CN103819552A - 一种发形霞水母多肽生长因子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物技术领域，本发明提供了一种发形霞水母多肽生长因子，命名为Cc-GRN-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了上述发形霞水母多肽生长因子的制备方法及其应用。本发明的发形霞水母多肽生长因子具有显著的促细胞增殖作用，在研制损伤修复药物方面有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种发形霞水母多肽生长因子及其制备方法和应用。
背景技术
水母（jellyfish）是一类胶质状的浮游动物，种类繁多，数量巨大，分布广泛，在海洋生态系统中占有重要地位。水母的基本结构是由伞体、缘膜、口腕、触手、附属器等组成，伞体呈扁平圆盘形或球形，伞体腹面有口，口下悬垂口腕，伞体边缘和口腕上长有许多触手，长者达数十米，其上密布刺丝囊。刺丝囊是触手上一种特化细胞——刺细胞的特化细胞器，状如小囊，内含毒液，是刺胞动物的防御与进攻武器。当触手触及其他动物时，立即缠绕受害者，刺丝囊发射刺丝穿入人体皮肤或小动物体内，同时释放出毒液。
水母生殖腺发达，繁殖能力强，生长发育速度极快，同时也具有非常强的再生能力。水母捕食或防御天敌进攻的过程中，一方面，细长丝状的触手容易出现断裂、脱落或者被天敌咬去许多，但受损部位很快可长出新的触手，以维持水母个体的正常活动与功能，水母触手表现出了超强的损伤修复能力；另一方面，水母触手上刺丝囊数量巨大，需经细胞快速、大量增殖产生，而且捕食、防御过程会消耗大量刺丝囊，损耗的刺丝囊也需要及时补充，因此推测触手中存在着刺细胞快速增殖和刺丝囊补充的动态过程。水母触手的超强损伤修复能力和刺细胞的快速增殖能力提示，水母触手，特别是刺细胞中，可能存在高活性生长因子。
颗粒体蛋白前体（Progranulin，PGRN）是一种参与发育调节、伤口愈合、血管发生、神经元细胞生长和维持以及炎症反应等多种生理病理过程的分泌型生长因子，亦称为颗粒体蛋白/上皮肽前体（GEP）、PC细胞衍生的生长因子（PCDGF）、acrogranin或G80。它首先作为生长因子从条件组织培养基中纯化得到，是一种含593个氨基酸残基的分泌性糖蛋白，表观分子量88kDa。PGRN包括1个信号肽序列和7.5个颗粒体蛋白（granulin，GRN）模序（X2-3CX5-6CX5CCX8CCX6CCXDX2HCCPX4CX5-6CX2），每个模序都含有12个半胱氨酸并形成6对二硫键，在空间结构上，4个β-折叠的“发夹”结构依次呈梯状折叠。共有序列的C末端包含保守序列CCXDX2HCCP，被认为具有金属酶结合位点以及参与调节功能。PGRN可以被细胞外的蛋白酶如嗜中性粒细胞分泌的弹性蛋白酶水解成小的多肽片段GRN，这些多肽片段的分子量从6kDa到25kDa大小不等，均保留生物学活性：可促进细胞生长，并可能与炎症有关（参见文献：Lu R,G Serrero,et al.Inhibition of PC cell-derived growth factor(PCDGF,epthelin/granulin precursor)expression by antisense PCDGF cDNA transfectioninhibits tumorigenictiy of the human breast carcinoma cell line MDA-MB-468.ProcNatl Acad Sci USA,2000,97(8):3993-3998）。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于发形霞水母，新的多肽生长因子；本发明的另一目的在于提供该多肽生长因子的制备方法，以及在制备损伤修复药物中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
本发明从发形霞水母刺丝囊毒素中分离得到的一种促进细胞增殖的单链多肽Cc-GRN-1，生物信息学分析提示其属于颗粒体蛋白（GRN）家族，查询蛋白质/多肽公共数据库无该多肽序列，尚未见相关文献报道。
本发明的第一方面，是提供了一种发形霞水母多肽生长因子，命名为Cc-GRN-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的多肽生长因子是从发形霞水母刺丝囊毒素中分离得到的一种单链多肽，58个氨基酸，分子量5782.9Da，多肽氨基酸全序列一级结构如下：Asn–Val–Ile–Cys–Pro–Asp–Gly–Thr–Ser–Phe–Cys–Ala–Ser–Gly–Gln–Thr–Cys–Cys–Lys–Leu–Ser–Ser–Gly–Ser–Tyr–Gly–Cys–Cys–Pro–Leu–Pro–Asn–Ala–Val–Cys–Cys–Ser–Asp–Gly–Val–His–Cys–Cys–Pro–Ser–Gly–Thr–Thr–Cys–Asp–Val–Ser–Gln–Gly–Thr–Cys–Leu–Arg（SEQ ID NO:1）
本发明的第二方面，是提供了上述的发形霞水母多肽生长因子的制备方法。
本发明将活体发形霞水母触手剪下，-70℃冻存，采用自溶法制备发形霞水母刺丝囊，利用组织研磨器破碎提取得到水母粗毒素，再经凝胶过滤层析和两次反相高效液相层析（RP-HPLC）分离纯化后即得到。
本发明的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的制备方法，具体步骤如下：A、准备水母刺丝囊毒素
取冻存的发形霞水母触手解冻，加入2-6倍体积预冷的蒸馏水，用搅拌器缓慢连续搅拌5h以上；混悬液用孔径为450μm的40目分样筛过滤，收集滤液，3000×g离心5min，移去上清液，沉淀用无菌人工海水洗涤2-3次，即得刺丝囊；向洗干净的刺丝囊加入50mmol/L、pH3.0的乙酸，转移至破碎管中，然后利用组织研磨器Mini-Beadbeater在转速为4600rpm条件下破碎3-6min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为水母刺丝囊毒素；
上述操作都在0-4℃（如冰水混合物）条件下进行。
所述的无菌人工海水，是用以下方法配制得到的：称取NaCl28g，MgCl2·6H2O5g，KCl0.8g，CaCl21.033g，加蒸馏水至1L，混匀后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤。
B、Superdex30柱凝胶过滤层析
将上述水母刺丝囊毒素用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液上Superdex30柱进行分离纯化，采用50mmol/L、pH3.0的乙酸洗脱，流速为1mL/min，280nm波长的紫外检测器同步检测并收集洗脱体积110-115mL组分的洗脱峰SE2。
我们用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析得知，其中流出体积110-115mL内的组分（参见图1洗脱峰SE2）含有多肽生长因子Cc-GRN-1。
C、C8柱反相高效液相层析（RP-HPLC）
将上述流出体积110-115mL组分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C8柱层析峰（参见图2洗脱峰RP2），即得到多肽生长因子Cc-GRN-1组分。
本发明的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的制备方法，还包括以下步骤：
D、C18柱反相高效液相层析（RP-HPLC）
将步骤C含多肽生长因子Cc-GRN-1组分用反相C18柱进行二次纯化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰（参见图3洗脱峰Cc-GRN-1），即得到多肽生长因子Cc-GRN-1单体。
本发明采用MALDI-TOF质谱测定分子量，用全自动蛋白质多肽测序仪测定多肽氨基酸序列一级结构。
本发明也可通过人工方法合成如SEQ ID NO:1所示的多肽。
本发明的第三方面，是提供了上述的发形霞水母多肽生长因子在制备损伤修复药物中的应用。
所述的损伤，指外力作用于身体使某部组织或器官发生结构破坏或功能障碍，如机械性、物理性或化学性损伤。
所述的修复，指受损害或缺损的组织由周围健康组织来再生、修补恢复的过程。它是机体的一种适应能力和抗损害的防御机能。组织修复主要通过血管、结缔组织、上皮组织等的再生而完成。
用本发明的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的细胞增殖实验结果来证明本发明的促细胞增殖作用。本发明的Cc-GRN-1有显著的促细胞增殖作用，可作为研制损伤修复药物的应用。
采用CCK-8法来检测样品的促细胞增殖作用。A549细胞（人肺腺癌细胞）在37℃，5%CO2条件下的培养箱内培养，将浓度分别为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL和4μg/mL多肽生长因子Cc-GRN-1加入预培养的96孔培养板中，每个浓度6个复孔，将培养板在培养箱孵育48h，向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱孵育1.5h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞增殖率。同样，HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）在37℃，5%CO2条件下的培养箱内培养，将浓度分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL和1μg/mL多肽生长因子Cc-GRN-1加入预培养的96孔培养板中，每个浓度6个复孔，将培养板在培养箱孵育72h，向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱孵育1.5h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞增殖率。结果表明，发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1具有显著的促细胞增殖作用，而且促细胞增殖作用随着剂量的递增而增强。
本发明的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1是一种首次从刺胞动物发形霞水母中得到的具有显著促细胞增殖作用的新的多肽。本发明的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1具有显著的促细胞增殖作用，在研制损伤修复药物方面有良好的应用前景。本发明的多肽也具有序列高度保守性、促细胞增殖作用显著等优点。本发明为海洋药物的研发提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明发形霞水母颗粒体蛋白Cc-GRN-1的Superdex30柱凝胶过滤层析图。
图2为本发明发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的C8柱反相高效液相层析图。
图3为本发明发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的C18柱反相高效液相层析图。
图4为本发明发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的MALDI-TOF质谱图。
图5为本发明发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1对A549细胞的细胞增殖活性检测。
图6为本发明发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1对HUVEC细胞的细胞增殖活性检测。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
本发明选择的发形霞水母（Cyanea Capillata）采集自浙江省三门湾海域，并经集美大学水产学院洪惠馨教授鉴定（Xiao L,He Q,et al.Cyanea capillatatentacle-only extract as a potential alternative of nematocyst venom:Itscardiovascular toxicity and tolerance to isolation and purification procedures.Toxicon,2009,53(1):146-152）。
A549细胞、HUVEC细胞购自中科院细胞所。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：制备水母刺丝囊毒素
取200g冻存的水母触手置于烧杯中解冻，加入5倍体积预冷的蒸馏水，用搅拌器缓慢连续搅拌10h；混悬液用孔径为450μm的40目分样筛过滤，收集滤液，3000×g离心5min，移去上清液，沉淀用无菌人工海水洗涤3次，即得刺丝囊；向洗干净的刺丝囊加入少量50mmol/L、pH3.0的乙酸，转移至含有破碎用钢珠的破碎管中，然后利用组织研磨器Mini-Beadbeater在转速为4600rpm条件下破碎6min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为水母刺丝囊毒素。上述操作都在4℃条件下进行。
实施例2：水母刺丝囊毒素的分离纯化
（1）Superdex30柱凝胶过滤层析
将水母刺丝囊毒素用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液上Superdex30柱进行分离纯化，采用50mmol/L、pH3.0乙酸洗脱，流速为1mL/min，按固定体积收集洗脱峰，MALDI-TOF质谱分析得知，其中流出体积110-115mL内的组分（参见图1洗脱峰SE2）含有多肽生长因子Cc-GRN-1。
（2）C8柱反相高效液相层析（RP-HPLC）
将上述流出体积110-115mL组分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C8柱层析峰（参见图2洗脱峰RP2），即得到多肽生长因子Cc-GRN-1组分。
（3）C18柱反相高效液相层析（RP-HPLC）
将上述颗粒体蛋白Cc-GRN-1组分用反相C18柱进行二次纯化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰（参见图3洗脱峰Cc-GRN-1），即得到多肽生长因子Cc-GRN-1单体。
实施例3：发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1测序
用高效液相色谱（HPLC）方法鉴定发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的纯度，MALDI-TOF质谱测定其分子量（参见图4），用全自动蛋白质多肽测序仪测定其氨基酸序列。
通过上述方法制备的发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1，是我们从发形霞水母刺丝囊毒素中分离得到的一种单链多肽，分子量5782.9Da，多肽氨基酸全序列一级结构为：天冬酰胺-缬氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-苏氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酰胺-苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-组氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-丝氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-精氨酸（SEQ ID NO:1）。
实施例4：发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1的细胞增殖活性检测
（1）在96孔板中接种100μL A549细胞（人肺腺癌细胞）和HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）悬液，将培养板在培养箱中于37℃，5％CO2的条件下预培养24h。
（2）移去原培养基，向培养板加入100μL含不同浓度Cc-GRN-1的培养基，将培养板在培养箱分别孵育48h和72h。
（3）向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱孵育1.5h。
（4）用酶标仪测定在450nm处的吸光度，计算细胞增殖率。细胞增殖率=[(处理组A值－空白组A值)/空白组A值]×100%。
实验结果参见图5、图6，随着多肽生长因子Cc-GRN-1浓度的增加，细胞增殖率逐渐增大，且与空白对照相比有显著性差异。
可见，发形霞水母多肽生长因子Cc-GRN-1具有显著的促细胞增殖作用，可作为研制损伤修复药物的应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (5)
1.一种发形霞水母多肽生长因子，其特征在于，该多肽生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的发形霞水母多肽生长因子的制备方法，其特征在于，该方法是将活体发形霞水母触手剪下，-70℃冻存，采用自溶法制备发形霞水母刺丝囊，利用组织研磨器破碎提取得到水母粗毒素，再经凝胶过滤层析和两次反相高效液相层析分离纯化后即得到。
3.根据权利要求2所述的发形霞水母多肽生长因子的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：
A、准备水母刺丝囊毒素
取冻存的发形霞水母触手解冻，加入2-6倍体积预冷的蒸馏水，用搅拌器缓慢连续搅拌5小时以上；混悬液用孔径为450μm的40目分样筛过滤，收集滤液，3000×g离心5min，移去上清液，沉淀用无菌人工海水洗涤2-3次，即得刺丝囊；向洗干净的刺丝囊加入50mmol/L、pH3.0的乙酸，转移至破碎管中，然后利用组织研磨器Mini-Beadbeater在转速为4600rpm条件下破碎3-6min，每破碎30s，将破碎管取出置于冰水中冷却1min，破碎完毕后10000×g离心10min，收集上清即为水母刺丝囊毒素；
上述操作都在0-4℃条件下进行。
所述的无菌人工海水，是用以下方法配制得到的：称取NaCl28g，MgCl2·6H2O5g，KCl0.8g，CaCl21.033g，加蒸馏水至1L，混匀后用孔径为0.20μm的微孔滤膜过滤；
B、Superdex30柱凝胶过滤层析
将上述水母刺丝囊毒素用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，滤液上Superdex30柱进行分离纯化，采用50mmol/L、pH3.0的乙酸洗脱，流速为1mL/min，280nm波长的紫外检测器同步检测并收集洗脱体积110-115mL组分的洗脱峰SE2；
C、C8柱反相高效液相层析
将上述流出体积110-115mL组分以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C8柱层析峰，即得到多肽生长因子Cc-GRN-1组分。
4.根据权利要求3所述的发形霞水母多肽生长因子的制备方法，其特征在于，该方法还包括以下步骤：
D、C18柱反相高效液相层析
将步骤C含多肽生长因子Cc-GRN-1组分用反相C18柱进行二次纯化，以含0.1%三氟乙酸的水和含0.1%三氟乙酸的乙腈构成的洗脱系统进行线性梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰，即得到多肽生长因子Cc-GRN-1单体。
5.一种如权利要求1所述的发形霞水母多肽生长因子在制备损伤修复药物中的应用。
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