CN103083226B - 成纤维细胞生长因子-1改构体凝胶剂制备及在糖尿病足治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有成纤维细胞生长因子-1改构体的凝胶剂的制备方法及在糖尿病足引起的慢性皮肤溃疡治疗中的应用。本发明所述的凝胶剂的组分及用量为：重组人成纤维细胞生长因子-1改构体(FGF-1₁₃₅)蛋白20000～80000IU；低分子量肝素钠为10μg～40μg；甘油含量为0.2g～1.0g；蛋白保护剂为50mg～150mg；凝胶基质为0.03g～0.05g；调节pH值，加注射用水至10ml。本发明中所用的成纤维细胞生长因子-1改构体比原序列更加稳定，制备成凝胶剂后更方便于临床应用，并能达到较好的稳定性和缓释效果，提高了蛋白的生物利用度，更有利于糖尿病足的治疗。该凝胶剂还可用于烧烫伤及其他慢性、难愈性溃疡的治疗。

Description

成纤维细胞生长因子-1改构体凝胶剂制备及在糖尿病足治疗中的应用

技术领域

本发明涉及一种含有重组人成纤维细胞生长因子-1改构体(FGF-1₁₃₅)蛋白的用于治疗糖尿病足等疾病的凝胶剂制备及应用，属生物医药领域。

背景技术

糖尿病(Diabetesmellitus，DM)是一种多种因素引起的全身代谢性疾病，目前全世界超过1.8亿人患有糖尿病，已经成为全球性重大公共卫生问题。糖尿病患者中约有30％～80％合并有皮肤损害，严重危害糖尿病病人的健康，其中最典型和危害最大的为糖尿病足。糖尿病足(DiabeticFoot，DF)是DM的常见慢性并发症之一，主要是以糖代谢紊乱为前提的综合因素作用的结果。糖尿病代谢异常引起的高血糖、高血脂及其所产生的代谢产物一方面可致神经轴突、神经鞘膜及雪旺细胞变性致使感觉神经、运动神经、自主神经功能障碍，导致感觉缺失、皮肤干裂、组织抵抗力降低易于感染坏疽；另一方面可使血小板聚集力增强、血液粘稠度增加，促进动脉粥样硬化及血栓形成，使血管腔狭窄或闭塞，导致肢端缺血坏死溃烂。缺血及神经损伤又使局部组织愈合能力、抗感染能力降低因而伤口不易愈合。在病理生理方面主要表现为创面组织细胞代谢异常，免疫功能紊乱，尤其是创面局部巨噬细胞、肥大细胞功能失调，并伴随有创面微环境中生长因子功能受损，创面局部微循环灌注障碍，组织缺氧等，从而造成创面经久不愈从而引起难以愈合的溃疡，往往会导致坏疽或截肢，大大降低了患者的生存质量，而且治疗相当困难，周期长，医疗费用高，给患者带来极大痛苦及沉重的负担。据统计每年大约有3％～6％糖尿病患者发生足部溃疡，其中70％的患者需要手术治疗，欧美国家40％～70％的下肢截肢与糖尿病有关，美国每年约有5万例以上的糖尿病截肢手术，我国糖尿病截肢率在14％～22％。随着现代糖尿病的发生率不断上升，糖尿病足所带来的社会问题和经济负担不断加重。

目前临床上糖尿病足的治疗方法主要有药物治疗、外科手术治疗、自体干细胞移殖治疗等。外科手术及自体干细胞移殖治疗费用高、专业性强，对病人的耐受性也有较高要求，因此开发促进肉芽生长和创面愈合有效药物，促进糖尿病足的早期愈合、缩短病程和降低致残率，是当今医学领域研究的重要课题之一，越来越受到研究人员和生产企业的重视。

成纤维细胞生长因子-1亦称为酸性成纤维细胞生长因子(acidicFibroblastgrowthfactor，aFGF)是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型细胞具有广泛的生物学活性的细胞因子。作为一个高度保守的功能蛋白，大量的研究已充分证实了成纤维细胞生长因子家族成员在促进创伤愈合、溃疡愈合、血管再生、神经组织修复、神经突起生长等方面具有突出的功效，孕育着巨大的临床应用前景。由于溃疡创面是细菌等微生物繁殖的温床，创面自身及细菌等微生物的分泌物使创面这一微环境呈酸性。haFGF在这一微环境中较碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)稳定，更有利于发挥其生物学活性。此外，与表皮生长因子(EGF)相比较，EGF可促进I型胶原的合成，导致瘢痕疙瘩形成，而haFGF能通过对I型前胶原基因表达的下行调节作用，抑制成纤维细胞的胶原合成，减少成纤维细胞的胶原蛋白的过量沉积，有助于防止瘢痕疙瘩的产生。因而应用haFGF治疗糖尿病足溃疡等慢性难愈性伤口有着广阔的前景，可提高这类病人的伤口愈合速度和质量，进而提高患者的生活质量。

目前，美国CardioVascularBioTherapeutics(CVBT)公司应用aFGF治疗糖尿病足为目标的一期临床试验已完成，已进入二期临床试验阶段，发展前景非常乐观。国内外也有临床使用bFGF、EGF、G-CSF、PDGF等生长因子与其他药物配合治疗糖尿病足的报道，显示具有明显的临床疗效。本发明中重组人成纤维细胞生长因子-1改构体(mrhFGF-1，FGF-1₁₃₅)与美国CVBT公司相比具有以下特点：根据FGF-1的活性结构域位于C端，N末端部分氨基酸的缺失不影响FGF的生物学活性的特性，去除了N末端影响蛋白表达及稳定性的19个氨基酸，使表达量由80mg/L提升到200mg/L以上；体外细胞测活与药效学表明，N末端缺失19个氨基酸不影响FGF-1的生物学活性；缺失后重组蛋白的N末端降解问题与二聚体形成明显降低。同时，也通过动物实验证实FGF-1₁₃₅对糖尿病性皮肤溃疡具有较为显著疗效，并进一步证明其用药的安全性。

发明内容

对目前成纤维细胞生长因子-1冻干粉制剂对糖尿病足等难愈性溃疡的临床应用中的不足进行改进，提供简单实用、稳定性及疗效好的凝胶剂及其制备方法。

本发明目的是提供FGF-1凝胶剂制备方法。

本发明进一步目的是在于提供FGF-1凝胶剂在糖尿病足溃疡疾病中的应用。

本发明还可应用于烧烫伤、褥疮等难愈性溃疡的临床治疗。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

本发明提供了一种重组人成纤维细胞生长因子-1改构体凝胶剂的制备方法。按照发明的实施例方案，卡波姆重量0.3％～1.0％，优选0.5％作为凝胶基质；人血白蛋白重量0.5％～1.5％，优选1.0％作为蛋白保护剂；低分子量肝素重量0.1％mg～0.4％mg，优选0.5％mg作为保护细胞活性，并减缓其释放；甘油重量2.0％～10.0％，优选5.0％作为凝胶保湿剂。

在本发明的凝胶剂中，重组人成纤维细胞生长因子-1改构体有效剂量2000IU/g～8000IU/g，优选6750IU/g，该剂量能有效促进1型及2型糖尿病溃疡模型创面的有效愈合。

本发明还提供了凝胶剂的制备方法，包括基质溶胀及灭菌即将卡波姆940中加入甘油，搅拌充分混匀，用适量注射用水充分溶胀，调节pH值使其形成透明凝胶，121℃、30min高压灭菌。冷却后备用；将重组人成纤维细胞生长因子-1改构体蛋白、人血白蛋白及肝素，加入适量冷却的注射用水中充分混匀，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌；在无菌条件下，将上述两种物质充分混合，分装即得。

本发明具有以下优点：

1.本发明采用卡波姆940作为基质材料，具有延展性好、易于涂抹和附着于皮肤，对皮肤及粘膜无刺激性并能吸收组织渗透液，有利于分泌物的排出；无油腻性，释药迅速，与皮肤组织耦合效果好等特性。

2.本发明配伍合理，可达到稳定负载FGF-1蛋白于凝胶剂中，并保持其生物活性、延缓释放的作用，促进创面有效愈合。采用的组分均对皮肤无毒副作用、无刺激性，便于清洁。

3.本发明产品可直接涂抹于创面部位，使用方便，增加患者的依从性和临床应用。

附图说明

图1皮肤外伤性溃疡模型

图2皮肤烫伤性溃疡模型

图3FGF-1₁₃₅凝胶剂对1型糖尿病SD大鼠皮肤外伤及烫伤治疗愈合情况

图4FGF-1₁₃₅凝胶剂对2型糖尿病GK大鼠皮肤外伤及烫伤治疗愈合情况

图5FGF-1₁₃₅凝胶剂对1型糖尿病GK大鼠皮肤外伤及烫伤皮肤组织病理学检查

图6FGF-1₁₃₅凝胶剂对1型糖尿病GK大鼠皮肤创伤及烫伤皮肤组织病理学检查

具体实施方式

实施例1生产加载FGF-1₁₃₅的凝胶剂

基质溶胀及灭菌：将卡波姆940中加入甘油，搅拌充分混匀，用适量注射用水充分溶胀，调节pH值使其形成透明凝胶，121℃、30min高压灭菌。冷却后备用；

蛋白除菌过滤：将重组人成纤维细胞生长因子-1改构体蛋白、人血白蛋白及肝素，加入冷却的注射用水中充分混匀，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌；

凝胶剂制备：在无菌条件下，将上述两种物质充分混合，分装即得。

作为基质材料卡波姆具有延展性好、易于涂抹和附着于皮肤，对皮肤及粘膜无刺激性并能吸收组织渗透液，有利于分泌物的排出；无油腻性，释药迅速，与皮肤组织耦合效果好等特性。加入低分子量肝素是因为FGF-1为肝素亲和性生长因子，具有特异的糖胺聚糖-蛋白质相互作用，可达到稳定负载于载体材料中，并保持其生物活性、延缓释放的作用，对细胞的生长、迁移具有调节作用。加入人血白蛋白及甘油对蛋白的稳定性具有良好保护作用。

实施例2测定凝胶剂活性

采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定凝胶剂活性。Balb/c3T3细胞用完全培养液，于37℃、5％CO2培养至对数生长期。弃去培养瓶中的培养液，消化并收集细胞，加完全培养基调整细胞悬液浓度，使待测细胞密度为50000-100000个/ml，按每孔100μl接种于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养24h，换维持培养基继续培养24h。弃去维持液，加入标准品及用培养基溶解并按一定浓度稀释的凝胶样品溶液，每孔100μl，37℃、5％CO2培养箱中培养64h～72h。每孔加入20μlMTT溶液，继续培养5h。倒掉液体，每孔加100μl二甲基亚砜溶液，混匀后在酶标仪上以630nm为参比波长，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果，计算供试样品的生物学活性。

实施例3测定凝胶剂的稳定性

通过测定不同温度下，凝胶剂的稳定性实验结果表明，在4℃、25℃、37℃保存12个月，凝胶剂无霉变现象，其外观、pH值等理化指标均未发生变化；载药凝胶剂的生物学活性在室温条件下，稳定性差，放置3个月后活性有较明显降低，而低温条件对载药凝胶剂的的存放无明显影响。

表1FGF-1凝胶剂在25℃稳定性试验结果

表2FGF-1凝胶剂在4℃稳定性试验结果

实施例4在1型和2型糖尿病大鼠实验模型中证明，含FGF-1₁₃₅蛋白的凝胶制剂对糖尿病大鼠的皮肤创伤和烫伤创面有非常明显的促进愈合作用

实验动物模型制备：

1、糖尿病模型

①1型糖尿病模型：选用体重180-220g的雄性SD大鼠，用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)剂量按70mg/kg，临用前溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液中腹腔注射，每天一次，连续2天，自第一次注射72h后测量空腹血糖在11.1mmol/L以上即为模型合格。

②2型糖尿病模型：选用4月龄雄性GK大鼠。

2、溃疡模型：

①外伤性溃疡模型：大鼠用戊巴比妥纳45mg/kg腹腔注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，在背部左右两侧各做一个直径1.8cm圆形标记，用碘伏皮肤消毒后沿标记线将全层皮肤切除，形成面积约2.45cm²的新鲜创面(图1)。创面按压止血，暴露治疗，编号并单笼饲养，给普通鼠粮自由摄取。。

②烫伤性溃疡模型：大鼠用戊巴比妥纳45mg/kg腹空注射麻醉，背部用脱毛剂脱毛，用烫伤仪在背部烫出直径为1.8cm的深II度烫伤创面，烫伤条件为：烫头温度85℃；压力0.5kg时间为10秒(图2)。创面暴露不包扎，编号后单笼饲养，给普通鼠粮自由摄取。

实验动物分组：造模当日，选取造模成功的小鼠在不禁食状态检查血糖水平，将血糖水平接近的动物分在一组，共分为7组。

第I组—FGF-1₁₃₅凝胶剂10U/cm²组

第II组—FGF-1₁₃₅凝胶剂30U/cm²组

第III组—FGF-1₁₃₅凝胶剂90U/cm²组

第IV组—FGF-1₁₃₅凝胶剂270U/cm²组

第V组—FGF-1₁₃₅冻干粉阳性对照组

第VI组—溶剂对照组(FGF-1₁₃₅溶媒)

第VII组—空白对照组(生理盐水)

每组均由10只小鼠组成，每日给药1次，连续给药21天。创面形成后当天开始治疗，治疗组一侧(左侧)创面涂相应浓度的受试药物，另一侧给等体积溶媒作为对照；阴性对照组一侧创面给等体积的生理盐水，另一侧不做任何处理。创面形成后当天开始治疗，每天一次，治疗前用双氧水、生理盐水冲洗伤口并用碘伏消毒创面，然后用给相应药物0.2ml并用棉签涂均匀。

测定对外伤性损伤和烫伤性损伤的治疗作用：

1、1型糖尿病SD大鼠所有实验动物从创面形成当天到治疗结束，伤口表面干燥无渗出，无化脓溃烂现象，从表3和表4可以看出，载药凝胶剂对I型糖尿病SD大鼠创伤性和烫伤性皮肤损伤均有较好的治疗效果，从创面形成(0天)后开始，随着治疗时间的延长，各组伤口面积均逐渐缩小，并呈剂量依赖性。

表3FGF-1₁₃₅凝胶剂对1型糖尿病SD大鼠皮肤外伤性损伤的治疗作用(mean±SD)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001

表4FGF-1₁₃₅凝胶剂对1型糖尿病SD大鼠皮肤烫伤的治疗作用(mean±SD)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001

2、2型糖尿病GK大鼠所有实验动物从创面形成当天到治疗结束，无感染化脓现象，从表5和表6可以看出，载药凝胶剂对2型糖尿病GK大鼠外伤性和烫伤性皮肤损伤均有较好的治疗效果，从创面形成(0天)后开始，随着治疗时间的延长，各组伤口面积均逐渐缩小，并呈剂量依赖性。

表5FGF-1₁₃₅凝胶剂对GK大鼠皮肤外伤性损伤的治疗作用(mean±SD)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001

表6FGF-1₁₃₅凝胶剂对GK大鼠皮肤烫伤的治疗作用(mean±SD)

与空白对照组比较*P<0.05**P<0.01***P<0.001

实验结果表明，载药凝胶剂对1型、2型糖尿病大鼠外伤性和烫伤性皮肤损伤均有较好的治疗效果，从创面形成(0天)后开始，随着治疗时间的延长，各组伤口面积均逐渐缩小。(图3、图4)在相同时间点和空白对照组比较，糖尿病大鼠皮肤损伤模型270U剂量治疗组和空白对照组的伤口面积比较即有显著统计学意义。

实验动物创面区皮肤组织病理学检查：脱臼处死动物，摘除皮肤，并且在10％中性福尔马林中固定，进行HE染色并制病理片，观察创面中成纤维细胞、纤维细胞、胶原纤维细胞和毛细血管生长情况。

实验结束每组动物选取3只做皮肤病理切片检查，重点观察成纤维细胞、纤维细胞、毛细血管和胶原纤维增生情况，采取半定量化评分方法，空白对照组成纤维细胞平均得分在3-4分，而rhaFGF高剂量组平均得分在8-9分，对纤维细胞增生也有明显作用，并有促进新生血管形成的作用(图5、图6)。

Claims (6)

1.一种含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂，其特征在于，以1000ml即100支凝胶剂制备量计，其组成配方为：

其中所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，凝胶剂基质为卡波姆940。

2.根据权利要求1所述的含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂，以1000ml即100支凝胶剂制备量计，其组成配方为：

其中所述的蛋白保护剂为人血白蛋白，凝胶剂基质为卡波姆940。

3.根据权利要求1或2所述的含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂，其特征在于，所述的成纤维细胞生长因子-1改构体选用重组人成纤维细胞生长因子-1改构体蛋白。

4.根据权利要求1或2所述的含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

基质溶胀及灭菌：将卡波姆940中加入甘油，搅拌充分混匀，用适量注射用水充分溶胀，调节pH值使其形成透明凝胶，121℃、30min高压灭菌，冷却后备用；

蛋白除菌过滤：将重组人成纤维细胞生长因子-1改构体蛋白、人血白蛋白及肝素，加入冷却的注射用水中充分混匀，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤除菌；

凝胶剂制备：在无菌条件下，将上述两种物质充分混合，分装即得。

5.根据权利要求1～3任一项所述的含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂，其特征在于，该凝胶剂在糖尿病足难愈性及慢性溃疡组织中稳定性好、具有一定缓释效果，并提高了蛋白的生物利用度。

6.根据权利权要求1～3任一项所述的含有成纤维细胞生长因子-1改构体的治疗糖尿病足的凝胶剂，其特征在于，还可应用于烧烫伤及其他慢性、难愈性溃疡的治疗。