CN110538198A - 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用 - Google Patents

一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110538198A
CN110538198A CN201910814538.9A CN201910814538A CN110538198A CN 110538198 A CN110538198 A CN 110538198A CN 201910814538 A CN201910814538 A CN 201910814538A CN 110538198 A CN110538198 A CN 110538198A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sipunculus nudus
water extract
wound
water
evaluation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910814538.9A
Other languages
English (en)
Inventor
章超桦
林海生
秦小明
曾少葵
郑志鸿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Ocean University
Original Assignee
Guangdong Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Ocean University filed Critical Guangdong Ocean University
Priority to CN201910814538.9A priority Critical patent/CN110538198A/zh
Publication of CN110538198A publication Critical patent/CN110538198A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/30—Compounds of undetermined constitution extracted from natural sources, e.g. Aloe Vera
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:1‑1:3加水，调节pH为6.0‑8.0，置于50‑65℃恒温搅拌水浴锅，提取3‑6h，100℃灭菌，6000‑10000RPM离心10‑20min，冷冻干燥得方格星虫水提取物。本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，促创伤修复效果更明显。

Description

一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，其主要功能是隔绝机体和环境的保护屏障。在世界范围内，每年遭受皮肤创伤人数超过4000万，在中国，遭受皮肤急性创伤人数每年都超过1000万。如果受损的皮肤不能及时修复，创面很容易受到感染，演变成慢性伤口，严重的创伤甚至危及生命。良好的重塑效果会使皮肤瘢痕减小，甚至达到无痕愈合，重塑异常则会形成异常瘢痕或者瘢痕瘤，以至于留下疤痕，这将给患者的身心健康带来严重的影响。创伤愈合主要包含止血凝血期、炎症期、增殖期和组织重塑期四个时期。在机体遭受创伤后，在止血凝血期，血小板激活，分泌相关因子产生一系列级联反应，促使血液凝集成血栓，达到凝血作用，同时刺激机体产生炎症反应等。在炎症期，中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞，吞噬组织碎片并杀灭入侵的细菌等环境中的污染物，同时分泌各种细胞因子，刺激成纤维细胞分裂、胶原合成和血管生成。增殖期时，成纤维细胞则产生胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸、蛋白多糖等各种细胞外基质(ExtracellularMatrix,ECM)成分，合成肉芽组织，同时分化成肌成纤维细胞，再分泌相关蛋白促进伤口收缩。内皮细胞会被征集到伤口促进血管生成和肉芽组织形成，为新合成组织提供营养和氧气。角质形成细胞则会迁移到真皮之上，分化形成鳞状上皮，愈合伤口。组织重塑期，胶原蛋白和纤连蛋白等在相关细胞因子和细胞的共同调节下，进行不断地合成和分解，达到一个平衡，进行不断地重塑，一直持续到1年或者更长时间。任何一个环节一旦完成必须以精确的顺序停止反应，以防过度或者延迟的反应。
生物活性物质是研究药物、功能食品、生物制品的基本前提。海洋生物与陆生生物的生长环境的巨大差异，是开发结构想新颖天然活性物质的来源。方格星虫，是一种经济底栖生物，其肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富。方格星虫的蛋白占干重73.77%，总糖5.34%，粗脂肪0.67%，是名副其实的高蛋白低脂肪水产品。此外，方格星虫中富含多种氨基酸，以及富含锌、铜、锗、硒等7种微量元素。将海洋生物活性物质应用到促进创伤愈合和预防病理性瘢痕形成的药物，将会成为创伤领域关注的新焦点，具有很好的临床应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用。本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
本发明的技术方案为：
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:1-1:3加水，调节pH为6.0-8.0，置于50-65℃恒温搅拌水浴锅，提取3-6h，100℃灭菌，6000-10000RPM离心10-20min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物100-200mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用小鼠断尾法测定，通过出血量和出血时间评价体表促凝血活性。具体为，取小鼠18只，体质量33-38 g，随机分为3组。分别为空白组、方格星虫水提取物组和阳性对照组。将小鼠装进的特定容器中固定，露出尾巴，并使尾巴呈水平放置，在距尾端0.4 cm处用消毒手术剪截断，用消毒棉签轻轻蘸取药物包裹鼠尾断面，用消毒棉签蘸取1 g/kg剂量的方格星虫提取物或云南白药；空白组不予给药，开始计时,每隔约5 s用滤纸轻轻吸取血滴,不可挤压伤口, 滤纸不再粘有血迹为止，记下血液停止流出的时间。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50ul，20-70mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，，加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550nm波长，记录为0h的OD值，37℃培养，分别测定8h和24h的OD值，分别计算抑菌率。
具体的，所述抗菌活性评价的方法为：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、泥鳅嗜水汽菌、无乳链球菌等种于3%TSB液体培养基中进行活化，将溶藻弧菌、副溶血性弧菌利用3%TSB-3%NaCl培养基活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至OD550值为0.1，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50 ul，20-70 mg/mL样品（以总氮算）为样品组，各组均加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，550 nm测定吸光度，记录为0 h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8 h测定一次OD值，24 h测定一次OD值。分别计算抑菌率，公式如下(1)所示：
。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：
，
公式中n是造模后天数，单位：天。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)。具体方法为：使用RNAIso Plus和匀浆器从伤口组织中提取总RNA。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录合成cDNA，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(*2)试剂盒进行荧光定量。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。每延伸一次，都进行实时荧光定量测量。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，用于校正计算靶基因的表达水平，使用∆∆CT方法进行计算。第7天测定TNF-a、IL-1β和TGF-β1，第14、21和28天测定COL1A1(I型胶原蛋白)mRNA水平。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM）。具体为：取造模后第21天的皮肤伤口组织放入2.5%戊二醛，于4℃固定过夜。将戊二醛固定后的组织，浸入PBS(0.1mol/L)中，漂洗3次，离心去上清，每次20 min，再用4℃预冷的1%锇酸，在4℃固定2-3 h，然后用PBS（0.1mol/L）浸洗3 次，每次20 min。按梯度30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇脱水，每种浓度乙醇1次，每次15 min，再用100%乙醇彻底脱水2次，每次10 min。接着用丙酮：环氧树脂(2：1)、丙酮：环氧树脂(1：1)、环氧树脂，于37℃恒温箱依次进行渗透，每次12 h。接着包埋、固化和修块，用铅和铀双染色后，于200 KV加速电压和放大倍率5000观察拍照。使用ImageJ软件分析测量每个图像中每个胶原纤维的直径。
本发明中，阳性对照组可选用现有技术中创伤修复功效明显的药物，比如云南白药、京万红软膏、银锌抑菌霜等。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798；所述京万红软膏为现有技术天津达仁堂京万红药业有限公司生产的京万红软膏，国药准字Z12020440；所述银锌抑菌霜为现有技术河南汇博医疗股份有限公司生产的邦尔康银锌抑菌霜，注册证号（豫）卫消证字（2004）第0056号。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
中国期刊《保鲜与加工》2018年18期“方格星虫氨基酸含量测定及其营养价值评定”一文中，公开了方格星虫原料的氨基酸组成，证明方格星虫原料含有氨基酸种类多，含量较高，是优质的蛋白来源和功能性物质制备来源。
方格星虫水提取物的主要的活性成分包括：甘氨酸、牛磺酸、 精氨酸等功能性氨基酸，钾、锌、铜等元素，以及水溶性小分子肽、多糖等物质。多种活性因子协同增效，可发挥其促进伤口修复的功能活性。方格星虫水提取物经过动物实验进一步证实了具有促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，其作用机制与止血、抗菌、抗炎、促进生长因子分泌和胶原胶原纤维生长以及调节瘢痕相关因子表达有密切关联。因此，方格星虫水提取物可作用于伤口的止血期、炎症期、增殖期和重塑期四个创伤愈合时期，可以作为抗异常瘢痕形成的再生愈合活性物质用于真皮损伤的治疗。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-4:1；所述基料为聚乙烯醇或聚己内酯，所述辅料为海参胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为5％-10％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为0.5-5.0％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种。
本发明中，所述海参胶原蛋白可采用任一现有技术实现，例如中国专利“200710159245.9、海参胶原、胶原蛋白的提取方法”制备的海参胶原蛋白。海参胶原蛋白（PSC）所含氨基酸种类齐全，具有典型胶原蛋白的组成。氨基酸总量达PSC的33.07%。其中，必需氨基酸总量达PSC的5.29%，占氨基酸总量的16%；鲜味氨基酸总量达PSC的19．04%;药效氨基酸总量达PSC的17．69%，这些成分中，具有促进伤口修复的功能因子，可与方格星虫水提取物协效复配，在复合纤维膜中增强其创口的快速愈合、预防瘢痕形成的功效。
进一步的，所述方格星虫水提取物溶液的浓度为21-35mg/ml。
进一步的，步骤d中静电纺丝电压为15-30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15cm，注射泵的推进速度可为0.01-0.50mL/min，纺丝环境温度可为35-39℃。
本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。
特别的，本发明提供一种方格星虫水提取物复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。
静电纺丝技术制备的纤维膜具有很高的孔隙率及良好的透气性，即可使伤口保持理想的湿润程度，又有利于细胞的呼吸作用。在静电纺丝过程中将药物成分加入纺丝液中，可以得到复合了一些药物成分的纳米纤维，当纳米纤维降解或者遇到水溶胀后，可以将药物成分缓慢释放出来，这种方式不仅可以提高药物的药效，降低了药物的毒副作用。而同轴静电纺丝技术可以在纤维表面进行功能化修饰，同时也可以将功能材料包裹于纤维内部，以起到持久发挥功效的作用。
本发明通过添加方格星虫水提取物，利用静电纺丝技术，制备获得生物活性敷料，作为创面敷料，具有较大的比表面积和孔隙结构，很好的黏附支持细胞生长，可以提供天然仿生的类细胞外基质，具有抗炎作用，保护其不被伤口微环境降解失活，促进胶原蛋白和细胞因子的合成、分泌，极大改善胶原蛋白沉积，形成有序的篮筐编织样式排列，使之具备正常真皮的特征。本发明提供的方法操作方便，可重复性强，在创伤修复药物中有巨大的应用前景。
本发明的方格星虫水提取物复合纤维膜，采用海参胶原蛋白或壳聚糖作为载体，由于海参胶原蛋白或壳聚糖本身具有良好的功能活性，能够协效放大方格星虫水提取物复合纤维膜的抗炎作用以及促进创口快速愈合的效果，使得其在创伤修复中的功效优于单独使用方格星虫水提取物直接对伤口进行涂抹的功效。所述静电纺丝原料均可通过任一现有技术实现。
本发明敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。具有生物活性的方格星虫水提取物敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血、抗菌、保湿，同时具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。
附图说明
图1 本发明一实施例的SNE对小鼠尾部出血时间的影响，n≥5；
图2 本发明一实施例的SNE对小鼠创伤愈合的影响（直观图，比例尺=5 mm）；
图3 本发明一实施例的SNE对小鼠皮肤创伤愈合率的影响（n≥6）；
图4 本发明一实施例的SNE对小鼠皮肤伤口掉痂时间的影响，n≥16；
图5 本发明一实施例的SNE对小鼠皮肤创面TNF-α、IL-1β和TGF-β1表达水平的影响(第7 d，n≥4)；
图6本发明一实施例的小鼠皮肤创面的I型胶原蛋白的表达水平，n≥4；
图7本发明一实施例的透射电镜对横截的胶原纤维分析（5000倍放大，比例尺=500nm）；
图8本发明一实施例的NT组创口胶原纤维直径分布图（第21d，n≥1200）；
图9本发明一实施例的SNE组创口胶原纤维直径分布图（第21d，n≥1200）；
图10本发明一实施例的PC组创口胶原纤维直径分布图（第21d，n≥1200）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:2加水，调节pH为7.0，置于55℃恒温搅拌水浴锅，提取4.5h，100℃灭菌，8000RPM离心15min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物150mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用小鼠断尾法测定，通过出血量和出血时间评价体表促凝血活性。具体为，取小鼠18只，体质量33-38 g，随机分为3组。分别为空白组、方格星虫水提取物组和阳性对照组。将小鼠装进的特定容器中固定，露出尾巴，并使尾巴呈水平放置，在距尾端0.4 cm处用消毒手术剪截断，用消毒棉签轻轻蘸取药物包裹鼠尾断面，用消毒棉签蘸取1 g/kg剂量的方格星虫提取物或云南白药；空白组不予给药，开始计时,每隔约5 s用滤纸轻轻吸取血滴,不可挤压伤口, 滤纸不再粘有血迹为止，记下血液停止流出的时间。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50ul，50mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，，加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550nm波长，记录为0h的OD值，37℃培养，分别测定8h和24h的OD值，分别计算抑菌率。
具体的，所述抗菌活性评价的方法为：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、泥鳅嗜水汽菌、无乳链球菌等种于3%TSB液体培养基中进行活化，将溶藻弧菌、副溶血性弧菌利用3%TSB-3%NaCl培养基活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至OD550值为0.1，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50 ul，50mg/mL样品（以总氮算）为样品组，各组均加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，550 nm测定吸光度，记录为0 h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8 h测定一次OD值，24 h测定一次OD值。分别计算抑菌率，公式如下(1)所示：
。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：
，
公式中n是造模后天数，单位：天。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)。具体方法为：使用RNAIso Plus和匀浆器从伤口组织中提取总RNA。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录合成cDNA，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(*2)试剂盒进行荧光定量。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。每延伸一次，都进行实时荧光定量测量。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，用于校正计算靶基因的表达水平，使用∆∆CT方法进行计算。第7天测定TNF-a、IL-1β和TGF-β1，第14、21和28天测定COL1A1(I型胶原蛋白)mRNA水平。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM）。具体为：取造模后第21天的皮肤伤口组织放入2.5%戊二醛，于4℃固定过夜。将戊二醛固定后的组织，浸入PBS(0.1mol/L)中，漂洗3次，离心去上清，每次20 min，再用4℃预冷的1%锇酸，在4℃固定2-3 h，然后用PBS（0.1mol/L）浸洗3 次，每次20 min。按梯度30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇脱水，每种浓度乙醇1次，每次15 min，再用100%乙醇彻底脱水2次，每次10 min。接着用丙酮：环氧树脂(2：1)、丙酮：环氧树脂(1：1)、环氧树脂，于37℃恒温箱依次进行渗透，每次12 h。接着包埋、固化和修块，用铅和铀双染色后，于200 KV加速电压和放大倍率5000观察拍照。使用ImageJ软件分析测量每个图像中每个胶原纤维的直径。
本发明中，阳性对照组选用现有技术的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
实施例2
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:1加水，调节pH为6.0，置于50℃恒温搅拌水浴锅，提取3.5h，100℃灭菌，6000RPM离心20min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物100mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的小鼠断尾法测定。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法与实施例1一致。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法与实施例1一致。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体测定方法与实施例1一致。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM），，具体测定方法与实施例1一致。
本发明中，阳性对照组选用现有技术中银锌抑菌霜，所述银锌抑菌霜为现有技术河南汇博医疗股份有限公司生产的邦尔康银锌抑菌霜，注册证号（豫）卫消证字（2004）第0056号。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
实施例3
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:3加水，调节pH为8.0，置于65℃恒温搅拌水浴锅，提取6h，100℃灭菌，10000RPM离心10min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物200mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的小鼠断尾法测定。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法与实施例1一致。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法与实施例1一致。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体测定方法与实施例1一致。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM），，具体测定方法与实施例1一致。
本发明中，阳性对照组选用现有技术中京万红软膏。所述京万红软膏为现有技术天津达仁堂京万红药业有限公司生产的京万红软膏，国药准字Z12020440。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
实施例4
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比2:3加水，调节pH为6.5，置于58℃恒温搅拌水浴锅，提取4h，100℃灭菌，9000RPM离心12min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物130mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的小鼠断尾法测定。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法与实施例1一致。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法与实施例1一致。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体测定方法与实施例1一致。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM），，具体测定方法与实施例1一致。
本发明中，阳性对照组选用现有技术的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
实施例5
一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比3:4加水，调节pH为7.5，置于53℃恒温搅拌水浴锅，提取5.5h，100℃灭菌，8500RPM离心18min，冷冻干燥得方格星虫水提取物（即为SNE）。
进一步的，所述方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。
进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物175mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。
进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的小鼠断尾法测定。
进一步的，所述抗菌活性评价的方法与实施例1一致。
进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法与实施例1一致。
进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体测定方法与实施例1一致。
进一步的，步骤（3）中，胶原蛋白生成分析采用胶原纤维透射电镜分析（TEM），，具体测定方法与实施例1一致。
本发明中，阳性对照组选用现有技术的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。
进一步的，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
本发明提供了一种方格星虫水提取物在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。
实施例6
本实施例中，将实施例1-5任一制备的方格星虫水提取物可制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为3:1；所述基料为聚乙烯醇，所述辅料为海参胶原蛋白；所述溶剂为三氟乙醇；所述载体材料溶液的浓度为7.5％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为2.0％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇。
本发明中，所述海参胶原蛋白可采用任一现有技术实现，例如中国专利“200710159245.9、海参胶原、胶原蛋白的提取方法”制备的海参胶原蛋白。海参胶原蛋白（PSC）所含氨基酸种类齐全，具有典型胶原蛋白的组成。氨基酸总量达PSC的33.07%。其中，必需氨基酸总量达PSC的5.29%，占氨基酸总量的16%；鲜味氨基酸总量达PSC的19．04%;药效氨基酸总量达PSC的17．69%，这些成分中，具有促进伤口修复的功能因子，可与方格星虫水提取物协效复配，在复合纤维膜中增强其创口的快速愈合、预防瘢痕形成的功效。
进一步的，所述方格星虫水提取物溶液的浓度为30mg/ml。
进一步的，步骤d中静电纺丝电压为24kV，注射器针头与接收板之间的距离可为13cm，注射泵的推进速度可为0.15mL/min，纺丝环境温度可为37℃。
本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。
特别的，本发明提供一种方格星虫水提取物复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。
本发明的方格星虫水提取物复合纤维膜，采用海参胶原蛋白或壳聚糖作为载体，由于海参胶原蛋白或壳聚糖本身具有良好的功能活性，能够协效放大方格星虫水提取物复合纤维膜的抗炎作用以及促进创口快速愈合的效果，使得其在创伤修复中的功效优于单独使用方格星虫水提取物直接对伤口进行涂抹的功效。所述静电纺丝原料均可通过任一现有技术实现。
实施例7
本实施例中，将实施例1-5任一制备的方格星虫水提取物可制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1；所述基料为聚己内酯，所述辅料为海参胶原蛋白；所述溶剂为六氟异丙醇；所述载体材料溶液的浓度为5％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为0.5％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种。
进一步的，所述方格星虫水提取物溶液的浓度为35mg/ml。
进一步的，步骤d中静电纺丝电压为15kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10cm，注射泵的推进速度可为0.01mL/min，纺丝环境温度可为35℃。
本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。
特别的，本发明提供一种方格星虫水提取物复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。
实施例8
本实施例中，将实施例1-5任一制备的方格星虫水提取物可制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为4:1；所述基料为聚乙烯醇，所述辅料为壳聚糖；所述溶剂为三氟乙酸；所述载体材料溶液的浓度为10％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为5.0％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为三氟乙酸。
进一步的，所述方格星虫水提取物溶液的浓度为21mg/ml。
进一步的，步骤d中静电纺丝电压为30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为15cm，注射泵的推进速度可为0.50mL/min，纺丝环境温度可为39℃。
本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。
特别的，本发明提供一种方格星虫水提取物复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。
实施例9
本实施例中，将实施例1-5任一制备的方格星虫水提取物可制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫水提取物是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。
进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为2:1；所述基料为聚乙烯醇，所述辅料为海参胶原蛋白；所述溶剂为六氟异丙醇；所述载体材料溶液的浓度为8.5％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为3.5％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇。
进一步的，所述方格星虫水提取物溶液的浓度为27mg/ml。
进一步的，步骤d中静电纺丝电压为20kV，注射器针头与接收板之间的距离可为14cm，注射泵的推进速度可为0.1mL/min，纺丝环境温度可为38℃。
功能评价结果
1.1 止血活性评价结果
如图1所示，在实施例1的止血活性评价中，NT、SNE和PC组止血时间分别为(186.6±22.6) s、(132.0±23.5) s和(113.6±20.4) s。SNE组和PC组有相似的止血效果，出血时间无显著性差异(P>0.05)。SNE组和NT相比，出血时间极显著降低(P<0.01)。
1.2 抗菌活性评价结果
在实施例1的抗菌活性评价中，结果如下表所示(n=3)，SNE对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌等9种与创伤相关的细菌均有一定的抑制作用。8 h时对9种菌均具有抑制作用，其中对副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和李斯特氏菌抑制率超过50%。经过24h, SNE表现仍出较强的抑菌活性,后对副溶血性弧菌、无乳链球菌、海藻希瓦氏菌、金黄色葡萄球菌抑制率还能超过30%，具有一定长效作用。
1.3 皮肤创伤愈合评价
在实施例1的皮肤创伤愈合评价中，各组创伤面在第二天均结痂，与NT组相比，SNE组在第6天开始，其伤口显著缩小；第28天，疤痕非常淡，而NT组疤痕清晰可见（如图2）。结果显示SNE组改善了伤口的外观，表面光滑，平坦，而NT组产生明显的疤痕。通过创伤面积计算伤口愈合率，结果如图3所示，随着伤后时间延长，各组愈合率都呈现出升高趋势， SNE组在第6-20天的创面愈合率均极显著高于NT组(P<0.01)，而PC组在第10-20天的创面愈合率均极显著高于NT组(P<0.01)。如图4所示是各组伤口掉痂的时间，分别为NT组(18±1.8257)天、SNE组(13.211±1.6721）天和PC组(14.471±2.5029)天。相比于NT组，SNE组和PC组均可以显著提前伤口掉痂时间(P<0.01)，促进伤口快速愈合。
在给药7天后，进行RT-PCR分析，其结果表明，相比于NT组，SNE组和PC组均显著降低了TNF-a、IL-1β和TGF-β1的mRNA水平(如图5)，其中SNE组TNF-a的mRNA水平还显著低于PC组。这些参与编码炎症细胞炎症因子和生长因子下降，这说明SNE组具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。
如图6所示，第14天，SNE组和PC组小鼠皮肤组织中胶原的mRNA表达水平显著提高，说明在早期阶段，SNE诱导了更高的I型胶原的mRNA表达水平，提供充足的胶原蛋白，形成良好的细胞外基质(ECM)，填充伤口真皮。
为进一步观察组织重塑过程中的胶原纤维，给药21天后用透射电镜对伤口中的胶原纤维进行超微结构鉴定(如图7)。其中NT组、SNE组、PC组和正常皮肤的胶原纤维直径平均值分别为108.7 nm、66.7 nm、52.3 nm和59.5 nm，其中SNE组和PC组表现出与正常皮肤相似的外观，胶原纤维比较圆，轮廓比较清晰，直径分布也比较相近，各自分布比较集中(30-90nm)。而NT组的胶原纤维直径比较大，分布范围也比较广(60-160 nm)(如图8-10)。其中，NT组具有明显结构异常，包括多个胶原之间不清晰的轮廓，趋向于局灶侧向性融合，形成更大的胶原纤维。图8中NS组为正常皮肤组。
综上所述，SNE具有促进伤口愈合和抑制瘢痕形成功能，其作用机制与其止血、抗菌、抗炎、促胶原蛋白沉积、重塑和胶原纤维生长等有密切关联。
将实施例6-9制备的复合纤维膜生物敷料，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载方格星虫水提取物的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。
值得注意的是，本发明的实施例2-5，在止血活性评价、抗菌活性评价、皮肤创伤愈合评价中可达到与实施例1相当的水平，其促进伤口愈合和抑制瘢痕形成的水平相当；本发明的实施例6–9制备的复合纤维膜生物敷料，在止血活性评价、抗菌活性评价、皮肤创伤愈合评价中优于实施例1的水平，其促进伤口愈合和抑制瘢痕形成的效果更佳。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

Claims (10)

1.一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物具有修复皮肤创伤的新用途；
所述方格星虫水提取物的制备方法包括以下步骤：方格星虫虫体冲洗后打碎，按照料液比1:1-1:3加水，调节pH为6.0-8.0，置于50-65℃恒温搅拌水浴锅，提取3-6h，100℃灭菌，6000-10000RPM离心10-20min，冷冻干燥得方格星虫水提取物。
2.根据权利要求1所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；
（2）对创伤模型的小鼠进行给药；
（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、胶原蛋白生成分析中的任一种或几种的组合。
3.根据权利要求2所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫水提取物100-200mg总氮含量/ml水涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。
4.根据权利要求3所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述止血活性评价采用小鼠断尾法测定，通过出血量和出血时间评价体表促凝血活性。
5.根据权利要求3所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50ul，20-70mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，，加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550nm波长，记录为0h的OD值，37℃培养，分别测定8h和24h的OD值，分别计算抑菌率。
6.根据权利要求3所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：
，
公式中n是造模后天数，单位：天。
7.根据权利要求3所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1 mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。
8.根据权利要求1所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫水提取物可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。
9.根据权利要求8所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：
a.将方格星虫水提取物溶于超纯水中，使其完全溶解，以制得方格星虫水提取物溶液；
b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-4:1；所述基料为聚乙烯醇或聚己内酯，所述辅料为海参胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为5％-10％；
c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫水提取物的浓度为0.5-5.0％；
d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种。
10.根据权利要求9所述的方格星虫水提取物在创伤修复中的应用，其特征在于，步骤d中静电纺丝电压为15-30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15cm，注射泵的推进速度可为0.01-0.50mL/min，纺丝环境温度可为35-39℃。
CN201910814538.9A 2019-08-30 2019-08-30 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用 Pending CN110538198A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910814538.9A CN110538198A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910814538.9A CN110538198A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110538198A true CN110538198A (zh) 2019-12-06

Family

ID=68712329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910814538.9A Pending CN110538198A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110538198A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111035792A (zh) * 2019-12-13 2020-04-21 青岛农业大学 一种岩白菜素电纺膜愈伤医用敷料及其制备方法和应用
CN114224777A (zh) * 2021-12-01 2022-03-25 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 一种保湿护肤品
CN114259422A (zh) * 2021-12-01 2022-04-01 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 美白护肤品及方格星虫多糖的提取方法
CN115176766A (zh) * 2022-08-09 2022-10-14 深圳市中兴恒熙环保有限公司 一种利用餐余垃圾饲养黑水虻幼虫的方法及应用
CN115444924A (zh) * 2022-09-29 2022-12-09 广东海洋大学 一种珍珠贝蛋白肽组合物及其制备和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381411A (zh) * 2008-09-28 2009-03-11 宁波大学 星虫胶原蛋白及其制备方法
CN105106937A (zh) * 2015-06-10 2015-12-02 未名生物医药有限公司 神经生长因子用于制备促进皮肤新鲜创面愈合药物的用途
CN106581786A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 华南理工大学 一种功能性补片及其制备方法与应用
CN107184949A (zh) * 2017-05-26 2017-09-22 广东海洋大学 一种表皮创伤修复软膏及其制备方法
CN108355071A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 昆明医科大学 一种红米水提取物在促创伤修复中的应用方法
CN110129396A (zh) * 2019-04-30 2019-08-16 中国热带农业科学院农产品加工研究所 方格星虫体壁蛋白肽提取物及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381411A (zh) * 2008-09-28 2009-03-11 宁波大学 星虫胶原蛋白及其制备方法
CN105106937A (zh) * 2015-06-10 2015-12-02 未名生物医药有限公司 神经生长因子用于制备促进皮肤新鲜创面愈合药物的用途
CN106581786A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 华南理工大学 一种功能性补片及其制备方法与应用
CN107184949A (zh) * 2017-05-26 2017-09-22 广东海洋大学 一种表皮创伤修复软膏及其制备方法
CN108355071A (zh) * 2018-01-12 2018-08-03 昆明医科大学 一种红米水提取物在促创伤修复中的应用方法
CN110129396A (zh) * 2019-04-30 2019-08-16 中国热带农业科学院农产品加工研究所 方格星虫体壁蛋白肽提取物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐艳等: "方格星虫生物活性成分的研究进展", 《广西科学院学报》 *
苏秀榕等: "星虫胶原蛋白的生物学特性研究", 《天然产物研究与开发》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111035792A (zh) * 2019-12-13 2020-04-21 青岛农业大学 一种岩白菜素电纺膜愈伤医用敷料及其制备方法和应用
CN114224777A (zh) * 2021-12-01 2022-03-25 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 一种保湿护肤品
CN114259422A (zh) * 2021-12-01 2022-04-01 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 美白护肤品及方格星虫多糖的提取方法
CN114259422B (zh) * 2021-12-01 2024-02-06 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 美白护肤品及方格星虫多糖的提取方法
CN115176766A (zh) * 2022-08-09 2022-10-14 深圳市中兴恒熙环保有限公司 一种利用餐余垃圾饲养黑水虻幼虫的方法及应用
CN115176766B (zh) * 2022-08-09 2023-05-05 深圳市中兴恒熙环保有限公司 一种利用餐余垃圾饲养黑水虻幼虫的方法及应用
CN115444924A (zh) * 2022-09-29 2022-12-09 广东海洋大学 一种珍珠贝蛋白肽组合物及其制备和应用
CN115444924B (zh) * 2022-09-29 2023-03-10 广东海洋大学 一种珍珠贝蛋白肽组合物及其制备和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110538198A (zh) 一种方格星虫水提取物在创伤修复中的应用
Chandika et al. Marine-derived biological macromolecule-based biomaterials for wound healing and skin tissue regeneration
Boateng et al. Advanced therapeutic dressings for effective wound healing—a review
Kaur et al. Biomaterials-based regenerative strategies for skin tissue wound healing
JP4496375B2 (ja) 創傷の治療又は処置のための薬剤
CN110624097A (zh) 一种珍珠贝小分子肽在皮肤创伤修复中的应用
WO2016004212A1 (en) Hydrogels for treating and ameliorating wounds and methods for making and using them
CN110638836A (zh) 一种水溶性珍珠粉在促进伤口愈合的应用
EP3569260A1 (en) Non-woven fabric bandage and a method for the production of a non-woven fabric bandage
CN110237054A (zh) 一种疤痕修复材料及其制备方法
CN110638999A (zh) 一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用
CN114058663A (zh) 一种多功能牡蛎活性多肽及其制备方法和应用
CN110548018B (zh) 载药纳米纤维及其制备方法和应用
WO2015012682A2 (en) A method for extracting collagen from aquatic animals, collagen and products containing it
CN112891615B (zh) 一种液体创口贴及其制备方法
Chen et al. A novel wound dressing based on a gold nanoparticle self-assembled hydrogel to promote wound healing
US7993665B2 (en) Wound healing agent and composition
Tanga et al. RETRACTED: Centella asiatica extract in carboxymethyl cellulose at its optimal concentration improved wound healing in mice models
CN111214694A (zh) 一种具有止血和加速伤口愈合功能的敷料及其制备方法
Binotto et al. Poly (Lactic Acid) membrane and Sedum dendroideum extract favors the repair of burns in rats
Kazemi et al. Core-shell nanofibers containing L-arginine stimulates angiogenesis and full thickness dermal wound repair
CN112206281A (zh) 一种抗感染修复创面的药物组合物及其制备方法与应用
Smirnova et al. Tissue reconstruction of skin failures and soft-tissue injuries using regenerative medicine methods
Tahir et al. Evaluation of wound healing potential of spider silk using mice model.
Konop et al. Keratin Biomaterials in Skin Wound Healing, an Old Player in Modern Medicine: A Mini Review. Pharmaceutics 2021, 13, 2029

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191206