CN110638999A - 一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；所述方格星虫胶原肽的制备方法包括：S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4‑5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌12‑24小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4‑5倍的0.5M乙酸溶液和0.05‑0.20％胃蛋白酶（w/v），在4℃下提取24‑60小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌12‑24h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；S2.酶解制备方格星虫胶原肽。本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，伤口修复快，且不留疤痕，促创伤修复效果更明显。

Description

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，其主要功能是隔绝机体和环境的保护屏障。在世界范围内，每年遭受皮肤创伤人数超过4000万，在中国，遭受皮肤急性创伤人数每年都超过1000万。如果受损的皮肤不能及时修复，创面很容易受到感染，演变成慢性伤口，严重的创伤甚至危及生命。良好的重塑效果会使皮肤瘢痕减小，甚至达到无痕愈合，重塑异常则会形成异常瘢痕或者瘢痕瘤，以至于留下疤痕，这将给患者的身心健康带来严重的影响。创伤愈合主要包含止血凝血期、炎症期、增殖期和组织重塑期四个时期。在机体遭受创伤后，在止血凝血期，血小板激活，分泌相关因子产生一系列级联反应，促使血液凝集成血栓，达到凝血作用，同时刺激机体产生炎症反应等。在炎症期，中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞，吞噬组织碎片并杀灭入侵的细菌等环境中的污染物，同时分泌各种细胞因子，刺激成纤维细胞分裂、胶原合成和血管生成。增殖期时，成纤维细胞则产生胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸、蛋白多糖等各种细胞外基质(ExtracellularMatrix,ECM)成分，合成肉芽组织，同时分化成肌成纤维细胞，再分泌相关蛋白促进伤口收缩。内皮细胞会被征集到伤口促进血管生成和肉芽组织形成，为新合成组织提供营养和氧气。角质形成细胞则会迁移到真皮之上，分化形成鳞状上皮，愈合伤口。组织重塑期，胶原蛋白和纤连蛋白等在相关细胞因子和细胞的共同调节下，进行不断地合成和分解，达到一个平衡，进行不断地重塑，一直持续到1年或者更长时间。任何一个环节一旦完成必须以精确的顺序停止反应，以防过度或者延迟的反应。

生物活性物质是研究药物、功能食品、生物制品的基本前提。海洋生物与陆生生物的生长环境的巨大差异，是开发结构想新颖天然活性物质的来源。方格星虫，是一种经济底栖生物，其肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富。方格星虫的蛋白占干重73.77%，总糖5.34%，粗脂肪0.67%，是名副其实的高蛋白低脂肪水产品。此外，方格星虫中富含多种氨基酸，以及富含锌、铜、锗、硒等7种微量元素。将海洋生物活性物质应用到促进创伤愈合和预防病理性瘢痕形成的药物，将会成为创伤领域关注的新焦点，具有很好的临床应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用。本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

本发明的技术方案为：

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4-5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌12-24小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4-5倍的0.5M乙酸溶液和0.05-0.20％胃蛋白酶（w/v），在4℃下提取24-60小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌12-24h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任两种酶复配，两种酶的添加量均为3000-5000U/g，pH值5.0-7.0，酶解温度45-55℃，酶解时间3-5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫胶原肽5-60mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。

通过外用方式对创伤皮肤涂抹方格星虫胶原肽, 由于方格星虫胶原肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，且具有良好的抗菌活性；能通过诱导生长因子，促进皮肤及神经增长，利于上皮细胞的增生修复，促进创面的愈合，修复皮肤缺损及组织缺损；皮肤对方格星虫胶原肽也具有很好的吸收作用，快速组合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的另一种可行方式为：按照0.15-0.45g/kg·bw的给药量，采用方格星虫胶原肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

通过内服方式为人体提供方格星虫胶原肽，由于方格星虫胶原肽分子量低，具有消化吸收性快，可直接被肠道吸收，进入血液，达到身体各个部位。通过外源补充胶原蛋白肽后，皮肤和结缔组织中成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管等能够合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损、老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。

本发明的方格星虫胶原肽具有极强的生物活性和多样性，能够高效发挥保健功效，全面调节人体生理功能，特别有助于加速伤口愈合和修复表皮创伤，既可以口服，也可以对创面进行涂抹。

进一步的，所述止血活性评价采用小鼠断尾法测定，通过出血量和出血时间评价体表促凝血活性。具体为，取小鼠18只，体质量33-38 g，随机分为3组。分别为空白组、方格星虫胶原肽组和阳性对照组。将小鼠装进的特定容器中固定，露出尾巴，并使尾巴呈水平放置，在距尾端0.4 cm处用消毒手术剪截断，用消毒棉签轻轻蘸取药物包裹鼠尾断面，用消毒棉签蘸取1 g/kg剂量的方格星虫提取物或云南白药；空白组不予给药，开始计时,每隔约5s用滤纸轻轻吸取血滴,不可挤压伤口, 滤纸不再粘有血迹为止，记下血液停止流出的时间。

进一步的，所述抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50ul，20-70mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550nm波长，记录为0h的OD值，37℃培养，分别测定8h和24h的OD值，分别计算抑菌率。

具体的，所述抗菌活性评价的方法为：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、泥鳅嗜水汽菌、无乳链球菌等种于3%TSB液体培养基中进行活化，将溶藻弧菌、副溶血性弧菌利用3%TSB-3%NaCl培养基活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至OD₅₅₀值为0.1，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50 ul，20-70 mg/mL样品（以总氮算）为样品组，各组均加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，550 nm测定吸光度，记录为0 h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8 h测定一次OD值，24 h测定一次OD值。分别计算抑菌率，公式如下(1)所示：

。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：

，

公式中n是造模后天数，单位：天。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)。具体方法为：使用RNAIso Plus和匀浆器从伤口组织中提取总RNA。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录合成cDNA，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(*2)试剂盒进行荧光定量。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。每延伸一次，都进行实时荧光定量测量。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，用于校正计算靶基因的表达水平，使用∆∆CT方法进行计算。第7天测定TNF-a、IL-1β和TGF-β1，第14、21和28天测定COL1A1(I型胶原蛋白)mRNA水平。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法为：造模后第7天、14天、21天和28天，每组每次分别处死7只老鼠，沿伤口外周3 mm，取全层皮肤，从正中间分成两半，取一半用4%多聚甲醛固定过夜，经脱水、包埋和切片，制成石蜡切片，用于HE染色或者Masson染色；第7天伤口皮肤用苏木素—伊红染色(HE染色)，用于测定伤口表面宽度和表皮生长长度；14天和28天的伤口皮肤也用HE染色，用于测定表皮厚度指数和表皮的薄厚比，计算公式如(3)和(4)。

；

，

公式中n是造模后天数，单位：天。

本发明中，阳性对照组可选用现有技术中创伤修复功效明显的药物，比如云南白药、京万红软膏、银锌抑菌霜等。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798；所述京万红软膏为现有技术天津达仁堂京万红药业有限公司生产的京万红软膏，国药准字Z12020440；所述银锌抑菌霜为现有技术河南汇博医疗股份有限公司生产的邦尔康银锌抑菌霜，注册证号（豫）卫消证字（2004）第0056号。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

中国期刊《保鲜与加工》2018年18期“方格星虫氨基酸含量测定及其营养价值评定”一文中，公开了方格星虫原料的氨基酸组成，证明方格星虫原料含有氨基酸种类多，含量较高，是优质的蛋白来源和功能性物质制备来源。

本发明从方格星虫提取出胶原蛋白，酶解制备的活性肽具有良好的抗菌活性，对其生活环境及创伤感染常见的金黄色葡萄球菌、李斯特菌、无乳链球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、海藻希瓦氏菌嗜水气单胞菌等均具有良好的抑制作用。因而，胶原蛋白肽能够有效的减少创伤愈合过程中细菌感染。同时，胶原蛋白肽通过抗氧化、提升角质层含水量、促进成纤维细胞增殖、减少黑色素形成、增加受伤组织中羟脯氨酸含量等，参与促进创伤修复等一系列相关生物学活动。

方格星虫胶原肽的主要的活性成分包括：甘氨酸、牛磺酸、 精氨酸等功能性氨基酸，钾、锌、铜等元素，以及水溶性小分子肽、多糖等物质。多种活性因子协同增效，可发挥其促进伤口修复的功能活性。方格星虫胶原肽经过动物实验进一步证实了具有促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，其作用机制与止血、抗菌、抗炎、促进生长因子分泌和胶原胶原纤维生长以及调节瘢痕相关因子表达有密切关联。因此，方格星虫胶原肽可作用于伤口的止血期、炎症期、增殖期和重塑期四个创伤愈合时期，可以作为抗异常瘢痕形成的再生愈合活性物质用于真皮损伤的治疗。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-4:1；所述基料为聚乙烯醇或聚己内酯，所述辅料为海参胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为5％-10％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.05-1.0％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种。

本发明中，所述海参胶原蛋白可采用任一现有技术实现，例如中国专利“200710159245.9、海参胶原、胶原蛋白的提取方法”制备的海参胶原蛋白。海参胶原蛋白（PSC）所含氨基酸种类齐全，具有典型胶原蛋白的组成。氨基酸总量达PSC的33.07%。其中，必需氨基酸总量达PSC的5.29%，占氨基酸总量的16%；鲜味氨基酸总量达PSC的19．04%;药效氨基酸总量达PSC的17．69%，这些成分中，具有促进伤口修复的功能因子，可与方格星虫胶原肽协效复配，在复合纤维膜中增强其创口的快速愈合、预防瘢痕形成的功效。

进一步的，所述方格星虫胶原肽溶液的浓度为5-20mg/ml。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为15-30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15cm，注射泵的推进速度可为0.01-0.50mL/min，纺丝环境温度可为35-39℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

特别的，本发明提供一种方格星虫胶原肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

静电纺丝技术制备的纤维膜具有很高的孔隙率及良好的透气性，即可使伤口保持理想的湿润程度，又有利于细胞的呼吸作用。在静电纺丝过程中将药物成分加入纺丝液中，可以得到复合了一些药物成分的纳米纤维，当纳米纤维降解或者遇到水溶胀后，可以将药物成分缓慢释放出来，这种方式不仅可以提高药物的药效，降低了药物的毒副作用。而同轴静电纺丝技术可以在纤维表面进行功能化修饰，同时也可以将功能材料包裹于纤维内部，以起到持久发挥功效的作用。

本发明通过添加方格星虫胶原肽，利用静电纺丝技术，制备获得生物活性敷料，作为创面敷料，具有较大的比表面积和孔隙结构，很好的黏附支持细胞生长，可以提供天然仿生的类细胞外基质，具有抗炎作用，保护其不被伤口微环境降解失活，促进胶原蛋白和细胞因子的合成、分泌，极大改善胶原蛋白沉积，形成有序的篮筐编织样式排列，使之具备正常真皮的特征。本发明提供的方法操作方便，可重复性强，在创伤修复药物中有巨大的应用前景。

本发明的方格星虫胶原肽复合纤维膜，采用海参胶原蛋白或壳聚糖作为载体，由于海参胶原蛋白或壳聚糖本身具有良好的功能活性，能够协效放大方格星虫胶原肽复合纤维膜的抗炎作用以及促进创口快速愈合的效果，使得其在创伤修复中的功效优于单独使用方格星虫胶原肽直接对伤口进行涂抹的功效。所述静电纺丝原料均可通过任一现有技术实现。

本发明敷料制备方法简单易行，所制得的生物敷料伤口黏附良好，安全无毒，应用方便。具有生物活性的方格星虫胶原肽敷料在隔绝创面，透气性好的同时又有止血、抗菌、保湿，同时具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。本发明使用静电纺丝的手段加以处理，以增加方格星虫胶原肽的缓释效果从而能够更好的应用于皮肤创伤修复等医药领域。

附图说明

图1 为本发明一实施例对小鼠创伤愈合的影响（直观图，比例尺=5 mm）；

图2 为本发明一实施例对小鼠皮肤伤口掉痂时间的影响，n≥16 ；

图3 为本发明一实施例对小鼠皮肤创伤愈合率的影响（n≥6；与NT组比，*P<0.05，**P<0.01）；

图4 为本发明一实施例对小鼠创面表皮的愈合质的影响（表皮厚度指数）；

图5 为本发明一实施例对小鼠创面表皮的愈合质的影响（表皮的薄厚比）；

图6 为本发明一实施例对小鼠皮肤创面TNF-α、IL-1β和TGF-β1表达水平的影响(第7d，n≥4)；

图7 为本发明一实施例对小鼠皮肤创面的I型胶原蛋白的表达水平，n≥4。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4.5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌16小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4.5倍的0.5M乙酸溶液和0.10％胃蛋白酶（w/v），4℃下提取30小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌16h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用中性蛋白酶、动物蛋白酶两种酶复配，两种酶的添加量均为3500U/g，pH值7，酶解温度50℃，酶解时间3.5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫胶原肽15mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。

通过外用方式对创伤皮肤涂抹方格星虫胶原肽, 由于方格星虫胶原肽具有良好的生物学特性，与创伤周围组织的亲和性好，且具有良好的抗菌活性；能通过诱导生长因子，促进皮肤及神经增长，利于上皮细胞的增生修复，促进创面的愈合，修复皮肤缺损及组织缺损；皮肤对方格星虫胶原肽也具有很好的吸收作用，快速组合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成。

进一步的，所述止血活性评价采用小鼠断尾法测定，通过出血量和出血时间评价体表促凝血活性。具体为，取小鼠18只，体质量33-38 g，随机分为3组。分别为空白组、方格星虫胶原肽组和阳性对照组。将小鼠装进的特定容器中固定，露出尾巴，并使尾巴呈水平放置，在距尾端0.4 cm处用消毒手术剪截断，用消毒棉签轻轻蘸取药物包裹鼠尾断面，用消毒棉签蘸取1 g/kg剂量的方格星虫提取物或云南白药；空白组不予给药，开始计时,每隔约5s用滤纸轻轻吸取血滴,不可挤压伤口, 滤纸不再粘有血迹为止，记下血液停止流出的时间。

进一步的，所述抗菌活性评价的方法为：选用与感染相关的菌种，将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50ul，25mg/mL样品，样品浓度以总氮含量计，加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，在550nm波长，记录为0h的OD值，37℃培养，分别测定8h和24h的OD值，分别计算抑菌率。

具体的，所述抗菌活性评价的方法为：将大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、泥鳅嗜水汽菌、无乳链球菌等种于3%TSB液体培养基中进行活化，将溶藻弧菌、副溶血性弧菌利用3%TSB-3%NaCl培养基活化。将活化好的菌液用无菌生理盐水稀释至OD₅₅₀值为0.1，在96孔板中加入50uL生理盐水为空白对照、加入50 ul，20-70 mg/mL样品（以总氮算）为样品组，各组均加入50ulTSB培养基和50uL稀释后的菌液，混匀，550 nm测定吸光度，记录为0 h OD值，然后放入37℃培养箱中培养8 h测定一次OD值，24 h测定一次OD值。分别计算抑菌率，公式如下(1)所示：

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进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：

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公式中n是造模后天数，单位：天。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)。具体方法为：使用RNAIso Plus和匀浆器从伤口组织中提取总RNA。使用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒进行逆转录合成cDNA，用TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)(*2)试剂盒进行荧光定量。反应条件为：95℃30s，95℃5s，60℃30s，40个循环。每延伸一次，都进行实时荧光定量测量。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，用于校正计算靶基因的表达水平，使用∆∆CT方法进行计算。第7天测定TNF-a、IL-1β和TGF-β1，第14、21和28天测定COL1A1(I型胶原蛋白)mRNA水平。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法为：造模后第7天、14天、21天和28天，每组每次分别处死7只老鼠，沿伤口外周3 mm，取全层皮肤，从正中间分成两半，取一半用4%多聚甲醛固定过夜，经脱水、包埋和切片，制成石蜡切片，用于HE染色或者Masson染色；第7天伤口皮肤用苏木素—伊红染色(HE染色)，用于测定伤口表面宽度和表皮生长长度；14天和28天的伤口皮肤也用HE染色，用于测定表皮厚度指数和表皮的薄厚比，计算公式如(3)和(4)。

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公式中n是造模后天数，单位：天。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例2

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4.5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌20小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4.5倍的0.5M乙酸溶液和0.13％胃蛋白酶（w/v），4℃下提取35小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌20h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用中性蛋白酶、风味蛋白酶两种酶复配，两种酶的添加量均为3700U/g，pH值6.2，酶解温度49℃，酶解时间3.6小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：按照0.25g/kg·bw的给药量，采用方格星虫胶原肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

通过内服方式为人体提供方格星虫胶原肽，由于方格星虫胶原肽分子量低，具有消化吸收性快，可直接被肠道吸收，进入血液，达到身体各个部位。通过外源补充胶原蛋白肽后，皮肤和结缔组织中成纤维细胞、脂肪细胞及毛细血管等能够合成自身的胶原蛋白，从而形成正常的结缔组织，使受损、老化的皮肤得到填充和修复，达到延缓皮肤衰老的目的。

本发明的方格星虫胶原肽具有极强的生物活性和多样性，能够高效发挥保健功效，全面调节人体生理功能，特别有助于加速伤口愈合和修复表皮创伤，既可以口服，也可以对创面进行涂抹。

进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述抗菌活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体方法与实施例1一致。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法与实施例1一致。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例3

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌24小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4倍的0.5M乙酸溶液和0.05％胃蛋白酶（w/v），4℃下提取60小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌24h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用风味蛋白酶、木瓜蛋白酶两种酶复配，两种酶的添加量均为3000U/g，pH值5.0，酶解温度45℃，酶解时间3小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫胶原肽10mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。

进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述抗菌活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体方法与实施例1一致。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法与实施例1一致。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中京万红软膏；所述京万红软膏为现有技术天津达仁堂京万红药业有限公司生产的京万红软膏，国药准字Z12020440。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例4

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌12小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量5倍的0.5M乙酸溶液和0.20％胃蛋白酶（w/v），4℃下提取24小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌12h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中两种酶复配，两种酶的添加量均为5000U/g，pH值7.0，酶解温度55℃，酶解时间5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药方式为：按照0.15g/kg·bw的给药量，采用方格星虫胶原肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述抗菌活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体方法与实施例1一致。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法与实施例1一致。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例5

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4.5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌18小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4.5倍的0.5M乙酸溶液和0.15％胃蛋白酶（w/v），4℃下提取40小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌18h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶两种酶复配，两种酶的添加量均为4500U/g，pH值6.5，酶解温度52℃，酶解时间4.5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫胶原肽50mg总氮含量/ml水(膏状)涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组（即为NT），连续给药28天；阳性对照组（即为PC）采用同样方法。

进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述抗菌活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体方法与实施例1一致。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法与实施例1一致。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中银锌抑菌霜。所述银锌抑菌霜为现有技术河南汇博医疗股份有限公司生产的邦尔康银锌抑菌霜，注册证号（豫）卫消证字（2004）第0056号。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例6

一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4.7倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌16小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4.7倍的0.5M乙酸溶液和0.14％胃蛋白酶（w/v），在4℃下提取36小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌16h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

进一步的，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用动物蛋白酶、木瓜蛋白酶中的两种酶复配，两种酶的添加量均为3800U/g，pH值6.0，酶解温度53℃，酶解时间4.5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽（即为SNCP）。

进一步的，所述方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

进一步的，所述步骤（1）中，小鼠全层皮损创伤模型方法为：采用5~6周龄雄性小鼠按动物保健和处理程序进行饲养，腹腔注射350 mg/kg水合氯醛麻醉，背部皮肤脱毛消毒后，用直径8 mm打孔器在鼠背部打一个圆孔，切取全层皮肤，深至筋膜，每只动物分笼饲养。

进一步的，所述步骤（2）中，给药方式为：按照0.40g/kg·bw的给药量，采用方格星虫胶原肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

进一步的，所述止血活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述抗菌活性评价采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定采用与实施例1一致的方法。

进一步的，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1(I型胶原蛋白) mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

进一步的，所述步骤（3）中，表皮生长因子测定、炎症因子测定采用实时荧光定量PCR分析(RT-PCR)，具体方法与实施例1一致。

进一步的，步骤（3）中，组织病理学分析的方法与实施例1一致。

本发明中，阳性对照组选用现有技术中的云南白药。所述云南白药为现有技术由云南白药集团股份有限公司生产的云南白药粉剂，国药准字Z53020798。

进一步的，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是以新鲜方格星虫的虫体为原料，经过均浆、用水或盐水热浸提，离心获得上清，经高温灭菌后冻干制的。

本发明中方格星虫胶原肽，选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。方格星虫胶原肽的性状为黄褐色粉末，水溶性好，粗蛋白含量80-90%、水分8.0-10.0%。

本发明提供了一种方格星虫胶原肽在修复皮肤烧伤、创伤、灼伤、烫伤等皮肤创伤药物的新用途，其效果明显优于现有技术的药物，伤口修复快，且不留疤痕，其主要治疗作用包括止血、抗菌、抗炎、调节细胞因子、促进伤口愈合和抑制瘢痕形成等活性，促创伤修复效果更明显。

实施例7

本实施例中，将实施例1-6任一制备的方格星虫胶原肽制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为2:1；所述基料为聚乙烯醇，所述辅料为海参胶原蛋白；所述溶剂为六氟异丙醇；所述载体材料溶液的浓度为8％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.55％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇。

进一步的，所述方格星虫胶原肽溶液的浓度为10g/ml。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为22kV，注射器针头与接收板之间的距离可为12cm，注射泵的推进速度可为0.2mL/min，纺丝环境温度可为37℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

将制备出复合纤维膜，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载胶原肽的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。

特别的，本发明提供一种方格星虫胶原肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

本发明的方格星虫胶原肽复合纤维膜，采用海参胶原蛋白或壳聚糖作为载体，由于海参胶原蛋白或壳聚糖本身具有良好的功能活性，能够协效放大方格星虫胶原肽复合纤维膜的抗炎作用以及促进创口快速愈合的效果，使得其在创伤修复中的功效优于单独使用方格星虫胶原肽直接对伤口进行涂抹的功效。所述静电纺丝原料均可通过任一现有技术实现。

实施例8

本实施例中，将实施例1-6任一制备的方格星虫胶原肽制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1；所述基料为聚己内酯，所述辅料为海壳聚糖；所述溶剂为三氟乙酸；所述载体材料溶液的浓度为5％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.05％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇。

进一步的，所述方格星虫胶原肽溶液的浓度为5mg/ml。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为15kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10cm，注射泵的推进速度可为0.01mL/min，纺丝环境温度可为35℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

将制备出复合纤维膜，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载胶原肽的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。

特别的，本发明提供一种方格星虫胶原肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

实施例9

本实施例中，将实施例1-6任一制备的方格星虫胶原肽制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为4:1；所述基料为聚乙烯醇，所述辅料为海参胶原蛋白；所述溶剂为三氟乙醇；所述载体材料溶液的浓度为10％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.85％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为三氟乙醇。

进一步的，所述方格星虫胶原肽溶液的浓度为20mg/ml。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为15cm，注射泵的推进速度可为0.50mL/min，纺丝环境温度可为39℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

将制备出复合纤维膜，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载胶原肽的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。

特别的，本发明提供一种方格星虫胶原肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

实施例10

本实施例中，将实施例1-6任一制备的方格星虫胶原肽制成复合纤维膜状产品。优选的，所述方格星虫胶原肽是选用新鲜方格星虫虫体，酸提法获得胶原蛋白后，采用酶解方法制备获得方格星虫胶原肽。

进一步的，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，采用超声等现有技术使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为3:1；所述基料为聚己内酯，所述辅料为壳聚糖；所述溶剂为三氟乙醇；所述载体材料溶液的浓度为7％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.35％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇。

进一步的，所述方格星虫胶原肽溶液的浓度为15mg/ml。

进一步的，步骤d中静电纺丝电压为25kV，注射器针头与接收板之间的距离可为14cm，注射泵的推进速度可为0.3mL/min，纺丝环境温度可为38℃。

本发明将和静电纺丝技术联合起来，辅以载体材料制备一种可以调节免疫微环境，具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成，可发挥持久作用的新型生物敷料。

将制备出复合纤维膜，取少量目标纤维，在其表面喷金，于扫描电镜下观察纤维形貌。结果显示，携载胶原肽的复合纤维膜材料，电纺纤维较为光滑，排列不规则，也没有明显的液滴形成，最后形成的纤维膜类物质是呈现多孔状。

特别的，本发明提供一种方格星虫胶原肽复合纤维膜用于创伤修复药物中的用途。

功能评价结果

1.1 止血活性评价结果

通过止血实验，证明SNCP组和PC组有相似的止血效果，出血时间无显著性差异(P>0.05)。SNCP组和NT相比，出血时间极显著降低(P<0.01)。

1.2 抗菌活性评价结果

如下表所示，在实施例1的抗菌活性评价中，SNCP对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、海藻希瓦氏菌、李斯特氏菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌等9种与创伤相关的细菌均有一定的抑制作用。8 h时对9种菌均具有抑制作用，其中对副溶血性弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌和李斯特氏菌抑制率超过50%。经过24 h, SNCP表现仍出较强的抑菌活性,后对副溶血性弧菌、无乳链球菌、海藻希瓦氏菌、金黄色葡萄球菌抑制率还能超过30%，具有一定长效作用。

表SNCP对9种菌抑制率的影响(n=3)

1.3 皮肤创伤愈合评价

在实施例1的皮肤创伤愈合评价中，各组创面随时间变化愈合情况，如图1所示，随着伤后时间延长，在第2 d均结痂，相比NT组，SNCP组明显更快愈合，特别是28 d后，SNCP组改善了伤口的外观，表面光滑，平坦，而NT组产生明显的疤痕。

如图2所示的各组伤口掉痂的时间，分别为NT组(18.0±1.8) d、SNCP组(11.6±0.63) d和PC组(14.5±2.5) d。相比于NT组和PC组，SNCP组均可以显著提前伤口掉痂时间，促进伤口快速愈合。

如图3所示，随着伤后时间延长，各组愈合率都呈现出升高趋势，SNCP组在第2 d至第20 d的创面愈合率均显著高于NT组，SNCP组在第6 d至14 d的创面愈合率显著高于与PC组。PC组在第10 d至第20 d的创面愈合率均显著高于NT组，其中伤后第10 d，SNCP组、PC组和NT组愈合率分别达到(91.41±5.76)%、(72.56±13.14)%和(58.48±17.21 )%，SNCP明显可以加速创面愈合。

病理组织切片结果显示，在14天和28天HE染色切片中观察到SNCP组和PC组处理中变薄和变平的表皮，而NT引起表皮明显不均匀和增厚，边缘呈舌状突起，类似于瘢痕疙瘩。通过定量分析愈合后皮肤表皮厚度指数和表皮厚薄比，

公式中是伤口处上皮平均厚度，

是正常皮肤平均厚度，单位：μm。

如图4所示，通过测定表皮厚度指数，其中28 d SNCP组和PC组的表皮厚度指数分别为1.63±0.53、1.95±0.44均显著低于NT组3.82±0.42，表皮厚度指数越接近1则越接近正常皮肤，SNCP组恢复上皮明显更加接近正常皮肤。

表示伤口表皮厚处薄度平均值，

表示伤口表皮厚处厚度平均值，单位：μm。

如图5所示，通过测定较厚与较薄表皮的厚度比值来表征表皮是否恢复得均匀、平坦光滑， 28 d后，SNCP组较厚与较薄表皮的厚度比值分为0.55±0.10显著大于PC组0.41±0.04和NT组0.21±0.10，比值越接近1代表越平坦均匀，SNCP可以明显改善恢复上皮外观，使之更平坦。

创伤后5-10天仍然是炎症阶段，免疫吞噬组织碎片并杀灭入侵的细菌等环境中的污染物，同时分泌各种细胞因子，刺激成纤维细胞分裂、胶原合成和血管生成。前期研究发现第7天，创伤组织中相关炎症因子含量最高，因此对其进行RT-PCR分析，结果表明（如图6所示），在给药7 d后，相比于NT组，SNCP组和PC组均显著降低了TNF-α、IL-1β和TGF-β1的mRNA水平，其中SNCP组TNF-α的mRNA水平还显著低于PC组。这些参与编码炎症细胞炎症因子和生长因子下降，这说明SNCP组具有抗炎作用，有利于创口的快速愈合，预防瘢痕形成。

皮肤对方格星虫胶原肽也具有很好的吸收作用，快速组合成自身的胶原蛋白，从而加快受损的皮肤得到填充和修复，减少疤痕的形成。I型胶原含量分析结果图如图7所示，在愈合后前期（14d），SNCP能够显著提高表皮组织中I型胶原的mRNA表达水平，可以形成良好的 细胞外基质（ECM），填充伤口，而NT组胶原蛋白合成不足，缺少形成有序排列的成熟胶原蛋白，进而导致皮肤愈合延迟。在进入重塑期后，SNCP组和PC组和一样，I型胶原mRNA保持比较低的水平，有利于ECM的重组，让合成与分解保持动态平衡，通过降解包含异常胶原和合成成熟的新胶原促进ECM重塑。

综上所述，SNCP具有促进伤口愈合和抑制瘢痕形成功能，其作用机制与其止血、抗菌、抗炎、促胶原蛋白沉积、重塑和胶原纤维生长等有密切关联。

值得注意的是，本发明的实施例2-6，在止血活性评价、抗菌活性评价、皮肤创伤愈合评价中可达到与实施例1相当的水平，其促进伤口愈合和抑制瘢痕形成的水平相当；本发明的实施例7–10制备的复合纤维膜生物敷料，在止血活性评价、抗菌活性评价、皮肤创伤愈合评价中优于实施例1的水平，其促进伤口愈合和抑制瘢痕形成的效果更佳。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过任一现有技术实现。

Claims (10)

1.一种方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽具有修复皮肤创伤的新用途；

所述方格星虫胶原肽的制备方法包括以下步骤：

S1.提取方格星虫胶原蛋白；将新鲜虫体剪碎后，按照加入原料质量4-5倍0.2M NaOH，在4℃下搅拌12-24小时，离心去上清；沉淀用蒸馏水洗净沥干后，加入质量4-5倍的0.5M乙酸溶液和0.05-0.20％胃蛋白酶（w/v），在4℃下提取24-60小时后，离心取上清液，缓慢加入NaCl至1M，搅拌12-24h、离心、收集沉淀物、0.5M乙酸溶解、透析、冻干，制得胶原蛋白；

S2.酶解制备方格星虫胶原肽。

2.根据权利要求1所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述S2中，酶解的具体方法包括：选用中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的任两种酶复配，两种酶的添加量均为3000-5000U/g，pH值5.0-7.0，酶解温度45-55℃，酶解时间3-5小时，100℃灭酶10分钟后，离心取上清液，冷冻干燥得到方格星虫胶原肽。

3.根据权利要求1所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）建立小鼠全层皮损创伤模型；

（2）对创伤模型的小鼠进行给药；

（3）对创伤修复效果进行功效评价，所述功效评价包括一级功效评价和二级功效评价；所述一级功效评价包括止血活性评价、抗菌活性评价的的任一种或两种；所述二级功效评价为皮肤创伤愈合评价，所述皮肤创伤愈合评价包括伤口愈合率测定、掉痂时间测定、表皮生长因子测定、炎症因子测定、组织病理学分析中的任一种或几种的组合。

4.根据权利要求3所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，给药的方式为：取方格星虫胶原肽5-60mg总氮含量/ml水涂抹伤口，涂满为止，每天涂抹给药一次，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

5.云南白药阳性对照组，

根据权利要求3所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，给药的方式为：按照0.15-0.45g/kg·bw的给药量，采用方格星虫胶原肽对小鼠进行灌胃，每天灌胃给药一次，灌胃量为0.1mL/10g·bw，采用无菌生理盐水为阴性对照组，连续给药28天。

6.根据权利要求4或5所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述伤口愈合率测定和掉痂时间测定的方法为：所述步骤（2）中涂抹给药后，从第0天开始，每2天在同一固定高度拍照记录伤口创面情况，用软件计算伤口愈合率、记录掉痂时间；伤口愈合率测定的公式（2）为：

，

公式中n是造模后天数。

7.根据权利要求4或5所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中，所述步骤（3）中，所述表皮生长因子测定和炎症因子测定中涉及的因子包括TNF-a、IL-1β、TGF-β1、COL1A1 mRNA、TGF-β1、a-SMA、TGF-BRII、Smad7中的任两种或以上。

8.根据权利要求1所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述方格星虫胶原肽可制成包括粉末状、溶液状、乳状、膏状、凝胶状、复合纤维膜状的任一种产品。

9.根据权利要求8所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，所述复合纤维膜状产品为通过静电纺丝技术制得的静电纺丝复合纤维膜，所述的制备方法为：

a.将方格星虫胶原肽溶于超纯水中，使其完全溶解，以制得方格星虫胶原肽溶液；

b.将载体材料溶于溶剂中，以制得载体材料溶液；所述载体材料包括基料和辅料，所述基料与辅料的质量比为1:1-4:1；所述基料为聚乙烯醇或聚己内酯，所述辅料为海参胶原蛋白或壳聚糖；所述溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种；所述载体材料溶液的浓度为5％-10％；

c.将步骤a和步骤b所得的溶液充分涡旋混合，使其充分溶解，制得纺丝溶液；纺丝溶液中方格星虫胶原肽的浓度为0.05-1.0％；

d.使用步骤c所获得纺丝溶液，采用静电纺丝的方法，制备获得生物活性敷料；静电纺丝所用溶剂为六氟异丙醇、三氟乙酸、三氟乙醇中的任一种。

10.根据权利要求9所述的方格星虫胶原肽在创伤修复中的应用，其特征在于，步骤d中静电纺丝电压为15-30kV，注射器针头与接收板之间的距离可为10-15cm，注射泵的推进速度可为0.01-0.50mL/min，纺丝环境温度可为35-39℃。

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