CN102816206B - 合成肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉生物技术领域，特别涉及合成肽，所述合成肽含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；所述的合成肽在制备抗感染药物及伤口愈合药物中的应用；本发明所述合成肽是只有6个氨基酸组成的六肽，采用化学方法合成，其生产成本相应降低；相对于其他结构复杂的抗菌肽或生长因子等肽类制剂，更易实现生产，适宜在临床上广泛应用；本发明所述合成肽具有多种活性，除了有高抗菌活性，还有显著的促创伤愈合作用，使用剂量低，每天涂抹一次即可，疗效显著。

Description

合成肽及其应用

技术领域

本发明涉生物技术领域，特别涉及合成多肽及其应用。

背景技术

自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染中取得了较大的成就，但随着抗生素的持续使用，目前微生物抗药性已成为感染控制的重大问题，以至于某些微生物细菌已没有控制杀灭的一线药物。如在临床药物治疗中，万古霉素抗性的葡萄球菌。肠球菌以及其他革兰氏阴性菌感染疾病目前均是世界范围内的临床治疗难题。

抗菌肽是一种小分子的多肽类物质，具有广谱抗菌活性，对原核生物有作用，对真核生物无害。抗菌肽是生物防御系统中产生的一类对抗外源性病原体的肽类物质，是生物天生的、非特异性防御系统的重要组成部分。抗菌肽可与革兰阴性菌外膜的脂多糖或革兰阳性菌表面的肽聚糖结合，使其被破坏而形成穿膜通道，胞内离子大量流出，细胞因高渗破裂而死亡，不易产生耐药性。另外，它还具有免疫调节、促进损伤皮肤修复、中和内毒素及对抗脓毒性休克的作用。因此，抗菌肽在抗感染等方面具有极广泛的应用价值。

但天然抗菌肽在含量、活性、活性依赖于结构、生产成本等方面存在诸多缺陷，成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，开发结构简单、抗菌活性高、具有多种活性的抗菌成为当前抗菌肽开发的迫切需要。

治疗糖尿病人创伤等迁延不愈的创面愈合仍然是临床存在的一大难题。创面愈合是一个有序的细胞调节过程，成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，构成肉芽组织的重要成份，并借助裂隙连接及桥粒产生同步收缩，牵拉基质使胶原重新排列和沉积，通过伤口的收缩活动加速创面闭合。而糖尿病患者自身修复能力减弱，创面常表现为坏死组织不易脱落，肉芽生长迟缓或异常，上皮化速度减慢甚至抑制，基底组织失去生机。不易脱落的坏死组织在愈合中后期形成厚厚的结痂，阻止了外用药物对坏死组织与正常组织界面的有效杀灭作用。因而，增强自身修复能力，加快肉芽组织生长，是促进糖尿病患者创面愈合的重要环节。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种合成肽，该合成肽是在天然LfcinB4-9基础上，采用保守替换和组合化学方法设计而成。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

合成肽，所述合成肽含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

进一步，所述合成肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步，在所述N末端和/或C末端的修饰、环化、替换、L-型氨基酸变D-型氨基酸。

优选的，所述合成肽的浓度大于等于4μg/mL。

本发明的目的之二在于提供所述合成肽的两种应用，该应用为抗感染和伤口愈合治疗提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

所述的合成肽在制备抗感染药物中的应用。

其中，所述合成肽在制备抗革兰氏阴性菌感染药物中的应用。

其中，所述合成肽在制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用。

所述的合成肽在制备伤口愈合剂中的应用。

其中，所述的合成肽在制备糖尿病人创伤愈合剂中的应用。

本发明的有益效果在于：1)本发明所述合成肽是只有6个氨基酸组成的六肽，采用化学方法合成，其生产成本相应降低。2)本发明所述合成肽是由L型氨基酸组成的六肽，结构简单，突破了构象对活性的限制，适合于在原核表达系统中高效表达以实现规模化生产。因此，相对于其他结构复杂的抗菌肽或生长因子等肽类制剂，更易实现生产，适宜在临床上广泛应用。3)本发明所述合成肽具有多种活性，除了有高抗菌活性，还有显著的促创伤愈合作用，使用剂量低，每天涂抹一次即可，疗效显著。

附图说明

图1为糖尿病小鼠创面愈合情况，其中A为所述合成肽组，B为双抗组，C为生理盐水组；自上而下依次为1天、5天、10天、15天、20天、25天的创面愈合情况。

图2为病理切片，左图为抗菌肽组，右图为生理盐水组。

图3为如SEQ ID NO：1所示的合成肽的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件进行或配置，未注明来源的产品均可通过市场途径获得。

本发明所涉及的一种富含Trp/Arg六肽，是对在天然牛乳铁蛋白肽LfcinB活性中心LfcinB4-9的基础上，采用保守替换和组合化学方法设计而成，由上海生工生物工程技术服务有限公司化学合成，所合成多肽HPLC纯度大于98％，利用改良微量肉汤稀释法(Hancock，2000；Giacoetti等，2000)检测多肽的抗菌活性，以预先采用化学合成法得到的天然抗菌肽LfcinB4-9为对照，进行抗菌活性检测，结果本发明中的所述合成肽是杀菌活性明显高于对照抗菌肽的抗菌活性。

氨基酸缩写简称如下：

谷氨酰胺gln Q；甘氨酸gly G；丝氨酸ser S；丙氨酸ala A；苏氨酸thr T；缬氨酸val V；异亮氨酸ile I；亮氨酸leu L；酪氨酸tyr Y；苯丙氨酸phe F；组氨酸his H；脯氨酸pro P；天冬酰胺asn N；甲硫氨酸met M；谷氨酸glu E；色氨酸trp W；赖氨酸lys K；半胱氨酸cys C；精氨酸arg R；天冬氨酸Asp D

实施例1合成肽的制备与纯度检测

本实施例中，涉及到的英文参数，为分析化学领域技术人员公知，可参照张玉奎主编的《分析化学手册(六)液相色谱分析》。另，TFA指三氟乙酸，Acetonitrile指乙腈，HCOOH指甲酸；所涉及的流动相的浓度为体积浓度。

一化学合成

所述合成肽由上海生工生物工程技术服务有限公司化学合成，经HPLC纯化和确认。

二高效液相色谱分析所述高亲和力结合多肽

1色谱条件如下：

Measurement：Peak Area；

Run Time：30min；

Calculation Type：Percent；

Wavelength：220nm；

Flow rate：1.0ml/min；

Inj.Vol：20μL；

Buffer A：0.1％TFA in 100％Acetonitrile；

Buffer B：0.1％TFA in Water；

Column：Kromasil 100-5C18，4.6mmX250mm，5micron；

2结果详见下表或图1：

Rank	Time	Conc.	Area
				1	8.883	0.5009	48497

2	9.100	0.3386	32780
				3	9.325	0.4257	41213
4	9.708	0.5034	48736
				5	10.478	0.8357	80912
6	10.516	12.41	1201332
				7	10.819	63.94	6190606
8	11.000	10.53	1019669
				9	11.165	2.821	273166
10	11.444	1.825	176661
				11	11.696	2.053	198745
12	11.980	0.9936	96197
				13	13.321	0.8282	80186

通过HPLC结果可以看出，在图中出现单一峰，保留时间约10.819min，表明所述合成多肽HPLC纯度大于98％，仅含比较单一的一种物质。

实施例2合成肽的抗菌活性

以下菌株均购自中国生物制品检定所。

按以下步骤测定抗菌肽的抗菌活性：

以LfcinB4-9作为对照抗菌肽。用蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽配制成2560μg/mL储备液，然后用等量无菌的体积分数为0.02％的乙酸(含体积分数为0.4％的BSA)稀释，再用体积分数为0.01％的乙酸(含体积分数为0.2％的BSA溶液)对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为1280、640、320-2.5μg/mL(依次双倍稀释)的系列稀释液。4℃保存备用。

将待测细菌在灭菌肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取单菌落接种于灭菌肉汤培养基，37℃振摇培养或厌氧培养过夜。将培养后的菌液稀释至2×10⁵-7×10⁵CFU/mL，向无菌96孔平板中的1-11孔各加入100μL的菌液，12孔不加菌液而加100μL肉汤。然后从1-10孔逐一加入相应浓度的抗菌肽，11孔作为扫描对照孔不加抗菌肽，抗菌肽终浓度128、64、32……0.25μg/mL(依次双倍稀释)。37℃条件下90转/分，培养18最小抑菌浓度MIC(minimalinhibitory concentration)就是能阻止50％以上细菌生长的最小浓度。用酶标仪在490nm下对平板进行扫描，肽的MIC确定按照比对照孔11孔的浑浊程度低50％以上的最小质量计算。

表1抗菌肽对细菌的最小抑菌浓度(MIC)比较

体外抑菌实验结果显示，所述合成肽的抑菌活性高于LfcinB4-9，但两者无杀菌作用。

分别在所述合成肽的多肽N末端和(或)C末端的修饰、环化、替换、L-型氨基酸变D-型氨基酸，分别得到不同的多种拟肽或多肽系，也具有抗菌活性。

实施例3合成肽在促伤口愈合中的应用

1糖尿病小鼠模型的建立

选择8周龄昆明鼠，禁食不禁水12小时后，按120mg/kg剂量腹腔注射1％链脲佐菌素溶液，分别于注射后第3天和第7天禁食不禁水12小时，尾静脉采血测空腹小鼠血糖浓度，连续两次血糖浓度超过11.1mmol/L者视为小鼠糖尿病模型建立成功。血糖浓度达到要求的小鼠用于建立创伤模型。

2小鼠创伤模型的建立

以0.7g/kg剂量腹腔注射7g/L戊巴比妥钠麻醉小鼠，用8％硫化钠脱毛，待2-3分钟用温水擦拭以便洗去该部位脱下的被毛。在背部皮肤松弛状态下，在背部脊柱上方不宜被自身舔舐和挠伤部位印上8mm印迹，用消毒眼科剪按印迹剪去全层皮肤，形成机械损伤动物模型。此日记为第1天。造模后小鼠单笼饲养，统一喂食，充足给水。

3用药及观察

将创伤模型小鼠小鼠随机分为3组，每组21只，分别为六肽组，青霉素-链霉素(下称双抗)组和生理盐水组。将抗菌肽溶于生理盐水制成0.1mg/mL溶液即为使用浓度。自第1天起，每日定时用棉签蘸取药物或生理盐水涂抹创伤创面，同时观察创面愈合情况，直至伤口完全愈合。取含新生皮肤和创口的小鼠全层皮肤进行组织切片和HE染色观察病理结构。本发明所采用的判断标准为在创面愈合前期主要通过观察创面的组织渗出液及创面直径的收缩情况，在创面愈合中后期主要观察是否出现不易脱落的结痂及愈合时间。

4结果

如图1所示，所述合成肽组于第2天开始无明显可见组织渗出液，创面干爽。双抗组和生理盐水组小鼠在前5天中，半数小鼠创面有渗出液，第6天后结痂逐渐变厚。所述合成肽组小鼠创面从第2天开始愈合速度明显加快，第7天创面直径较第一天缩小约一倍，平均愈合时间为15.5天。双抗组和生理盐水组小鼠前6天创面直径较第1天扩大，第7天创面直径较第1天减小；两者的愈合时间相近，平均愈合时间为27.7天。从愈合速度、炎症反应和结痂厚度来看，所述合成肽对糖尿病小鼠创伤愈合有极显著的促进作用。

表2创面愈合情况

注：由于愈合中后期生理盐水组小鼠创面结痂变厚，影响创面直径测量，只统计前5天愈合情况。*P＜0.05，**P＜0.01

HE染色，如图2所示，涂抹富所述合成肽组小鼠皮肤表皮层结构完整，细胞分层清晰，厚度正常，真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分及数量适中。双抗组和生理盐水组表皮层连续性不差，表皮角质化轻，厚度偏薄，真皮层结构完好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.合成肽，其特征在于，所述合成肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的合成肽，其特征在于，所述合成肽的浓度大于等于4μg/mL。

3.权利要求1-2任一项所述的合成肽在制备抗感染药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述合成肽在制备抗革兰氏阴性菌感染药物中的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述合成肽在制备抗革兰氏阳性菌感染药物中的应用。

6.权利要求1-2任一项所述的合成肽在制备伤口愈合剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的合成肽在制备糖尿病人创伤愈合剂中的应用。