CN104131016A - 一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，属于基因工程技术领域；胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列的cDNA序列由869个核苷酸组成，基因编码氨基酸序列为第13-786位核苷酸，终止密码子序列是TAA，位于第787-789位核苷酸，774个核苷酸序列编码258个氨基酸；克隆步骤为黄粉虫总RNA的提取、mRNA的反转录、PCR扩增得到一个基因黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列、根据黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列设计特异的5’RACE以及3’RACE的下游和上游特异外引物和特异内引物、PCR扩增得到该基因5’端序列以及的3’端序列、将已知的5’端序列和3’端序列拼接得到完整的地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列；采用该方法克隆的质量好，产量高，具有优良的活性物质，应用广泛。

Description

一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法

技术领域

本发明涉及本发明涉及一种胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，具体涉及本发明涉及一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，属于基因工程技术领域。 

背景技术

黄粉虫（Tenebrio molitor L.），又名大黄粉虫，属昆虫纲，鞘翅目。随着近年来研究人员的研究发现：黄粉虫的体内含有较多的蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素和维生素等多种化学物质，并经实验证明，以黄粉虫为原料制成的保健品具有抗病、防病的功能。 

黄粉虫幼虫的研究只有30年左右，研究还不深入。国内对其的研究主要集中在饲料中应用，作为一种高蛋白营养品，对蛋白的功能以及功能性蛋白的研究较少。在国外，开始对黄粉虫丝氨酸胰蛋白酶样酶的提取、功能以及其基因方面的研究，但是研究的还不够深入。 

丝氨酸蛋白酶( serine protease，SP) 是一类以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶家族，包括胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶以及组织纤溶酶原激活剂等． SP 活性中心都含 Ser、His、Asp，并具有相同的催化机制。该家族成员在生物体内执行着多种重要生理功能，如食物消化、血 压 调 节、凝 血、纤溶以及发育等。昆虫的胰蛋白酶( trypsin) 是其体内最重要的消化酶，大多数昆虫的此类酶存在于中肠。也有研究发现，处于不同发育阶段和不同性别的昆虫其胰蛋白酶存在有所差异，如云杉色卷蛾 ( Choristoneura fumiferana Clemens ) 、烟草天蛾 ( Mandula sexta Linnaeus) 等胰蛋白酶仅存在于幼虫中肠中；而在各个发育阶段的雌、雄黑腹果蝇( Drosophila melanogaster Meigen )中肠中均有高活性胰蛋白酶。研究表明，虽然昆虫的胰蛋白酶样酶与脊椎动物的胰蛋白酶在分泌与激活机制上有所不同，但其构成与作用机理很相似，如都含有信号肽，N 端都具有 IVGG 的氨基酸序列等。 

据报道，黄粉虫胰蛋白酶样蛋白具有溶解纤维蛋白的作用。但是来源于生物体内的纤溶活性蛋白受到生物体来源和分离纯化过程繁琐的限制，使之不能大量获得和应用，若将该蛋白的基因克隆出来即可用基因工程的方法大量获得该蛋白。中国专利CN101838659A公开了一种拟穴青蟹胰蛋白酶基因cDNA序列及其克隆方法和应用，用于预测青蟹种苗繁育过程中的投饵量以及蜕壳周期，以满足人们对青蟹生活周期的掌握以及遗传育种中的选用，效果好。而对黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法还没出现。本发明的目的是提供一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，得到高质量，高产量的活性物质，在医疗上将具有较好的应用前景。 

发明内容

本发明的目的是提供一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，得到质量优良，产量高的活性物质。 

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是： 

一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列，其cDNA序列由869个核苷酸组成，自5’至3’端序列为：

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA。

所述的黄粉虫胰蛋白酶样酶基因编码氨基酸序列为第13-786位核苷酸，终止密码子序列是TAA，位于第787-789位核苷酸。 

所述的774个核苷酸序列编码258个氨基酸，其序列为： 

MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI。

一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列的克隆方法，包括如下步骤： 

黄粉虫总RNA的提取、mRNA的反转录、PCR扩增得到一个基因黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列、根据黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列设计特异的5’RACE以及3’RACE的下游和上游特异外引物和特异内引物、PCR扩增得到该基因5’端序列以及的3’端序列、将已知的5’端序列和3’端序列拼接得到完整的地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列，具体步骤如下：

（1）黄粉虫总RNA提取

取-80℃保存的黄粉虫两只，0.1%的DEPC水清洗，置于已用液氮预冷的无RNA酶的研钵，用液氮快速冷冻并研磨成粉末状，取其中约50mg，按照华舜生物技术有限公司提供的柱式小量总RNA抽提试剂盒W7001提取黄粉虫总RNA，并获得约50μl 总RNA，-80℃保存；

（2）mRNA的反转录

20μl 反转录反应体系，含5.0μl 总RNA，1.0μl oligo(dT)₁₈，1.0μl dNTPs，4.0μl 5×buffer，2.0μl RNase inhibitor，1.0μl  Super M-MLV Reverse Transcriptase RNase H^-，无RNA酶双蒸水补至20μl，30℃10min，42℃60min，70℃15min终止反转录反应，冰浴冷却后放入-20℃冰箱保存；

（3）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的核苷酸序列的获得

1）引用土鳖虫纤溶酶基因简并引物序列

上游引物（Primer1）5’-CTN ACY GCW GCY CAY TG-3’ 简并度64，编码氨基酸序列LTAAHC；下游引物（Primer2）5’-CC NCC NGA RTC WCC CT-3’，简并度64，编码氨基酸序列QGDSGG其中R=A+G  Y=T+C  W=A+T  N=A+T+G+C；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的PCR扩增

采用25ul反应体系，采用如下反应条件、步骤：反转录产物 1.0μl，10×2.5μl Buffer：0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4，2.0mmol/L MgCl₂，dNTPs 0.2mmol/L 2.0μl，Primer1：1μmol/L 2.5μl，Primer2：1μmol/L 2.5μl，TaqDNA聚合酶1.0U；梯度PCR反应参数为：94℃，5min；94℃，30sec，38℃、39.5℃、41.6℃、44.7℃、48.5℃、52.2℃、55.5℃、58.9℃、62.5℃、65℃各1 min，72℃，2min，30个循环，最后72℃延伸10min，在退火温度为55.5℃时，出现特异条带，退火温度定为55℃；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的回收

参考takara 的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0 的使用说明书进行，①PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下用洁净的手术刀割下含需回收DNA琼脂块；②按每3μl/μg琼脂糖凝胶比例加入DR-ⅠBuffer，置75℃金属浴6min，使胶彻底融化，每2min混匀一次；③加入1/2DR-ⅠBuffer 体积的DR-ⅡBuffe，将融化的胶溶液转移到spin colum中，12000rpm室温下离心1min；④取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入500μl Ainse A，12000rpm室温离心1min；⑤取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入700μl Ainse B，12000rpm室温离心1min；⑥重复一次；⑤取下spin colum，倒掉收集管中废液，将spin colum放入同一个收集管中，12000rpm室温离心1min；将UNIQ－10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加25μl 60℃Elution Buffer，室温放置2min；12000rpm室温离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的测序

黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段经Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收后，克隆至载体pMD19-T中，转化DH5α大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行DNA测序；

（4）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的获得

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计下游特异外引物（Primer3 5A3O）5’-GCA GGT CGA TTG GCT AAC A-3’以及并下游特异内引物（Primer3 5A4I）5’-TTG AAC CCT CGG TGG TGG TT -3’；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的PCR扩增

根据takara的5’-Full RACE Kit的操作说明完成；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的回收

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的测序

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

（5）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的获得

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计上游特异外引物（Primer3 3A5O）5’-CCA GCT GGT CCG CTG GTA CT -3’以及并上游特异内引物（Primer3 3A6I）5’-CTC ATC CGC ATA CGG TTC T -3’；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的PCR扩增

根据takara的3’-Full RACE Kit的操作说明完成；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的回收

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的测序

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

（6）完整地鳖虫纤溶酶基因序列的获得

将黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的序列与黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段以及黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的序列进行拼接，即得完整地鳖虫纤溶酶基因序列；

（7）地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列测定结果

地鳖虫纤溶酶基因序列由869个核苷酸组成，见序列表，编码268个氨基酸，见序列表；编码氨基酸序列为13-786位核苷酸，终止子密码位于基因787-789位，终止密码为TAA，1-12为5’末端非编码序列，790-869为3’末端非编码序列。

采用以上方法编码的黄粉虫胰蛋白酶样酶具有以下功能： 

1）胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，EC3.4.21.4；在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的，在昆虫及甲壳动物等无脊椎动物中，胰蛋白酶主要由中肠腺分泌，其分泌及激活机制尚未十分明确，故多将其称为胰蛋白酶样酶(Trypsin-like proteinase or Trypsin-like enzyme)；

2）作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用，是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具；

3）由于胰蛋白酶能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓、痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，用于清除坏死机体组织、纤维以及血痂非常有效，因此将其用于创伤溃疡的清创，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用；临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等；用作溶栓剂；用于喷雾吸入，可治疗呼吸道疾病；也可用于治疗毒蛇咬伤；还常用于动物细胞培养前对组织的处理。

本发明的有益效果是： 

（1）提供一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法，该序列由869个核苷酸组成，其中13-786位核苷酸是黄粉虫胰蛋白酶样酶基因编码氨基酸序列，787－789位核苷酸是终止子序列TAA；

（2）采用该方法克隆的质量好，产量高，具有优良的活性物质，应用广泛。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。 

实施例1 

一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列，其cDNA序列由869个核苷酸组成，自5’至3’端序列为：

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA。

所述的黄粉虫胰蛋白酶样酶基因编码氨基酸序列为第13-786位核苷酸，终止密码子序列是TAA，位于第787-789位核苷酸；所述的774个核苷酸序列编码258个氨基酸，其序列为： 

MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI。

黄粉虫胰蛋白酶样酶基因的克隆程序如下： 

    1.黄粉虫总RNA提取

取-80℃保存的黄粉虫两只，0.1%的DEPC水清洗，置于已用液氮预冷的无RNA酶的研钵，用液氮快速冷冻并研磨成粉末状，取其中约50mg，按照华舜生物技术有限公司提供的柱式小量总RNA抽提试剂盒（W7001）提取黄粉虫总RNA。并获得约50μl 总RNA，-80℃保存。

2. mRNA的反转录 

20μl 反转录反应体系，含5.0μl 总RNA，1.0μl oligo(dT)₁₈， 1.0μl dNTPs，4.0μl 5×buffer，2.0μl RNase inhibitor，1.0μl  Super M-MLV Reverse Transcriptase RNase H^-，无RNA酶双蒸水补至20μl，30℃10min，42℃60min，70℃15min终止反转录反应，冰浴冷却后放入-20℃冰箱保存。

3.黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的核苷酸序列的获得 

1）引用土鳖虫纤溶酶基因简并引物序列

上游引物（Primer1）5’-CTN ACY GCW GCY CAY TG-3’ 简并度64，编码氨基酸序列LTAAHC；下游引物（Primer2）5’-CC NCC NGA RTC WCC CT-3’，简并度64，编码氨基酸序列QGDSGG其中R=A+G  Y=T+C  W=A+T  N=A+T+G+C。

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的PCR扩增 

采用25ul反应体系，采用如下反应条件、步骤：反转录产物 1.0μl，10×Buffer（0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4，2.0mmol/L MgCl₂）2.5μl，dNTPs 0.2mmol/L 2.0μl，Primer1：1μmol/L 2.5μl，Primer2：1μmol/L 2.5μl，TaqDNA聚合酶1.0U。梯度PCR反应参数为：94℃，5min；94℃，30sec，（38℃、39.5℃、41.6℃、44.7℃、48.5℃、52.2℃、55.5℃、58.9℃、62.5℃、65℃），1 min，72℃，2min，30个循环，最后72℃延伸10min。在退火温度为55.5℃时，出现特异条带，退火温度定为55℃

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的回收

参考takara 的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0 的使用说明书进行，①PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下用洁净的手术刀割下含需回收DNA琼脂块；②按每3μl/μg琼脂糖凝胶比例加入DR-ⅠBuffer，置75℃金属浴6min，使胶彻底融化（每2min混匀一次）；③加入1/2DR-ⅠBuffer 体积的DR-ⅡBuffe，将融化的胶溶液转移到spin colum中，12000rpm室温下离心1min；④取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入500μl Ainse A，12000rpm室温离心1min。⑤取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入700μl Ainse B，12000rpm室温离心1min。⑥重复一次；⑤取下spin colum，倒掉收集管中废液，将spin colum放入同一个收集管中，12000rpm室温离心1min；将UNIQ－10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加25μl 60℃Elution Buffer，室温放置2min；12000rpm室温离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段。

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的测序 

黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段经Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收后，克隆至载体pMD19-T中，转化DH5α大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行DNA测序。

4. 黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的获得 

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计下游特异外引物（Primer3 5A3O）5’-GCA GGT CGA TTG GCT AAC A-3’以及并下游特异内引物（Primer3 5A4I）5’-TTG AAC CCT CGG TGG TGG TT -3’。

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的PCR扩增 

根据takara的5’-Full RACE Kit的操作说明完成。

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的回收 

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段。

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的测序 

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段。

5. 黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的获得 

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计上游特异外引物（Primer3 3A5O）5’-CCA GCT GGT CCG CTG GTA CT -3’以及并上游特异内引物（Primer3 3A6I）5’-CTC ATC CGC ATA CGG TTC T -3’。

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的PCR扩增 

根据takara的3’-Full RACE Kit的操作说明完成。

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的回收 

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段。

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的测序 

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段。

6.完整地鳖虫纤溶酶基因序列的获得 

将黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的序列与黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段以及黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的序列进行拼接，即得完整地鳖虫纤溶酶基因序列。

7. 地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列测定结果 

地鳖虫纤溶酶基因序列由869个核苷酸组成，编码268个氨基酸。编码氨基酸序列为13-786位核苷酸，终止子密码位于基因787-789位，终止密码为TAA，1-12为5’末端非编码序列，790-869为3’末端非编码序列。

黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸的序列列表为： 

序列长度：869bp

序列类型：核酸

链数：单链

拓扑学：直链状

序列种类：cDNA

来源：鞘翅目拟步行虫科黄粉虫

序列特征：13-786位核苷酸是基因编码氨基酸序列，终止密码子位于基因787-789位，为TAA。

  

序列表                          

SEQUENCE LISTING

<110> 广东工业大学

<120> 一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法

<160>  8

<210> 1

<211>869

<212> DNA

<213>未知

<400> 1

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213>未知

<400>2 MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>  上游引物 

<400> 3

CTN ACY GCW GCY CAY TG 

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

CC NCC NGA RTC WCC CT 

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性外引物5A3O 

<400> 5

GCA GGT CGA TTG GCT AAC A 

<210> 6

<211>  20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 特异性内引物5A4I

<400> 6

TTG AAC CCT CGG TGG TGG TT 

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 特异性外引物 3A5O

<400> 7

CCA GCT GGT CCG CTG GTA CT

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 特异性内引物 3A6I

<400> 8

CTC ATC CGC ATA CGG TTC T

序列表                         

SEQUENCE LISTING

<110> 广东工业大学

<120> 一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列及克隆方法

<160>  8

<210> 1

<211>869

<212> DNA

<213>未知

<400> 1

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA

<210> 2

<211> 258

<212> PRT

<213>未知

<400>2 MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>  上游引物

<400> 3

CTN ACY GCW GCY CAY TG

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

CC NCC NGA RTC WCC CT

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性外引物5A3O

<400> 5

GCA GGT CGA TTG GCT AAC A

<210> 6

<211>  20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 特异性内引物5A4I

<400> 6

TTG AAC CCT CGG TGG TGG TT

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 特异性外引物 3A5O

<400> 7

CCA GCT GGT CCG CTG GTA CT

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 特异性内引物 3A6I

<400> 8

CTC ATC CGC ATA CGG TTC T

Claims (4)

1.一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列，其特征在于：其cDNA序列由869个核苷酸组成，自5’至3’端序列为：

ACACTTCTCACAATGAAATCAATCTTGTTTGTAGTCTTCTTGGTAGCTTCCGCCTCAGCGGTCCCACCTTTCCTCCGCAAGAACAGCTTGCTGCCTGATGGCAGAATCGTAGGAGGCTCCAGCATTTCCATCTCTTCGGTCCCATGGCAAATCTCTCTCCAATACTACGGTTCCCACATCTGCGGTGGTTCAATAATCAGCGCTAACTACATTGTTACTGCTGCCCATTGTACCGATGGATTGACTGCTGGTTCTTTGACCGTCCGTGCTGGAACTTCCACTCGTGGTTCCGGTGGTCAGGTGGTCAACGTCGCTAGGATTAACCAAAATCCCAGCTACAATGACAGGCTCATCGATTATGACATCTCGGTTTTGCAACTGTCTTCGTCTTTGTCTCTGGGCAGCAGCGTAGCCGCTGTAGGCCTTCCATCGTCGAGCACCAGCTGGTCCGCTGGTACTTCCGTTCTCGTAACTGGCTGGGGAACCACCACCGAGGGTTCAAGCTCGCTTCCCTCCGCCTTGCAAGGAGTCAACGTTCAAATTGTTAGCCAATCGACCTGCTCATCCGCATACGGTTCTGGTAGCATCACCGACCGCATGTTGTGCGCTGGTGTTACCGGAGGCGGAAAAGATGCTTGCCAAGGAGACTCCGGCGGTCCACTTGTTGTCGGCAACGTTCTTGCCGGTATCGTCTCTTGGGGATATGGATGTGCCCGCAATGGTTATCCTGGAGTTTATTCTAACGTACCTGCTCTCCGCAGCTACATCCAACAAACCGCCGGAATATAAACTCTTTAAATACTTGTTGCCGCTAATTACGTAAACGACACGGATATGACAATAAATATTTAGTTTTCAAAAAAAAAAAA。

2.根据权利要求1所述的一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列，其特征在于：所述的黄粉虫胰蛋白酶样酶基因编码氨基酸序列为第13-786位核苷酸，终止密码子序列是TAA，位于第787-789位核苷酸。

3.根据权利要求1所述的一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列，其特征在于：所述的774个核苷酸序列编码258个氨基酸，其序列为：

MKSILFVVFLVASASAVPPFLRKNSLLPDGRIVGGSSISISSVPWQISLQYYGSHICGGSIISANYIVTAAHCTDGLTAGSLTVRAGTSTRGSGGQVVNVARINQNPSYNDRLIDYDISVLQLSSSLSLGSSVAAVGLPSSSTSWSAGTSVLVTGWGTTTEGSSSLPSALQGVNVQIVSQSTCSSAYGSGSITDRMLCAGVTGGGKDACQGDSGGPLVVGNVLAGIVSWGYGCARNGYPGVYSNVPALRSYIQQTAGI。

4.一种黄粉虫胰蛋白酶样酶基因核苷酸序列的克隆方法，其特征在于：包括如下步骤：

黄粉虫总RNA的提取、mRNA的反转录、PCR扩增得到一个基因黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列、根据黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守序列设计特异的5’RACE以及3’RACE的下游和上游特异外引物和特异内引物、PCR扩增得到该基因5’端序列以及3’端序列，将已知的5’端序列和3’端序列拼接得到完整的地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列；具体步骤如下：

（1）黄粉虫总RNA提取

取-80℃保存的黄粉虫两只，0.1%的DEPC水清洗，置于已用液氮预冷的无RNA酶的研钵，用液氮快速冷冻并研磨成粉末状，取其中约50mg，按照华舜生物技术有限公司提供的柱式小量总RNA抽提试剂盒W7001提取黄粉虫总RNA，并获得约50μl 总RNA，-80℃保存；

（2）mRNA的反转录

20μl 反转录反应体系，含5.0μl 总RNA，1.0μl oligo(dT)₁₈，1.0μl dNTPs，4.0μl 5×buffer，2.0μl RNase inhibitor，1.0μl  Super M-MLV Reverse Transcriptase RNase H^-，无RNA酶双蒸水补至20μl，30℃10min，42℃60min，70℃15min终止反转录反应，冰浴冷却后放入-20℃冰箱保存；

（3）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的核苷酸序列的获得

1）引用土鳖虫纤溶酶基因简并引物序列

上游引物（Primer1）5’-CTN ACY GCW GCY CAY TG-3’ 简并度64，编码氨基酸序列LTAAHC；下游引物（Primer2）5’-CC NCC NGA RTC WCC CT-3’，简并度64，编码氨基酸序列QGDSGG其中R=A+G  Y=T+C  W=A+T  N=A+T+G+C；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的PCR扩增

采用25ul反应体系，采用如下反应条件、步骤：反转录产物 1.0μl，10×2.5μl Buffer：0.5mol/L KCl，0.1mol/L Tris-HCl，pH8.4，2.0mmol/L MgCl₂，dNTPs 0.2mmol/L 2.0μl，Primer1：1μmol/L 2.5μl，Primer2：1μmol/L 2.5μl，TaqDNA聚合酶1.0U；梯度PCR反应参数为：94℃，5min；94℃，30sec，38℃、39.5℃、41.6℃、44.7℃、48.5℃、52.2℃、55.5℃、58.9℃、62.5℃、65℃各1 min，72℃，2min，30个循环，最后72℃延伸10min，在退火温度为55.5℃时，出现特异条带，退火温度定为55℃；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的回收

参考takara 的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0 的使用说明书进行，①PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下用洁净的手术刀割下含需回收DNA琼脂块；②按每3μl/μg琼脂糖凝胶比例加入DR-ⅠBuffer，置75℃金属浴6min，使胶彻底融化，每2min混匀一次；③加入1/2DR-ⅠBuffer 体积的DR-ⅡBuffe，将融化的胶溶液转移到spin colum中，12000rpm室温下离心1min；④取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入500μl Ainse A，12000rpm室温离心1min；⑤取下spin colum，倒掉收集管中的废液，将spin colum放入同一个收集管中，加入700μl Ainse B，12000rpm室温离心1min；⑥重复一次；⑤取下spin colum，倒掉收集管中废液，将spin colum放入同一个收集管中，12000rpm室温离心1min；将UNIQ－10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加25μl 60℃Elution Buffer，室温放置2min；12000rpm室温离心1min，离心管中液体即为回收的DNA片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段的测序

黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段经Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0回收后，克隆至载体pMD19-T中，转化DH5α大肠杆菌，筛选阳性克隆，进行DNA测序；

（4）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的获得

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计下游特异外引物（Primer3 5A3O）5’-GCA GGT CGA TTG GCT AAC A-3’以及并下游特异内引物（Primer3 5A4I）5’-TTG AAC CCT CGG TGG TGG TT -3’；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的PCR扩增

根据takara的5’-Full RACE Kit的操作说明完成；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的回收

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的测序

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

（5）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的获得

1）黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段特异引物的设计

根据已获得的黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段序列，设计上游特异外引物（Primer3 3A5O）5’-CCA GCT GGT CCG CTG GTA CT -3’以及并上游特异内引物（Primer3 3A6I）5’-CTC ATC CGC ATA CGG TTC T -3’；

2）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的PCR扩增

根据takara的3’-Full RACE Kit的操作说明完成；

3）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的回收

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

4）黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的测序

同黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段；

（6）完整地鳖虫纤溶酶基因序列的获得

将黄粉虫胰蛋白酶样酶5’端片段的序列与黄粉虫胰蛋白酶样酶中间保守片段以及黄粉虫胰蛋白酶样酶3’端片段的序列进行拼接，即得完整地鳖虫纤溶酶基因序列；

（7）地鳖虫纤溶酶基因核苷酸序列测定结果

地鳖虫纤溶酶基因序列由869个核苷酸组成，见序列表，编码268个氨基酸，见序列表；编码氨基酸序列为13-786位核苷酸，终止子密码位于基因787-789位，终止密码为TAA，1-12为5’末端非编码序列，790-869为3’末端非编码序列。