CN106562953A - 羟基红花黄色素a在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用、药物及药物制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羟基红花黄色素A(HSYA)在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用，还提供了一种治疗糖尿病足溃疡的药物及其制备方法。HSYA能通过上调VEGF和TGF‑β1的表达量来加快血管的新生，促进细胞外基质的沉积与肉芽组织的形成，从而加快溃疡的修复，缩短溃疡愈合时间。将其赋合于水凝胶敷料中，更进一步提升了药效，在促进溃疡愈合同时还提升了其愈合质量，使其更接近于正常皮肤的状态。

Description

羟基红花黄色素A在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用、 药物及药物制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及羟基红花黄色素A在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用、药物及药物制备方法。

背景技术

糖尿病足是糖尿病的严重并发症之一，伴随有足部溃疡、肢端坏疽等病变，发病率高达25％。其中15％以上的患者还随时面临着截肢、甚至是死亡的潜在危险。糖尿病足溃疡具有发展迅速、愈合困难、易感染和反复发作等特点，严重威胁着糖尿病患者的健康和生活质量，导致患者生活能力丧失，其高发病率和致死率已成为一个重要问题。

糖尿病造成的神经及外周血管病变是导致糖尿病足溃疡形成和发展的危险诱因。糖尿病状态下，持久的病理性高糖环境促进了糖基化反应的发生，从而使患者体内含有过高浓度的糖基化终末产物(AGEs)，它能直接抑制神经传导，损伤神经细胞和血管内皮细胞，从而引发患者的神经及外周血管病变，导致患者下肢末端血流不足，感觉缺失，关节畸形，增加足跖部压力而发生溃疡。另外，过度的炎症反应、过高的蛋白酶活性与活性氧群还阻碍了细胞外基质的沉积与肉芽组织的形成，进一步推迟了溃疡的愈合周期。

糖尿病足发病机理复杂，故其临床治疗也十分困难。目前，临床上常用的治疗方法主要包括抗感染、局部减压清创、必要时的血管重建，以及近年来的高压氧、敷料、负压引流、细胞生长因子、干细胞移植治疗等。作为一种辅助治疗手段，生物敷料的使用是目前治疗糖尿病足溃疡的主要方法，因为保持一个湿润清洁的创面环境可以有效防止组织失水、感染、细胞坏死、还有利于血管及肉芽组织的生成。

水凝胶是一种能在水中显著溶胀，但又不能溶解的三维网络状亲水聚合物凝胶，其无毒、易降解、生物相容性好，被广泛应用于伤口修复、组织工程等领域，还可作为各种生长因子、药物和基因的载体。但是普通的网络结构水凝胶在溶胀条件下力学性能较差，而双组分的互穿网络结构聚合物(IPN)水凝胶则能克服上述缺点，既有良好的力学性能又有大溶胀比。将药物分散于水凝胶体内，可以防止药物的流失与降解，减少给药次数，有利于药物在体内的释放与吸收，从而增加治疗效果。

目前，临床上糖尿病足的主治药物还是以细胞因子等生物药为主，缺乏创新性，需要找到一种新的、有效的糖尿病溃疡治疗药物。

血管病变导致的下肢供血不足、微循环障碍是糖尿病足形成的主要原因之一，因此促进血管新生是现代研究中用于治疗糖尿病足的常用手段之一，研究证实，促进血管新生能改善微循环，利于肉芽组织的新生与再上皮化。而红花是传统的活血化瘀中药，临床可用于防治心脑血管病以及食管癌、胃癌、肝癌等多种疾病。红花黄色素是红花的主要水溶性组分，其中羟基红花黄色素A(HSYA)则是红花黄色素的主要单体成分。近年来人们对HSYA的研究主要集中在对心肌的保护作用、减轻心脑缺血损伤的作用、降血压作用以及抗凝血、抑制血栓形成等作用上，对其在糖尿病足上的相关应用还尚未公开。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羟基红花黄色素A在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用，还提供了一种治疗糖尿病足溃疡的药物及其制备方法。

所述的羟基红花黄色素A结构如下所示：

作为优选，所述的羟基红花黄色素A的纯度为98％以上。羟基红花黄色素A可以为市售的中药单体。

血管内皮细胞是创面愈合中主要的修复细胞之一，其分泌的VEGF作为内源性生长因子，能够对血管内皮细胞产生强烈的趋化作用和促分化作用，使其增殖、迁移，从而促进新生血管的形成，加速创面愈合。创伤愈合早期VEGF会大量表达来加快血管新生，为组织提供氧气和营养物质，促进创伤的有效修复；而创伤后期随着肉芽组织的生成，VEGF含量下降，血管生成减少，恢复到正常水平，以防止血管过度增生导致的瘢痕形成。

转化生长因子TGF-β1主要由成纤维细胞分泌，其在创伤愈合过程中起着至关重要的作用。转化生长因子TGF-β1能刺激血管的新生，加速成纤维细胞的迁移与增殖，同时促进胶原蛋白的形成及细胞外基质的沉积与成熟，从而加速溃疡的愈合。同样地，创伤早期TGF-β1含量会上升，愈合后期含量则会下降，一旦平衡被打破，则容易造成细胞外基质的过度沉积，生成瘢痕组织。

VEGF和TGF-β1作为创伤修复过程中的重要调控因子，参与了一系列的愈合过程。

本发明中通过研究发现，羟基红花黄色素A通过上调皮肤组织中转化生长因子TGF-β1的表达，促进胶原蛋白的形成及细胞外基质的沉积与成熟的同时，上调皮肤组织中血管内皮生长因子VEGF的表达，促进血管的新生与重建，从而加速糖尿病足溃疡皮肤再生和创面愈合。

本发明还提供了一种治疗糖尿病足溃疡的药物，所述的药物由羟基红花黄色素A和医学上可接受的药物辅料组成，羟基红花黄色素A在药物中的质量百分比含量为0.02％～0.2％，所述的药物为外用药。

药物中羟基红花黄色素A的含量较低，该药物加速糖尿病组溃疡皮肤再生和创面愈合的效果不理想，而药物中羟基红花黄色素A的含量过高时，会对细胞产生一定毒性，不利于创面的愈合，作为优选，羟基红花黄色素A在药物中的质量百分比含量为0.05％～0.2％。

水凝胶是一种能在水中显著溶胀，但又不能溶解的三维网络状亲水聚合物凝胶，其无毒、易降解、生物相容性好，被广泛应用于伤口修复、组织工程等领域，还可作为各种生长因子、药物和基因的载体。

作为优选，所述的药物为水凝胶敷料。

普通的网络结构水凝胶在溶胀条件下力学性能较差，作为优选，所述的药物辅料为由可降解的天然高分子材料以网络的形式互相贯穿而形成的互穿网络结构聚合物(IPN)水凝胶。

互穿网络结构聚合物水凝胶既有良好的力学性能又有大溶胀比。

作为优选，所述的天然高分子材料包括壳聚糖和明胶。

天然高分子多聚物壳聚糖是由甲壳素经过脱乙酰化反应而得到的，是一种生物可降解的聚阳离子多糖，具有抗菌、止血、来源丰富等特点，能加速创伤愈合过程中的炎症细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等发挥相应的功能。但由于壳聚糖本身分子间具有较强的氢键作用，使得其凝胶脆性大、力学性能欠佳，从而限制了其推广应用。

明胶是胶原断裂形成的天然性多肽，亲水性强，生物相容性与降解性好，将其与壳聚糖共混制备水凝胶敷料，可明显改善凝胶的力学性能和溶胀性能等，使该敷料具有良好的生物粘附性和孔隙率，能有效提高伤口对组织液的吸收率，保持创伤部位的湿润。敷料上的小孔还有利于细胞的呼吸作用，为细胞提供适宜生长基质的同时保护伤口免受细菌侵入。

将羟基红花黄色素A分散于水凝胶体内，可以防止药物的流失与降解，减少给药次数，有利于药物在体内的释放与吸收，从而增加治疗效果。

本发明还提供了上述治疗糖尿病足溃疡药物的制备方法，包括：

(1)将明胶与双蒸水混合，在40～50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为1～5％；

(2)将壳聚糖加入到醋酸溶液中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1～5％；

(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在40～50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为0.1～9∶1；

(4)向混合溶液中加入交联剂，在40～50℃下搅拌1～2天进行交联得到凝胶体系；所述的交联剂为甲醛、戊二醛、双醛淀粉、环氧化合物或京尼平；

(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素A在40～50℃下搅拌2～12h，使羟基红花黄色素A均匀地分散与凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物。

作为优选，步骤(2)中，醋酸溶液中醋酸的质量分数为0.02～0.2％。

作为优选，治疗糖尿病足溃疡的药物中羟基红花黄色素A的质量分数为0.02％～0.2％；进一步优选的，羟基红花黄色素A的质量分数为0.05％～0.2％。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种新药，首次将羟基红花黄色素A应用于糖尿病足溃疡的治疗中，动物实验结果表明羟基红花黄色素A能通过促进的血管新生来加速溃疡的愈合；

本发明提供的羟基红花黄色素A水凝胶生物相容性好，易于涂抹，能防止药物的流失，减少用药次数，在一定程度上提高药效；此外，该生物敷料具有多孔性，有利于气体交换，可以防止细菌入侵，同时还能够有效地吸收伤口渗出液，使伤口维持在湿润的环境下，加快血管内皮细胞与成纤维细胞的增殖、迁移，刺激其分泌更多的生长因子，促进血管新生与肉芽组织的形成，从而加速溃疡的愈合并提升其愈合质量。

羟基红花黄色素A还能负载于其他不同的载体材料中，通过局部或其他给药途径来实现对糖尿病足溃疡的治疗。

附图说明

图1(A)为实施例4中的SD大鼠在注射STZ(链脲佐菌素)两周后的体重监测情况；

图1(B)为实施例4中的SD大鼠在注射STZ两周后的血糖监测情况；

图2(A)为实施例5中的HSYA水凝胶及其溶液对大鼠糖尿病溃疡的修复情况；

图2(B)为实施例5中的HSYA水凝胶及其溶液对大鼠糖尿病溃疡的愈合率的结果；

图3(A)为实施例6中的HSYA水凝胶及其溶液对大鼠糖尿病溃疡皮肤组织中VEGF的上调作用；

图3(B)为实施例6中的HSYA水凝胶及其溶液对大鼠糖尿病溃疡皮肤组织中TGF-β1的上调作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

实施例1：羟基红花黄色素A(HSYA)水凝胶的制备

(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为2.5％；

(2)将壳聚糖加入到醋酸溶液中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为3％；

(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为5∶5；

(4)向混合溶液中加入京尼平，在40℃下搅拌1天进行交联得到凝胶体系；

(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素A在40℃下搅拌12h，使羟基红花黄色素A均匀地分散与凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物；

药物中羟基红花黄色素A的质量分数为0.2％。

实施例2：羟基红花黄色素A水凝胶的制备

(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为3％；

(2)将壳聚糖加入到醋酸溶液中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为3％；

(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为1∶9；

(4)向混合溶液中加入京尼平，在50℃下搅拌1天进行交联得到凝胶体系；

(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素A在40℃下搅拌12h，使羟基红花黄色素A均匀地分散与凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物；

药物中羟基红花黄色素A的质量分数为0.05％。

实施例3：羟基红花黄色素A水凝胶的制备

(1)将明胶与双蒸水混合，在50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为3％；

(2)将壳聚糖加入到醋酸溶液中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为5％；

(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为9∶1；

(4)向混合溶液中加入京尼平，在50℃下搅拌2天进行交联得到凝胶体系；

(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素A在40℃下搅拌12h，使羟基红花黄色素A均匀地分散于凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物；

药物中羟基红花黄色素A的质量分数为O.1％。

实施例4：糖尿病大鼠模型的建立

受试动物为SPF级SD雄性大鼠21只，体重220～240g，自由饮水饮食，饲养间室温保持在25±1℃，明暗周期为12小时。

1.糖尿病大鼠模型的建立

待SD大鼠适应环境一周后，随机选取15只作为糖尿病组，6只作为正常对照组。15只大鼠用链脲佐菌素(STZ)75mg/kg腹腔注射(STZ以pH4.2，0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液溶解，配制成质量分数为2.5％溶液，以0.3ml/100g注射)，其余6只大鼠不作处理。

7天后尾静脉采血，用血糖仪检测随机血糖水平，一周检测两次血糖和体重，持续两周，若随机血糖水平都＞16.7mmol/L，且伴随有多食、多饮、多尿和体重减轻的情况，则视为糖尿病大鼠造模成功。

2.实验结果

大鼠的体重和血糖监测结果见图1(A)、图1(B)所示。如图1(A)所示，与正常对照组大鼠相比，注射了STZ的大鼠体重显著减轻，在两周内呈现明显的不升反降趋势，符合I型糖尿病的基本症状。图1(B)展示了注射STZ 7天后不同组别的随机血糖变化情况，正常对照组大鼠的血糖水平能够一直维持在5.4mmol/L左右，而STZ注射组中血糖水平显著升高，其值均大于16.7mmol/L，表明本研究所需的糖尿病模型建立成功。

实施例5：羟基红花黄色素A对糖尿病溃疡的愈合的影响

1.糖尿病溃疡模型的建立

按照实施例4所描述的方法进行分组并建立糖尿病模型。6周后，糖尿病大鼠腹腔注射10％的水合氯醛(0.3ml/100g)进行麻醉，麻醉后用剃毛刀剃除大鼠背部的毛发，再用碘伏进行消毒。在每只大鼠背部制造2个直径为1cm的全层皮肤创面，深至皮下筋膜处，止血后自然暴露，然后用医用缝合线将0.5mm厚的环形硅胶夹板缝合在伤口周围，防止伤口收缩。造好创面后，用药组每只老鼠两个创面上分别给予不同药物。

2.大鼠的分组给药情况

糖尿病溃疡大鼠15只，正常大鼠6只，按照表1进行分组给药，给药方式为局部涂抹给药(羟基红花黄色素A水凝胶为实施3所制备的水凝胶)，所有组1次/1天，每天观察伤口变化情况。每隔3天拍照一次，并临摹伤口。糖尿病大鼠实验期间自由进食和饮水，每周监测体重和血糖。并按照下列公式计算创伤的愈合率：伤口愈合率(％)＝[(0天创伤面积-N天创伤面积)/0天面积]×100％。于最后一天处死大鼠，将实验开始时圈定部位的皮肤剪下，-80℃冷冻保存，以备之后的考察。

表1.糖尿病大鼠给药分组情况

3.实验结果

大鼠的糖尿病溃疡修复情况见图2(A)、图2(B)。与糖尿病组大鼠相比，非糖尿病鼠的创伤愈合速度(92.7±1.7％)要明显快于糖尿病组(82.3±3.6％)，尤其是在创伤愈合后期(12天后)有显著性差异(P＜0.01)。糖尿病用药组中，与空白对照组相比，羟基红花黄色素A及其水凝胶均能够在一定程度上促进慢性伤口的愈合，使伤口恢复的更为平整，减少瘢痕的产生。创伤愈合后期(16天)，HSYA水凝胶的愈合率(92.8±3.0％)显著高于空白对照组(85.9±2.4％)。

注：图2(A)、图2(B)中，与糖尿病空白对照组相比，*：P＜0.05；#：P＜0.01

实施例6：羟基红花黄色素A皮肤组织中VEGF和TGF-β1的表达的影响

1.糖尿病大鼠溃疡创面的皮肤组织中VEGF和TGF-β1的含量测定

取出-80℃冰箱的皮肤组织，放入4℃冰箱过夜解冻。取脱毛后创伤修复后的皮肤组织在预冷的PBS中漂洗，去除皮下脂肪和结缔组织，滤纸拭干，称重。将称重后的皮肤组织放入4ml EP管中，加入3ml PBS缓冲液，随后将皮肤剪碎，再于冰浴条件下进行高速匀浆。将匀浆液放入1.5ml EP管中，15000rpm高速冷冻离心0.5h，取上清液。按照博士德大鼠ELISA试剂盒的说明来进行VEGF和TGF-β1的含量测定。

2.实验结果

如图3(A)、图3(B)所示，与正常健康的大鼠相比，糖尿病溃疡大鼠皮肤组织中的VEGF和TGF-β1表达水平均出现显著性下降。给予HSYA及其凝胶治疗后，糖尿病溃疡大鼠皮肤组织中的VEGF和TGF-β1的表达量显著上调(P＜0.01)，其中HSYA的凝胶治疗组中的VEGF和TGF-β1含量更接近于正常皮肤组。可见，HSYA及其凝胶能在创伤愈合过程中显著上调VEGF和TGF-β1的表达，加速伤口的愈合，提升伤口愈合质量，其中HSYA的凝胶修复的皮肤更接近于正常皮肤。

注：3(A)、图3(B)中，与糖尿病空白对照组相比，*：P＜0.05；#：P＜0.01

综上，羟基红花黄色素A及其水凝胶均能促进糖尿溃疡的愈合并提升创面愈合质量。具体表现为：通过上调VEGF和TGF-β1的表达，促进血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖、迁移、分化，从而加快血管的新生，促进细胞外基质的沉积与肉芽组织的形成，加速了溃疡的愈合。水凝胶良好的稳定性，生物相容性与高孔隙率，利于细胞的增殖与相互作用，更进一步提升了药效，在促进溃疡愈合同时还提升了其愈合质量，使其更接近于正常皮肤的状态。

Claims (9)

1.羟基红花黄色素A在制备治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的羟基红花黄色素A的纯度为98％以上。

3.一种治疗糖尿病足溃疡的药物，其特征在于，所述的药物由羟基红花黄色素A和医学上可接受的药物辅料组成，羟基红花黄色素A在药物中的质量百分比含量为0.02％～0.2％，所述的药物为外用药。

4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述的药物辅料为由可降解的天然高分子材料以网络的形式互相贯穿而形成的互穿网络结构聚合物水凝胶。

5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述的天然高分子材料包括壳聚糖和明胶。

6.一种根据权利要求3～4所述治疗糖尿病足溃疡药物的制备方法，其特征在于，包括：

(1)将明胶与双蒸水混合，在40～50℃下搅拌至完全溶解，得到明胶溶液；明胶溶液中明胶的质量分数为1～5％；

(2)将壳聚糖加入到醋酸溶液中，待其溶胀后搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数为1～5％；

(3)将明胶溶液与壳聚糖溶液混合，在40～50℃下搅拌均匀得到混合溶液；明胶溶液与壳聚糖溶液的质量比为0.1～9∶1；

(4)向混合溶液中加入交联剂，在40～50℃下搅拌1～2天进行交联得到凝胶体系；所述的交联剂为甲醛、戊二醛、双醛淀粉、环氧化合物或京尼平；

(5)向交联体系中加入羟基红花黄色素A，在40～50℃下搅拌2～12h，使羟基红花黄色素A均匀地分散于凝胶体系中得到治疗糖尿病足溃疡的药物。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，治疗糖尿病足溃疡的药物中羟基红花黄色素A的质量分数为0.02％～0.2％。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，治疗糖尿病足溃疡的药物中羟基红花黄色素A的质量分数为0.05％～0.2％。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，醋酸溶液中醋酸的质量分数为0.02～0.2％。