JP4496375B2 - 創傷の治療又は処置のための薬剤 - Google Patents

Description

本発明は、創傷の治療又は処置のための薬剤に関する。詳細には、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤、並びに、該増殖促進剤を含む上皮の再生促進剤及び保護剤に関する。

創傷治癒過程は、主に凝固止血期、炎症期、増殖期、再構築期（再上皮形成期）の４ステージに分類される。創傷部位を早く且つ瘢痕の少ない状態に治癒させるためには、これらのステージの速やかな進行と次のステージへの円滑な移行が重要である。たとえば炎症期がいつまでも長引いたり、増殖期に過剰の肉芽組織が形成されたりすることにより、創傷治癒の遅延や疼痛、瘢痕形成が生じる。

一般に、キチンやキトサンは創傷に適した治療薬として使用されている。しかし、キチンやキトサンによる治癒促進メカニズムが解明されていないために、その効率的な使用法が未だに確立されていない。

キチンおよび各種キチン誘導体は、止血期、炎症期、増殖期の各ステージに関わる細胞に対して、なんらかの影響を及ぼすことが知られている。しかし、創傷治癒過程の最終ステージである上皮形成に関しては、Ｈｏｗｌｉｎｇらが研究の一部でわずかに触れたのみである。Ｈｏｗｌｉｎｇ，Ｇ．Ｉ．，Ｄｅｔｔｍａｒ，Ｐ．Ｗ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｐ．Ａ．，Ｈａｍｐｓｏｎ，Ｆ．Ｃ．，Ｄｏｒｎｉｓｈ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ｅ．Ｊ．２００１．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ ａｎｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２２：２９５９−２９６６には、キチンは表皮を形成する基底細胞に作用せず、また、キトサンは表皮角化細胞の増殖能を抑制すると記載されている。

さらにキチンやキトサンは生分解を受けるため、様々な段階の分解産物も創傷治癒に関連すると考えられるが、この点に関しては特に言及されていない。

本発明は、各種キチン誘導体の上皮再生効果を明らかにし、臨床において有効に使用できる上皮再生促進剤等の薬剤を提供することを目的とする。

本発明によれば、Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤が提供される。さらに、該増殖促進剤を含む上皮再生促進剤、皮膚再生促進剤、真皮再生促進剤及び創傷治療薬が提供される。

図１は、ＷＳＴ−８添加後の細胞培養時間と吸光度を表す図である。 図２は、吸光度と生細胞数の関係図である。 図３は、キチン系サンプル添加後２４時間の細胞増殖数を示す図である。 図４は、キトサン系サンプル添加後２４時間の細胞増殖数を示す図である。 図５は、キチン系サンプル添加後４８時間の細胞増殖数を示す図である。 図６は、キトサン系サンプル添加後４８時間の細胞増殖数を示す図である。 図７は、イヌの左側創傷面積の推移を示す図である。 図８は、イヌの右側大腿部創傷面積の推移を示す図である。 図９は、皮膚欠損マウスの写真である。 図１０Ａは、キチンゲルを塗布して８日後のマウスの写真である。 図１０Ｂは、キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃを塗布して８日後のマウスの写真である。 図１０Ｃは、ＧｌｃＮＡｃを塗布して８日後のマウスの写真である。 図１０Ｄは、生理食塩水を塗布して８日後のマウスの写真である。 図１１は、各サンプルを塗布して１６日後のマウスの写真である。 図１２は、生理食塩水を塗布したマウスの皮膚組織の写真である。 図１３は、キチンゲルを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。 図１４は、キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。 図１５は、ＧｌｃＮＡｃを塗布したマウスの皮膚組織の写真である。

本発明者らは、キチンおよびキトサン、並びにそれらのオリゴ糖や単糖等の各種キチン誘導体を用い、表皮角化細胞の増殖能に対する直接的作用、およびその濃度による影響を調査した。また、皮膚に創傷を負った動物において、それらが皮膚再生に与える影響を調査した。

その結果、キチンモノマーであるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに明瞭な表皮角化細胞の増殖効果が認められた。また、動物の創傷における皮膚再生を促進させる効果があることが分かった。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは現在までに甘味料としての応用が報告されているが、生体再生効果があることは全く知られておらず、このような作用は本発明者らによって初めて報告されるものである。

なお、一般的に創傷とは、身体の外側から刃物などによって加えられた傷を意味するが、本明細書においては、火傷、凍傷による皮膚の損傷を含める。

以下の実施例１に示したように、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、インビトロ実験において明瞭な表皮角化細胞の増殖効果を示した。

さらに、実施例２に記載したように、皮膚の大欠損を起こしたイヌに施用したところ、理想的な皮膚再生効果が認められた。このイヌは、第ＩＩＩ度の熱傷を負っていた。第ＩＩＩ度の熱傷は、皮膚組織が欠損しているため、通常であれば皮膚移植が必要な程度の熱傷である。しかしながら、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを処置したことにより、速やかに皮膚が再生した。従って、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、上皮、特に皮膚の再生を促進する効果を有することが示された。

さらに、実施例３に記載したように、人工的に創傷を作製したマウスにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを処置したところ、速やかに皮膚が再生した。このマウスの創傷は、上皮、真皮を完全に切除し、さらに皮下組織も一部を切除したものである。従って、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、皮下組織以上の組織の再生を促進する効果を有することが示された。よって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、上皮の再生促進効果を有し、特に、真皮及び表皮を再生する効果を有することが示された。

さらに、これらのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが有する効果から、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む上皮保護剤、皮膚保護剤を提供することもできる。

以上のことから、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む表皮角化細胞の増殖促進剤を提供する。該増殖促進剤は、さらにキチンを含んでもよい。

本発明の他の態様から、前記増殖促進剤を含む上皮再生促進剤、皮膚再生促進剤、及び真皮再生促進剤が提供される。

さらに、本発明の他の態様から、前記増殖促進剤を含む上皮保護剤及び皮膚保護剤が提供される。

また、さらに他の態様から、前記増殖促進剤を含む創傷治療薬を提供することができる。

以上に示した再生促進剤、保護剤、治療薬は、薬剤的に許容される担体、および他の成分を含んでもよい。これらの薬剤の形態は、溶液、ゲル状、或いはクリーム状に調製されて、創傷部位に塗布されてもよい。また或いは、注射剤として調製されて体内や局所に注入されてもよい。

さらに、上記の薬剤は、創傷の治療以外の目的のために使用されてもよい。例えば、化粧品等に保護剤を含有させ、肌の保護や修復効果を与えてもよい。

以上に記載した本発明による薬剤は、例えばヒト、家畜、ペット等の任意の動物に処置することができる。

［実施例１］
キチンおよびキトサン、並びにそれらの誘導体の存在下でヒト表皮角化細胞を培養し、細胞の増殖能の変化を測定した。

＜材料＞
ヒト表皮細胞として、正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ＮＨＥＫ（Ｆ））（クラボウバイオメディカル、大阪）を用いた。

ＮＨＥＫ（Ｆ）増殖効果測定用培地は、ヒト表皮角化細胞用基礎培地ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２（クラボウバイオメディカル、大阪）５００ｍｌにペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢを含有するＰＳＡ溶液（クラボウバイオメディカル、大阪）１ｍｌ、およびウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，ＵＳＡ）を１０％になるように添加して用いた。

ＮＨＥＫ（Ｆ）増殖用培地は、ヒト表皮角化細胞用増殖培地ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウバイオメディカル、大阪）を用いた。ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２は、基礎培地であるＨｕＭｅｄｉａ−ＫＢ２に、微量増殖因子として、クラボウバイオメディカル社製のインスリン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）、ヒト組み換え型上皮成長因子（ｈＥＧＦ）（最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ）、ハイドロコーチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、抗菌剤としてゲンタマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）およびアンフォテリシンＢ（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）、ウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）（最終濃度０．４％Ｖ／Ｖ）を添加したものである。

その他の細胞継代用試薬に、トリプシン（クラボウバイオメディカル、大阪）、ＨＥＰＥＳ（クラボウバイオメディカル、大阪）、及びトリプシン中和液（クラボウバイオメディカル、大阪）を用いた。

細胞増殖測定用試薬にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学、東京）を使用した。

キチン系サンプルには、以下の３種を用いた。
ａ）キチン
無菌的に作製されたキチン懸濁液Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｆ９Ｌ０１Ｚ（原液：２０ｍｇ／ｍｌ）（サンファイブ（株）、鳥取）を、滅菌生理食塩水（大塚製薬、東京）を１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。キチンはα−キチンで、分子量約３０万、ＤＡＣ度は８％であった。

ｂ）キチンオリゴマー（ＮＡＣＯＳ）
１〜６量体のキチンオリゴ糖混合粉末（焼津水産化学工業（株）、静岡）を１０ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した後、０．２２μｍのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東京）で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。

ｃ）キチンモノマー（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＡｃ）
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン粉末（生化学工業（株）、東京）を１０ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した後、０．２２μｍのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東京）で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。

キトサン系サンプルには、以下の３種を用いた。
ａ）キトサン
無菌的に作製されたキトサン懸濁液Ｌｏｔ Ｎｏ．Ｇ９Ｌ０２（原液：２０ｍｇ／ｍｌ）（サンファイブ（株）、鳥取）を、滅菌生理食塩水で１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。キトサンは分子量約８万、ＤＡＣ度は８２％であった。

ｂ）キトサンオリゴマー（ＣＯＳ）
１〜６量体のキトサンオリゴ糖混合粉末（焼津水産化学工業（株）、静岡）を１０ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した後、０．２２μｍのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東京）で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を滅菌生理食塩水で１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。

ｃ）キトサンモノマー（Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮ）
Ｄグルコサミン粉末（甲陽ケミカル、東京）を１０ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した後、０．２２μｍのミリポアフィルター（日本ミリポアリミテッド、東京）で濾過滅菌したものを原液とした。この原液を生理食塩水で１０００，１００，１０，１μｇ／ｍｌに希釈して使用した。

コントロールとして、滅菌生理食塩水（大塚製薬、東京）を使用した。

＜方法＞
（１）正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞の培養、および細胞懸濁液の作製
細胞は、増殖用培地および培養用フラスコ（Ｌｏｔ Ｎｏ．０５５５２２）（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤環境下で培養し、４次培養まで継代したものを実験に用いた。

継代時は、細胞がサブコンフルエント（フラスコ底面積の６０〜８０％）まで増殖した段階で培地を吸引したのち、ＨＥＰＥＳを用いて容器内を洗浄し、トリプシンを２ｍｌ添加して細胞を容器底面より剥離した。剥離した細胞をＨＥＰＥＳで回収し、中和液内に入れてトリプシンの反応を停止させた後、遠心分離（１１００ｒｐｍ，５分）により沈殿させ、上清は廃棄した。回収した細胞を増殖用培地に再浮遊させ、トリパンブルー排出試験により生細胞数を計数した後、フラスコ底面積に対して生細胞が２，５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ３となるように別の培養用フラスコに移植した。

測定には、遠心分離後、測定用培地で再浮遊させ、３０，０００細胞／ｍｌに調整した細胞懸濁液を用いた。

（２）細胞増殖測定アッセイ
まず、９６ウェルマルチプレート（住友ベークライト、東京）の各ウェルに、（１）で調整した細胞懸濁液を１００μｌずつ、３，０００細胞／ウェルで播種した。播種細胞を安定させるため、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤環境下において、１２時間の前培養を行った。

次に、マルチプレートの各ウェルに、各濃度に調整したキチン系の各サンプル及びキトサン系の各サンプルを１０μｌずつ添加した。この操作による各サンプルの最終濃度はそれぞれ、１００，１０，１，０．１μｇ／ｍｌである。３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤環境下において、２４時間もしくは４８時間の本培養を行った。

本培養中に増殖した細胞数を計測するため、マルチプレートの各ウェルに細胞数測定用試薬（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ）ＷＳＴ−８を１０μｌずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ_２、湿潤環境下に１〜４時間静置し呈色させた。呈色後、イージー・リーダー（ＥＡＳＹ ＲＥＡＤＥＲ）ＥＡＲ３４０ＡＴ（Ｍｅｄｉ−Ｃｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、大阪）を用いて吸光度を計測した。計測データの数値処理および統計は、表計算ソフト（マイクロソフト・エクセルｘｐ（登録商標））を使用した。

（３）吸光度と細胞数との関連
吸光度と細胞数との関連を明らかにするために、検量線を以下の方法で作成した。
まず、１ウェルあたりの細胞数が３０，０００，１５，０００，７，５００，３，７５０ｃｅｌｌになるように調整した細胞懸濁液を作製し、９６ウェルマルチプレートの各ウェルに播種して１２時間の培養を行った。培養後ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８を添加し、４時間後吸光度を測定した。

［表皮角化細胞増殖アッセイにおける基礎的検討］
細胞数測定用試薬ＷＳＴ−８の呈色に要する時間の決定：
細胞数測定用試薬ＷＳＴ−８の呈色に要する時間は１〜４時間とされているが、細胞の種類や環境によってその最適時間は異なる。そこで、コントロールを用いて細胞数測定用試薬ＷＳＴ−８添加後の静置時間による吸光度の変化を調べた。その結果を表１及び図１に示す。図１より明らかなように、時間の経過に伴って呈色は強さを増し、吸光度は上昇した。

この成績から、細胞数測定用試薬ＷＳＴ−８添加後の静置時間は４時間とした。

吸光度と細胞数との関連：
細胞数と吸光度は比例的な相関関係を示し（図２、表２）、このグラフより検量線
ｎ＝１７８０８ａ−９００．１２（Ｒ^２＝０．９８４８）
｛ｎ：１ウェルあたりの細胞数，ａ：吸光度｝
が得られた。この検量線を用いて求めた細胞数から、播種時の細胞数である３，０００細胞を引いたものを、増殖細胞数（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）とした。

＜結果＞
ヒト表皮角化細胞増殖アッセイ：
キチン系サンプルを添加し、２４時間本培養を行った結果を表３及び図３に示す。キチン０．１μｇ／ｍｌ、ＮＡＣＯＳ１００μｇ／ｍｌ、ＧｌｃＮＡｃ１，１０，１００μｇ／ｍｌでそれぞれコントロールと比べて有意な増殖刺激活効果を示した（ｐ＜０．０５）。

キトサン系サンプルを添加し、２４時間本培養を行った結果を表４及び図４に示す。キトサン１０，および１００μｇ／ｍｌ、ＣＯＳμｇ／ｍｌでそれぞれコントロールと比較して有意な増殖抑制効果を示した（ｐ＜０．０５）。また、ＧｌｃＮ１，１０，１００μｇ／ｍｌでコントロールに比較して有意な増殖刺激効果を示した（ｐ＜０．０５）。

キチン系サンプルを添加し、４８時間本培養を行った結果を表５及び図５に示す。ＧｌｃＮＡｃ１，１０，１００μｇ／ｍｌでそれぞれコントロールと比較して有意な増殖刺激効果を示した（ｐ＜０．０５）。

キトサン系サンプルを添加し、４８時間本培養を行った結果を表６及び図６に示す。キトサンの全濃度（０．１，１，１０，１００μｇ／ｍｌ）においてコントロールと比較して有意な増殖抑制効果が示された（ｐ＜０．０５）。一方、ＧｌｃＮは１μｇ／ｍｌで有意な増殖刺激効果を示した（ｐ＜０．０５）。

上記の試験から、ＧｌｃＮＡｃ及びＧｌｃＮにコントロールと比べて有意な細胞増殖能刺激作用が認められ、特にＧｌｃＮＡｃは優れた表皮角化細胞の増殖能を示し、皮膚上皮の再生効果を有することが認められる。またキトサンにはコントロールと比べて有意な細胞増殖抑制作用が認められた。

また、キチン系及びキトサン系サンプルは共に、分子量が小さくなるにつれて細胞増殖刺激作用が増強する傾向を示したが、キチン系サンプルとキトサン系サンプルでは、キチン系サンプルの方がより強い細胞増殖刺激作用を示す傾向が認められた。

以上の結果から、キチンは分解を受ければ受けるほど表皮形成が促進されるが、一方で生体内分解が比較的緩やかなキトサンは、肉芽増生が著しいものの表皮形成は抑制されることが理解される。この現象は、臨床的に観察される創傷治癒反応と全く一致するものである。

［実施例２］
ＧｌｃＮＡｃを臨床的に使用し、その効果を検証した。

火災によって全身に火傷を負ったイヌに対して、キチンと共にＧｌｃＮＡｃを散布した。被験体は、ミニチュア・ダックスフントの２歳の雌、体重３．８ｋｇで、左側腹部に第ＩＩＩ度の熱傷創、右側大腿部に第ＩＩＩ度熱傷創、全ての肉球に第ＩＩ度熱傷創、及び顔面の９０％に第ＩＩＩ度熱傷創を負っていた。

熱傷の一般的な治療は、第ＩＩ度熱傷では水泡の中に溜まった液体を清潔な針で穴を開けて抜き、感染を防ぐため抗生物質入りの油性軟膏が塗布される。第ＩＩＩ度熱傷では、皮膚組織欠損のため原則として皮膚移植が必要であり、感染防止のため強力な抗菌剤が塗布される。

本実施例において使用した薬剤は、キチン粉末（サンファイブ（株））、ＧｌｃＮＡｃ（生化学工業（株））、カイトファイン（明治製菓（株））、キチンクリーム（キトサンコーワ（株））、及び抗生物質である。

第１病日（初診時）は、熱傷創壊死片を除去し、キチン粉末（１０ｍｇ／ｃｍ^２）、カイトファイン（１００μｇ／ｃｍ^２）、抗生物質（１００ｍｇ／ｍｌ）を熱傷部位に散布した。鼻鏡には抗生物質軟膏を塗布した。

第２病日は、顔面・耳介壊死皮膚を除去し、キチン、イソジン、抗生物質、ＧｌｃＮＡｃ溶液（１０ｍｇ／ｃｍ^２）を塗布した。

第３病日以降は、キチン、イソジン、キチンクリーム（１ｍｇ／ｃｍ^２）（第１９病日以降）、ＧｌｃＮＡｃ溶液を塗布した。

左側腹部第ＩＩＩ度の熱傷創は、約５．４ｃｍ×１１．３ｃｍであったが、第６病日には約５ｃｍ×９．０ｃｍに縮小し、肉芽形成が観察された。第８病日には、創全体が約４ｃｍ×６ｃｍに縮小し、肉芽増生と皮膚上皮新生が認められた。第１８病日には、創全体がさらに約２．３ｃｍ×６ｃｍまで縮小した。第２６病日には、創全体がさらに縮小し、瘢痕か観察され、さらに発毛が認められた。以上の左側腹部創傷面積は、第１病日における面積を１００としたとき、第８病日、第１８病日、及び第２６病日においてそれぞれ７５％、２５％、および１０％であった（図７）。

右側大腿部第ＩＩＩ度熱傷創は、周辺組織の壊死が見られ、約３．３ｃｍ×９．８５ｃｍであった。第８病日には創の縮小、肉芽増生、皮膚上皮新生が観察された。第１５病日には、創全体が約２．３ｃｍ×６．０ｃｍまで縮小した。第２６病日には、創全体が約０．５ｃｍ×９．４ｃｍに縮小し、瘢痕形成が見られ、発毛が認められた。以上の右側大腿部の創傷面積は、第１病日における面積を１００としたとき、第８病日、第１８病日、及び第２６病日においてそれぞれ９０％、６５％、及び３０％であった（図８）。

肉球は四足全て第ＩＩ度熱傷であったが、第１８病日には、パット部分の表皮が形成し、治癒した。

顔面は約９０％に第ＩＩＩ度の熱傷創を負っていた。第６病日には、創全体が縮小し、キチン痂皮下に皮膚上皮新生が認められた。第８病日には、顔面の引きつれがやや見られたが、上眼瞼上皮が形成した。キチンの自然落下が観察された。第１８病日には、肉芽増生と皮膚上皮新生が見られ、発毛が認められた。第２６病日には、肉芽増生と皮膚上皮新生が認められ、発毛がさらに観察された。頭部に一部瘢痕が形成された。

全体的に、瘢痕収縮が引き起こされず正常な皮膚が再生し、特に顔面の皮膚は完全な皮膚再生と発毛が認められた。このことから、上記のようなキチン及びＧｌｃＮＡｃを組み合わせた治療によって、速やかな皮膚再生効果が得られることが示された。従って、ＧｌｃＮＡｃを処置することによって、重度の皮膚損傷であっても、皮膚を移植することなく治療することが可能となる。

通常、瘢痕は創傷面の化膿や線維芽細胞の過度の増殖、あるいは性急な創傷治療による不十分な肉芽造成段階での表皮の再生などによって生じる。そこで、創傷治癒過程の初期から中期において、キトサンを投与し、表皮角化細胞の増殖を抑制して無駄な角化物が産生されるのを防ぐことによって、瘢痕防止効果が得られるものと推測される。

従って、キチン及びキトサンを創傷初期に投与し、創傷後期には新たに投与しないことが好ましい。そして、上皮形成期においてＧｌｃＮＡｃを投与することによって、表皮角化細胞の増殖を増強させ、皮膚再生を促進させることが可能であり、これによって、瘢痕形成を抑制し、且つ速やかな皮膚再生治療が可能である。

［実施例３］
マウスを用いて新鮮皮膚欠損創を作製し、ＧｌｃＮＡｃの皮膚再生促進効果を検討した。コントロールとして、ゲル状キチン（キトサンコーワ（株））及び生理食塩水を用いた。

＜実験材料および方法＞
実験材料
（ｉ）マウス：ＢＡＬＢ／ｃ、メス、８週齢、体重２０〜２５ｇのものを８頭用いた。実験に際しては１週間の馴化期間を置いた。

（ｉｉ）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）粉末（生化学工業（株）、東京）を１０ｍｇ／ｍｌになるよう生理食塩水に溶解した後、０．２２μｍのミリポアフィルターで濾過滅菌したものを滅菌生理食塩水で１０μｇ／ｍｌに希釈して使用した。

（ｉｉｉ）ゲル状キチン（キトサンコーワ（株）、東京）。以下、「キチンゲル」と称す。

（ｉｖ）キチンゲルにＧｌｃＮＡｃを１０μｇ／ｇになるように調合して使用した。以下「キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃ」と称す。

（ｖ）コントロールとして生理食塩水（大塚製薬（株）、徳島）を使用した。

実験方法
（ｉ）皮膚欠損モデルの作製：ペントバルビタール（商品名：ネンブタール注射薬）を１０倍に生理食塩水で希釈後、マウスの腹腔内に０．００５ｍｌ／ｇを投与した。十分な麻酔効果が得られた事を確認した後、マウス背側皮毛をバリカンで刈り、皮膚をアルコール消毒した後、５ｍｍのデルマパンチを用いて直径５ｍｍの円型の皮膚欠損部位を作製した（図９）。これら８頭のマウスを２頭ずつ「キチンゲル群」、「キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃ群」、「ＧｌｃＮＡｃ群」、「生理食塩水群」とし、各々を毎日１回塗布した。

（ｉｉ）「キチンゲル群」、「キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃ群」には各々を０．１ｇ／ｈｅａｄ、「ＧｌｃＮＡｃ群」、「生理食塩水群」には各々を１ｍｌ／ｈｅａｄとなるように、７日間、皮膚欠損部位に直接塗布した。

（ｉｉｉ）８日目以降は、各々を塗布する直前に、形成された痂皮を除去し、上記と同様に塗布をさらに８日間行った。

肉眼的観察
８日目、１６日目にそれぞれの皮膚損傷修復部位の大きさをノギスを用いて計測した。

組織学的観察
染色方法：皮膚欠損修復部位を採材し、１０％中性緩衝ホルマリン水溶液（ホルムアルデヒド液）で固定した。修復部位が縦断面になるように切り出しを行った後、定法通りパラフィン包埋し、ミクロトームによって５μｍに薄切りした。ヘマトキシリン・エオジン重染色によって染色した。

＜結果及び考察＞
肉眼的観察所見
７日目までは創の上から薬物を滴下、あるいは塗布した。２〜３日目において、創は痂皮に覆われて硬化したため、各群とも創の縮小は認められなかった。８日目から毎日痂皮を剥離し、薬物の投与を持続した（図１０Ａ〜Ｄ）。その結果「キチンゲル群」は表皮形成が有意に抑制された（図１１）。これは不溶性キチンのゲルが明らかに表皮形成を物理的に障害したためと考えられる。一方「キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃ群」では、良好な皮膚形成が生じ、ＧｌｃＮＡｃの皮膚再生効果が認められた。しかし、皮下組織には過剰な肉芽形成が見られ、キチンゲルによる肉芽形成が、新鮮創では治癒を遅延する結果になることが示唆された。「ＧｌｃＮＡｃ群」においては、過剰な肉芽を作ることなく完全な表皮化が認められ、最も良好な治癒が認められた。「生理食塩水群」においては、過剰な肉芽の形成は見られなかったものの、表皮形成は完了しなかった。

組織学的観察所見
「生理食塩水群」では、上皮は創の中央部に向かって薄くなっており、中央部では欠損し、皮膚の連続性は完成していない。炎症の程度は軽度であるが、皮膚構造の完成度は低い（図１２）。「キチンゲル群」では、表皮の再生は肉芽形成によって阻止されており、激しい炎症が持続している（図１３）。「キチンゲル＋ＧｌｃＮＡｃ群」では、皮膚の再生は完了しているが、再生毛包の周囲の炎症細胞浸潤が明瞭に認められた。再生皮下組織はいまだ肉芽の形態を保ち、完成していない（図１４）。「ＧｌｃＮＡｃ群」では、皮膚再生は完了しており、角化の程度も他の群と比較して最も進んでいる。皮下組織も中央部に僅かの肉芽組織を残す程度で、再生した組織も完成している（図１５）。

以上の結果から、ＧｌｃＮＡｃはマウスにおいても皮膚再生効果が認められ、その効果は生理食塩水、キチンゲルよりも良好であった。組織学的にもＧｌｃＮＡｃはより完全な組織再生を引き起こすことが確認された。また、キチンゲルにＧｌｃＮＡｃを混合することで上皮化が促進されたため、深い創の治療に関してはＧｌｃＮＡｃ添加キチンゲルが有効になると考えられた。

本発明によれば、イヌ等のペット、家畜、ヒトを含む動物の創傷の治療又は処置に有効な薬剤を提供することができる。

Claims (5)

1. Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン（GlcNAc）、キチン及び薬剤的に許容される担体からなり、創傷部位に適用されることを特徴とする、表皮角化細胞の増殖促進剤。
2. 請求項１に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする上皮再生促進剤。
3. 請求項１に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする皮膚再生促進剤。
4. 請求項１に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする真皮再生促進剤。
5. 請求項１に記載の増殖促進剤を含むことを特徴とする創傷治療薬。

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