgtaatgaa 840

aaactatatg taataaaatt ggattattgt gaattgtata ttttgacagt tattatttaa 900

tcattgatat ggaaaaaata tctttaagta gagaaattgt atcaacggat tgggaaaggt 960

atcacgtcat tacagccgtg aatagccaaa tcggcgtatc tgcatgttac aacatttatt 1020

gtaaagtgag aaaaattctg aacgtctagc cgtaatcttg gttaataagc ataattacca 1080

ttttaactgg cgattttttg cgtttctctt aatgaaatat gtaaataata acttattgaa 1140

ctatgtatat aactcaaaaa atgtaattta actttttttc caaatatgga ggttttgctg 1200

attactgata ttatttttga taactaatct tgaaagacgg tatttattgt ctgtagatgc 1260

tctaacgatt ctcgttttgg gtgatgtttg agtattgttc tcttcctttc cccgaatggt 1320

gtttttgcaa aaaatacgaa gcaaaaactt attggaaaag aatccccaat ttacgtactc 1380

acagagcacg tgatgccatt ccgtgttact tatttttatt taaataagat tctaagagag 1440

ttctaggata aataggtttt tgtaagagtt ttaaatgaaa cgattaagca aacttcactt 1500

atttttgatt ttacaaagaa tcgtgttttg at 1532

<210> 3

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Ser Ile Val Leu Ile Cys Leu Cys Val Val Ser Ala Trp Ala

1 5 10 15

Gly Leu Ile Thr Glu Arg Lys Pro Val Pro Val Lys Lys His Phe Gly

20 25 30

Gly Arg Ile Val Gly Gly Asp Glu Ala Ala Glu Asn Gln Phe Pro Trp

35 40 45

Gln Val Ala Val Tyr Phe Asp Thr Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Cys Gly

50 55 60

Gly Ala Leu Val Ala Glu Asn Trp Val Leu Thr Ala Gly His Cys Val

65 70 75 80

Tyr His Ala Lys Val Phe Thr Leu His Leu Gly Ser Asn Ser Leu Val

85 90 95

Asp Asp Asp Asp Asn Arg Val Thr Leu Gly Ala Ser Tyr Ser Val Pro

100 105 110

His Pro Asp Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Glu Asn Asp Ile Gly Leu Ile

115 120 125

Arg Ile Asp Thr Ala Tyr Lys Thr Asn Asp His Ile Lys Val Ile Pro

130 135 140

Leu Ala Ser Ser Glu Leu Gly Ala Asp Val Asp Val Ile Val Ser Gly

145 150 155 160

Trp Gly Ala Ser Gly Asp Trp Asp Gly Val Glu Asn His Leu Arg Phe

165 170 175

Val Gly Leu Lys Thr Leu Ser Asn Asp Asp Cys Lys Ala Ile Tyr Gly

180 185 190

Glu Ala Val Ile Thr Asp Gly Met Val Cys Ala Val Gly Pro Asn Ser

195 200 205

Glu Gly Thr Cys Asn Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Thr Asp Asp

210 215 220

Gly Ser Gly Asn Ser Val His Val Gly Val Val Ser Trp Ala Ser Ala

225 230 235 240

Ser Gly Cys Glu Thr Asn His Pro Ser Gly Tyr Thr Arg Thr Ala Ala

245 250 255

Tyr Arg Asp Trp Val Glu Ser Val Ile Gly

260 265

<210> 4

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagaagaaac cagttccctt caagaaacat ttcggtggac gaattgtagg aggtgatgta 60

gctgcagata accagttccc ttggcaagta gcagtctact ttgataccag cgacggtaca 120

tttttctgtg ggggtgctct gattgcagag aactgggtct tgactgctgg ccattgtgtc 180

taccatgctg aagtatttac tctccatttg ggatcaaatt cacttgtaga tgatgatgac 240

aatagagtga ctttgggcgc cagttactct gtaccgcatc ctgactacga tccttcgtct 300

ctggagaacg acattggtct tatcaggata gatgctgctt ataaaaccaa cgatcacatc 360

aaggtcattc ctttggccag cagcacgctt ggtgctgatc tagatgttac agttagtgga 420

tggggagcaa gcggtgattg ggatggtgtt gtcaacgatc ttaactttgt tggcttgaag 480

acaatttcca acgatgactg caaagccatt tatggtgacg caacgattct cgatggtatg 540

gtgtgtgctg ttggcccgag cacagaagga acttgcagcg gcgacagtgg tggtcctttg 600

gtaacagatg atggcagtgg taactctgtt catgttggtg ttgttagctg ggtgagctcc 660

agtggctgcg aaactgatca tccatcagga tatactagaa ctgccgctta tcgcgactgg 720

atagacagtc ttgttattag ttcaatgcac aaaactaagc aacagaagat atctctgatt 780

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aactaaaaac aaaaagaaat ttatacaggg tgtattaaaa atggcgcata atatttatgt 900

aaggcgaatt tacgttgaat aacaaacaaa aatttttatt gtgaatttgg tcttagacga 960

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acacaaaaat gaaaattgtg tggcaaagtt aaattaatat acatattcgt acaataagat 1200

tgacattaat attttttatt aattttatca ataagttttg gcaattttat ctctatatgt 1260

atcatgcgtt caaataaaaa cctgcgctga gtaggtgttg aaaaaagtaa accatttgga 1320

acagggtaaa gtttgaattt cccgcccttt gacatgaatg acttttgttt atgtttaatc 1380

ggcacatgat tgaacatgat tgttttcaga atggggtgcc tttagatatt tgcttggaga 1440

atagaattcg ctagttattc tatttttaag gtaggtaaaa cattacagag aaagaaaaaa 1500

caggaagatt ttttgtttat aaacttgagg atgtgattta cctatttttt ttagcacgtc 1560

atgaaaaatt taacatcaga acattttcaa aacttcaaca tgaatttgag aatcagctct 1620

gctattacat atttaaagaa taagtcgtga ccattttgaa cattcttttt gattaatatt 1680

gaaaaatgta ttacctaatt atttgtaaat attatattta acttaagtac a 1731

Claims

1.黄粉虫YM45蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或该氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码如权利要求1所述蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；或该核苷酸序列经取代、缺失或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述基因的载体、工程菌或转基因细胞系。

4.权利要求1所述的YM45蛋白在黄粉虫分子育种的应用。

5.权利要求2所述的基因在黄粉虫分子育种的应用。