JP5560570B2

JP5560570B2 - 創傷治療用医薬組成物

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Publication number: JP5560570B2
Application number: JP2009042671A
Authority: JP
Inventors: 健司佐藤; 泰毅重村; 明子島谷; 裕晶若本
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2009-02-25
Filing date: 2009-02-25
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2029-02-25
Also published as: JP2010195714A

Description

本発明は、創傷治療用の医薬に関する。特には、本発明は、細胞遊走促進効果および細胞増殖促進効果を有する、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）とグリシン（Ｇｌｙ）のジペプチドまたはその薬理学的に許容される誘導体を含む、創傷治療用医薬組成物に関する。

皮膚の損傷に対する治療法は、以前は創傷部の感染を回避するべく、創傷部を洗浄し、消毒し、乾燥させる方法が主流であった。しかし、近年、消毒をせず、乾かさない方法へと治療方法が移行しつつある。これは、創傷部位からの滲出液には細胞成長因子が多く含まれ、これを傷口にとどめることで創傷部位の線維芽細胞の増殖、組織形成を促し、ひいては創傷部の治癒を促進する原理に基づく。

皮膚の創傷治癒過程、具体的には、切傷、擦過傷、火傷などの急性創傷および褥瘡などの慢性創傷の治癒過程は、一般的に、凝固止血期、炎症期、増殖期、組織再構築期、成熟期の５つのステップに分類される。増殖期には、創傷部位に線維芽細胞および毛細血管が侵襲し、線維芽細胞増殖やコラーゲン合成が促進され、細胞外基質が合成され、組織再構築期には細胞外基質が蓄積し、コラーゲンなどの生産が高まる。

皮膚の創傷治療を促進するために供給される物質として、近年、線維芽細胞増殖因子（非特許文献１）の使用が盛んに行われている。しかし、このような一般的な細胞増殖因子は高分子のタンパク質であり、通常は遺伝子組換えにより生産されるため、製造や取扱に注意を要し、結果として、高額で、重度の創傷にのみ用いられているのが現状である。しかし、例えば高齢者の褥創、慢性的なあかぎれなど、重度ではないものの、治癒しにくい創傷の早期治療の要求は高く、安全且つ安価な、使用に技術を要しない創傷治癒促進物質の供給が求められてきた。

ところで、コラーゲンは生体内のタンパクの約２５％を占め、主要な細胞外マトリクスとして重要な役割を果たす。特に、血管、皮膚、骨に多く存在し、細胞の足場としてこれらの組織の形成、構築に重要な役割を果たしている。コラーゲンは、その内部に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ配列を多く含み、３残基ごとにグリシン残基が配置される特徴的な繰り返し配列により、三重螺旋構造を形成する。この三重螺旋構造が加熱により変性したものが、ゼラチンである。

コラーゲンやゼラチンは、食品や化粧品用途に広範に利用されている。近年では特に、コラーゲンを熱変性させたゼラチンを部分加水分解したコラーゲンペプチドの経口摂取により、肌の状態が改善されること、特に冬期の肌の水分減少が抑制されることや、関節の状態が改善されること、骨密度が上昇することなどの報告があり、主に美容用途として健康食品や飲料として用いられている（非特許文献２）。

他方で、コラーゲンやゼラチンは、その細胞支持機能に着目して医療用材料としても関心を集めており、例えば、止血剤、人工血管、癒着防止膜、創傷被覆剤、美容整形分野への用途開発が進められている。

しかし、それらに求められる機能は、一般的に、該皮膚損傷部を乾燥から守り、新たな組織の進入の足場となる機能であり、積極的な細胞遊走を促す機能とは異なる。
また、コラーゲンは一般にブタ、ウシなどの動物由来であり、感染性物質の混入のリスクが否定できない。

１９６０年代に、ゼラチンを多量に摂取したヒトの尿中にＨｙｐを含むペプチドの存在が報告されており、２００５年には、岩井らにより、コラーゲンペプチドを摂取した後、ヒトの末梢血液に、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐなどのコラーゲンペプチド由来の低分子ペプチドが現れることが発表された（非特許文献３，４）。更には、その後の研究により、Ｈｙｐ−Ｇｌｙペプチドもヒト末梢血中に存在することが明らかとなった。

コラーゲンは、その加水分解物が、線維芽細胞の遊走を誘導することが知られており（特許文献１）、更には、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、線維芽細胞、血中の好中球および単球に対して化学遊走性を持つことが報告されている（特許文献２）。線維芽細胞は、組織に血小板が生じ血小板由来成長因子などが放出されると損傷部に遊走し、コラーゲンを合成することで傷を修復し、その上を上皮系の細胞が遊走してさらに傷の修復が進む。組織の損傷に伴いコラーゲンの分解が生じ、内因性のＰｒｏ−Ｈｙｐなどがこの遊走を促進すると考えられている。しかしながら、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドについては、ほとんど研究がなされておらず、線維芽細胞に対して増殖促進効果や遊走促進効果を有するかどうかは全く不明であった。

特開２００２−１７３４４５号公報特開２００５−２８９８１９号公報

日本再生医療学会雑誌 Vol.4 No.1 p53〜61 FOOD STYLE 21 Vol.11 No.4 p22〜24 J．Agric．Food Chem，2005, 53, p6531-6536 J．Agric．Food Chem，2007, 55, p1532-1535

本発明は、安全性の高い、細胞遊走活性または細胞増殖活性を持つ物質を提供することにより、創傷に対して、皮膚の再生を促して治癒を促進させるための医薬組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コラーゲンペプチドの分解物の１つである、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドに、皮膚の線維芽細胞の増殖および遊走の促進効果があることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下を提供する。
［１］アミノ酸配列がＨｙｐ−Ｇｌｙで表されるジペプチドまたはその薬理学的に許容される誘導体を含有することを特徴とする、創傷治療のための医薬組成物。
［２］経口、皮下または経皮により投与されることを特徴とする、［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記ペプチドまたはその誘導体の含有量が０．１〜５０重量％である、［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［４］前記ペプチドまたはその誘導体の含有量が０．５〜１０重量％である、［１］または［２］に記載の医薬組成物。
［５］剤形が、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、粉剤、塗布剤、乳剤、噴霧剤、滴剤、散剤、貼付剤またはドレッシング剤である、［１］〜［４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［６］さらに、止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質および抗炎症物質からなる群より選択される一種類以上を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬組成物。

Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドまたはその薬理学的に許容される誘導体は、生体に近い条件下で、皮膚線維芽細胞の遊走促進効果および細胞増殖促進効果を示し、従来のペプチドよりも優れた創傷治療効果を示すことから、それらは創傷治療用の医薬組成物の有効成分として有用である。Ｈｙｐ−Ｇｌｙは単純なアミノ酸残基からなり、これまで創傷治療に有効とされてきたＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチド、Ｐｒｏ−Ｈｙｐジペプチドに比べ、工業上、安価に合成することが可能である。

図１は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド、Ｐｒｏ−ＨｙｐジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチドを含む培地中で、マウス皮膚より１ｍｍ以上の距離を遊走した線維芽細胞数を示したものである。なお、＊はペプチドを添加しないコントロールと比べて有意差 (p < 0.05)があることを示す。図２は、コラーゲンゲル上で、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド、Ｐｒｏ−ＨｙｐジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチドを含む培地中で増殖した線維芽細胞数をＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８を用いて測定したものである。コントロールはペプチドを添加しない場合を示す。なお、a,b,c は異なる記号間で有意差 (ｐ< 0.05)があることを示す。図３は、ＩＣＲマウスの背部正中部に全層欠損創を作製し、Ｈｙｐ−ＧｌｙジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチドを滴下し、３日後に創傷の縮小面積を測定したものである。コントロールはペプチドを添加しない場合を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、固相ペプチド合成法、液相ペプチド合成法などの、一般的なペプチド合成法によって得られる。また、ブタ、ウシ、馬などの動物由来コラーゲンを、希塩酸、希硫酸などの酸性溶液、もしくは水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液などのアルカリ溶液などで加水分解することによってもＨｙｐ−Ｇｌｙジペプチドを得ることができる。このようにして得られたＨｙｐ−Ｇｌｙジペプチドを含む混合物は、ゲルろ過などの一般的な方法により、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドを精製することが望ましい。

Ｈｙｐ−Ｇｌｙの誘導体としては、Ｈｙｐ−Ｇｌｙの修飾によって得られる化合物であって、皮膚線維芽細胞に対する遊走促進効果および細胞増殖促進効果を有し、薬理学的に許容されるものであれば特に制限されないが、例えば、Ｈｙｐ−Ｇｌｙのメチルエステル、エチルエステル等が挙げられる。

本発明の医薬組成物はＨｙｐ−Ｇｌｙまたはその薬理学的に許容される誘導体を、通常の医薬の調製に使用される担体と組み合わせることによって調製することができる。
ここで、担体としては薬理学的に許容されるものであればよいが、可溶化剤、ｐH調整剤、賦形剤、保存剤、乳化剤、防腐剤、色素、矯味矯臭剤、増粘剤などが例示される。

本発明の医薬組成物の剤形としては、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、粉剤、塗布剤、乳剤、噴霧剤、滴剤、散剤、貼付剤、ドレッシング剤などがあり、必要に応じて適当な賦形剤を加えることができる。賦形剤は、一般的に医薬品・医療用機器・医薬部外品等に
用いられるものであれば種類を問わない。例えば、ポリビニルアルコール、グリセロール、キトサン、カルボキシメチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸、ポリプロピレングリコールなどが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド又はその誘導体に加えて、止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質および抗炎症物質を含むものであってもよい。
ここで、止血活性物質としては、プロトロンビン、トロンビン、フィブリノーゲン、フィブリン、フィブロネクチン、ヘパリナーゼが例示される。
また、成長因子としては、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）が例示される。
また、抗感染物質としては、クロラムフェニコール、マクロライド、キノロン、β−ラクタム、テロラサイクリン、サルファ剤が例示される。
また、鎮痛物質としては、アスピリン、アミノピリン、アセトアミノフェン、エテンザミドが例示される。
また、抗炎症物質としては、オキシベンゾン、トラネキサム酸及びその誘導体、イプシロンアミノカプロン酸、グリチルリチン酸、アズレン、塩酸ジフェンヒドラミン、アミノカプロン酸が例示される。
Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド又はその誘導体は、医薬組成物中に０．１〜５０重量％の割合で含まれることが好ましく、０．５〜１０重量％の割合で含まれることがより好ましい。本発明の創傷治療用医薬組成物は、経口、皮下または経皮などの方法により投与することができる。
投与量は創傷の大きさや重傷度などに応じて適宜設定することができる。

以下に、本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下、特段の記載のない％はすべて重量／容量％を示す。

実施例１
細胞遊走性試験
５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）の腹部の皮膚を、３ｍｍのディスクに切り取って、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）中に採取した。その後、２４穴のプラスチックプレートに移し、５８４μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、２００ｎｍｏｌ／ｍＬの検体（Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド、Ｐｒｏ−ＨｙｐジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチド）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、５容量％炭酸ガス存在下に置いた。その後、マウス皮膚のディスクから１ｍｍ以上の距離を遊走した線維芽細胞の数を２４時間ごとに顕微鏡により測定した。
結果を図１に示す。図１より、ペプチドを加えないコントロールに比べ、ペプチドを加えたディスクでは細胞遊走促進効果が高いことが分かる。

実施例２
細胞増殖試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の皮膚を６−７ｍｍ程の幅に培養皿（直径７５ｍｍ）に切り採り、５８４μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０容量％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む８ｍＬのＤＭＥＭを加え、３７℃、５容量％炭酸ガス存在下で培養した。培養の間、２日ごとに培地を交換し、２週間後に皮膚を取り除き、線維芽細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で剥離回収した。これを、５８４μｇ／ｍＬのＬ−グルタミン、０．０１ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１０容量％のＦＢＳ、および、２００ｎｍｏｌ／ｍＬの検体（Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチド、Ｐｒｏ−ＨｙｐジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチド）を含むＤＭＥＭを加えて５×１０⁴
個／ｍＬとなるように調製し、予め作成しておいたコラーゲンゲル（９６穴のプラスチックプレートに、０．５％のコラーゲン溶液を含むＤＭＥＭ１００μＬを加えて、３７℃、５容量％炭酸ガス存在下で静置して調製）に播種し、３７℃、５容量％炭酸ガス存在下で培養した。１４４時間培養した後、ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ−８（同仁化学）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞数を計測した。
結果を図２に示す。これより、コラーゲンゲル上で、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドは、線維芽細胞の増殖を促進することが分かる。

実施例３
マウスを用いた創傷治療効果の評価
皮膚の全層欠損創傷治癒の実験用としてＩＣＲマウス雌（8週齢）を予備飼育した。ペントバルビタール麻酔下でマウスの背部を剪毛し、エタノールで清拭後、背部正中部に生検トレバンφ3mmにて全層欠損創を４箇所作製し、面積を測定した。創面に、最終濃度２％の検体（Ｈｙｐ−ＧｌｙジペプチドまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチド）と７．５％ポリビニルアルコールを含む溶液１０μＬを滴下投与した後、防水絆創膏（ニチバン
シアテープ）をはり、周りを瞬間接着剤で密閉した。３日の後、マウスを安楽死させ、創傷部の面積を測定した。各ペプチドを用いたときの、創傷の縮小面積を図３に示した。図３より、コントロール（ペプチドなし）やＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙトリペプチドに比べ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙジペプチドは、創傷の縮小に効果を示すことが分かる。

本発明の医薬組成物は創傷の治療に有用である。

Claims

アミノ酸配列がＨｙｐ−Ｇｌｙで表されるジペプチドを含有し、経皮により投与されることを特徴とする、創傷治療のための医薬組成物。
剤形が、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、粉剤、塗布剤、乳剤、噴霧剤、滴剤、散剤、貼付剤またはドレッシング剤である、請求項１に記載の医薬組成物。
アミノ酸配列がＨｙｐ−Ｇｌｙで表されるジペプチドを含有し、剤形が、塗布剤、貼付剤またはドレッシング剤である、創傷治療のための医薬組成物。
前記ジペプチドの含有量が０．１〜５０重量％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記ジペプチドの含有量が０．５〜１０重量％である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
さらに、止血活性物質、成長因子、抗感染物質、鎮痛物質および抗炎症物質からなる群より選択される一種類以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。