CN102357242B - 重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶 - Google Patents

Abstract

一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。所述凝胶的组分及用量为：重组牛碱性成纤维细胞生长因子10000-30000IU；蛋白保护剂0.5-2.5mg；凝胶基质10-30mg；pH调节剂适量；注射用水加至5ml；该凝胶剂辅料简单，并且能达到较好的稳定性和释放效果，可有效治疗各种烧烫伤、外伤创面。

Description

重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶

技术领域

本发明涉及生物制品领域。特别是涉及一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。

背景技术

皮肤是机体避免遭受感染和脱水的重要屏障，严重创伤、烧烫伤以及某些疾病例如糖尿病引起的皮肤溃疡会给患者带来身体和精神上的巨大影响。因此，对皮肤创面的修复是医药领域十分关注的问题。

自上世纪末开始，已对创伤后的组织修复过程、发生机制和治疗等进行了多种研究，其中，分子生物学的迅速发展以及各学科之间的相互交叉影响，使创伤修复与组织再生等水平得到不断提升。目前，已构建了多种促进肉芽组织生长、血管化和再上皮化的基因，例如表皮细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子等。

已发现碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor，简写为bFGF)在体内可参与多种组织的创伤修复过程，是重要的创伤愈合因子之一，它能诱导微血管的形成、发育和分化，同时直接刺激成纤维细胞和细胞外基质的蛋白合成，以形成胶原纤维，增加创面的抗张力强度，并促进真皮细胞的移行、分裂、分化，以完成皮肤的修复过程，并能促进皮肤软骨组织、骨组织和神经组织损伤修复和肢体再生。大量基础研究和临床试验证实，bFGF对烧伤、外伤及各种慢性难愈合创面具有显著的促修复作用，并且安全、有效、无不良反应。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子(Recombinant bovine basic fibroblast growth factor，简写为rb-bFGF)是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后得到的活性因子。rb-bFGF可促进创面愈合，用于烧伤创面(包括浅II度、深II度、肉芽创面)、慢性创面(包括体表慢性溃疡等)和新鲜创面(包括外伤、供皮区创面、手术伤等)。

中国专利申请200510036465(申请人为南海朗肽制药有限公司)公开了一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，其由重组人碱性成纤维细胞生长因子原液和可药用辅料组成，其中可药用辅料选自卡波姆940NF、透明质酸钠、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐40、肝素钠。中国专利申请200510009218(申请人为北京双鹭立医药科技有限公司)公开了一种重组人碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂，其凝胶基质包括增稠剂(选自重量百分比为0.1-10％的羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙二醇、卡波姆、甲壳胺)、保湿剂、防腐剂、稳定剂、pH调节剂和水。但是，上述公开的两种凝胶剂中均使用了种类多、用量大的辅料，给生产过程和制剂稳定性带来不可预料的困难。

因此，需要开发一种rb-bFGF的凝胶剂，其不仅使用的辅料简单，并且具有较好的稳定性和释放效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题对现有的bFGF凝胶剂进行改进，提供一种经济实用、稳定性好的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶及其制备方法。

本发明的发明目的通过以下的实施方式来实现。

一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，其特征在于所述凝胶的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子10000-30000IU；

蛋白保护剂0.5-2.5mg；

凝胶基质10-30mg；

pH调节剂 适量；

注射用水 加至5ml；

其中，所述的蛋白保护剂选自人血白蛋白、甘露醇和聚乙二醇，优选人血白蛋白；所述的凝胶基质选自羟丙基甲基纤维素和卡波姆，优选羟丙基甲基纤维素和卡波姆；所述的pH调节剂为氢氧化钠或盐酸；

在一个优选的实施方式中，重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子21000IU；

蛋白保护剂1.5mg；

凝胶基质20mg；

pH调节剂 适量；

注射用水 加至5ml；

其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白；所述的凝胶基质为羟丙基甲基纤维素和卡波姆；所述的pH调节剂为氢氧化钠或盐酸；

上述重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备方法包含以下步骤：

(1)将凝胶基质用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；

(2)将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和蛋白保护剂溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；

(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的透明凝胶和步骤(2)得到的溶液混合均匀，分装即得。

优选的，制备方法为：

(1)将10-30mg凝胶基质用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；

(2)将10000-30000IU重组牛碱性成纤维细胞生长因子和0.2-2.5mg蛋白保护剂溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；

(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的透明凝胶和步骤(2)得到的溶液混合均匀，分装即得。

本发明与现有技术相比，具有以下的优点和效果：

①本发明凝胶剂中的辅料种类少、用量低，减少了配伍禁忌和辅料可能给人体带来的危害；

②本发明的凝胶剂释药速度适中、作用持久，能更加有效地促进创面愈合；

③本发明凝胶剂使用方便、经济实用，增加了病人的依从性。

具体实施方式

下面结合本发明较佳的实施例做进一步的说明，这些实施例应理解为不会限制本发明的实施范围，其变型及等同方式均被涵盖在本发明的保护范围内。

实施例1：

处方：

具体制备方法为：

将卡波姆和用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液混合均匀，分装即得。

实施例2：

处方：

具体制备方法为：

将卡波姆、羟丙基甲基纤维素和用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液混合均匀，分装即得。

实施例3：

处方：

具体制备方法为：

将羟丙基甲基纤维素和用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和人血白蛋白溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；在无菌条件下将上述的透明凝胶和滤液混合均匀，分装即得。

试验例1：rb-bFGF外用凝胶促进表皮细胞生长及烧伤创面愈合的实验研究

1、试剂及仪器：rb-bFGF；细胞培养箱；流式细胞仪；电脑图象分析系统。

2、动物烧伤创面模型：选20-25kg白色小猪5只，在实验的前一天用刀片给动物的背部去毛。制成直径为2.5厘米的圆形深II°度烧伤创面18个(烧伤深度由病理切片和免疫组化分析证实)。每3个创面为一平行组，以不含rb-bFGF的生理盐水用于创面作为阴性对照组，直接在创面涂1％的磺胺嘧啶银霜作为阳性对照组。

3、给药方式：创面清创后，阳性对照组的创面直接涂1％的磺胺嘧啶银。其余各组的实验均按双盲法进行，创面在清创后，涂抹实施例1的外用凝胶。以后10天每天以同样的方法换药一次。

4、创面愈合指标：在每次换药时照相，照片经电脑图象分析系统灰度积分来比较分析创面愈合的程度，创面面积越小，表明愈合效果越好。

5、结果：

表1、各样品涂抹前和涂抹48小时后的平均创面面积(cm²)

	本发明组	阳性对照组	阴性对照组
				涂抹前	4.92	4.95	4.90
涂抹后	4.13	4.52	4.88

从表1可以看出，当分别涂抹本发明组、阳性对照组和阴性对照组样品48小时后，在倒置显微镜下可观察到，含rb-bFGF的本发明组的平均创面面积小于不含rb-bFGF的对照组。

表2、涂抹各样品后不同时间的平均创面面积(cm²)

	本发明组	阳性对照组	阴性对照组
				第0天	4.92	4.95	4.90
第2天	4.13	4.52	4.88
				第4天	3.56	4.01	4.63
第6天	2.73	3.49	4.11
				第9天	0.18	2.02	2.49
第13天	0.05	0.83	1.89

从表2可以看出，本发明组连续应用于猪的深II°烧伤创面2天后，与对照组之间外观有较明显的区别。用电脑图象分析技术分别计算伤后第0、2、4、6、9、13天时的创面面积，实验结果显示在创面愈合过程中应用含rb-bFGF的本发明组的烧伤创面的愈合速率明显大于对照组。

试验例2：稳定性研究

1、高温高湿试验：

将实施例1的外用凝胶灌装于内涂层封口铝管中，密封置于40℃、相对湿度75％条件下进行加速实验，分别于1、5、10天检测凝胶的含量、pH、外观、涂展性、无菌和离心试验(300r/min)。结果如下表：

表3、高温高湿结果

	1天	5天	10天
				含量	100.01％	99.98％	99.85％
pH	7.0	7.0	7.0
				外观	无色透明	无色透明	无色透明
涂展性	好	好	好
				无菌	合格	合格	合格
离心试验	无分层	无分层	无分层

结果表明，本发明的外用凝胶在高温高湿试验中质量稳定。

2、低温试验：

将实施例2的外用凝胶灌装于内涂层封口铝管中，密封置于4℃下进行实验，分别于1、3、6月检测凝胶的的含量、pH、外观、涂展性、无菌和离心试验(300r/min)。结果如下表：

表4、低温试验结果

	1个月	3个月	6个月
				含量	99.97％	100.02％	99.95％
pH	7.0	7.0	7.0
				外观	无色透明	无色透明	无色透明
涂展性	好	好	好
				无菌	合格	合格	合格
离心试验	无分层	无分层	无分层

结果表明，本发明的外用凝胶在低温试验中质量稳定。

Claims (3)

1.一种重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，其特征在于所述凝胶的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子10000-30000IU；

蛋白保护剂0.5-2.5mg；

凝胶基质10-30mg；

pH调节剂 适量；

注射用水 加至5ml；

其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，所述的凝胶基质选自羟丙基甲基纤维素和卡波姆，所述的pH调节剂为氢氧化钠。

2.根据权利要求1所述的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，其特征在于所述凝胶的组分及用量为：

重组牛碱性成纤维细胞生长因子21000IU；

蛋白保护剂1.5mg；

凝胶基质20mg；

pH调节剂 适量；

注射用水 加至5ml；

其中，所述的蛋白保护剂为人血白蛋白；所述的凝胶基质为羟丙基甲基纤维素和卡波姆；所述的pH调节剂为氢氧化钠。

3.根据权利要求1或2所述的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将凝胶基质用适量注射用水溶胀，调pH值使形成透明凝胶，然后在121℃热压灭菌，冷却后备用；

(2)将重组牛碱性成纤维细胞生长因子和蛋白保护剂溶于适量的注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌；

(3)在无菌条件下将步骤(1)得到的透明凝胶和步骤(2)得到的溶液混合均匀，分装即得。