CN115721638A - 月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在制备促伤口愈合药物中的应用 - Google Patents
月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在制备促伤口愈合药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(LAE)或其组合物在制备促进伤口愈合的药物中的应用;所述药物通过利用月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物促进成纤维细胞的生长迁移、提高与伤口愈合相关基因的转录水平和表达水平,促进表皮再生、血管新生和胶原沉积,促进皮肤伤口愈合。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,具体涉及月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在制备促伤口愈合药物 中的应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官,是人体抵御外界微生物入侵,保护人体的第一道屏障。完 整的皮肤可以防止外界环境的病原体侵犯,但是,由于外力、高温、化学腐蚀及自身代谢疾病等原因,皮肤会产生伤口,伤口产生后,皮肤的完整性遭到破坏,皮肤内部的组织就 会暴露于外界,这为外界微生物提供了极有利的增殖的环境。所以,任何伤口都会存在被 感染的风险,如果不重视,很可能会造成伤口的局部感染甚至发展为全身感染。除此之外, 伤口愈合不良影响患者的心理健康,导致患者产生自卑甚至抑郁的不良情绪。
伤口愈合是指机体遭受外力作用后,皮肤等组织出现离断或缺损后的愈合过程,主要 包括各种组织的再生、肉芽组织增生,瘢痕组织形成等。伤口愈合是一个复杂的生物学过 程,机体需要修复细胞的损伤并维持组织的完整性。一般来说,伤口周围的细胞必须迁移 到受伤的区域进而在损伤部位增殖,才能产生新的组织,维持正常组织的状态。整个过程 需要协同有序地进行,否则会影响伤口的愈合速率甚至影响机体的美观和健康。
血管内皮生长因子(VEGF)是促血管内皮细胞生长因子,在正常生理性血管生长过程 中,伤口愈合过程中,VEGF信号具有重要作用。VEGF的信号通路参与到血管新生整个过程,它可以与血管内皮细胞膜上的相应受体结合,引发级联反应,促进血管新生,增加血 管壁的通透性,为血管内皮细胞的迁移和血管形成提供基础,在一定程度上决定了血管新 生的结果。
胶原(Collagen)是生物的主要组织器官中含量最丰富的蛋白质,占生物体内蛋白质总 含量的30%,是细胞外基质的重要组成成分。胶原也是一种主要的结构功能蛋白质,它赋 予了皮肤、软骨、跟腱、韧带和内脏等组织器官一定的机械强度。胶原蛋白独特的生物性 能与其组成成分和结构有关,所有胶原蛋白都是由三条肽链组成。三股螺旋原胶原大分子 以一定间距、纵向交错排列形成胶原原纤维;胶原原纤维聚集成纤维,进而形成更大的胶 原纤维束。胶原蛋白独特的化学结构赋予其一定的机械强度和生物学性能。胶原蛋白作为 细胞外基质重要组成成分,在损伤修复过程中发挥重要作用。人的皮肤中,主要以Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原为主,在一定的伤口愈合张力作用下,其较易形成规则的排列。Ⅲ型胶原最早出现,行使构建“桥梁”的作用,Ⅰ型胶原纤维随后出现,并沿其方向有序排列,形成 稳固的支架,促进伤口的无瘢痕愈合。胶原蛋白能够加快细胞的生长,促进细胞的粘附增 殖,促进细胞的分化,使肉芽或上皮能逐渐生长,从而加速伤口的愈合时间。成纤维细胞 是构成肉芽组织的主要成分之一,能合成、分泌大量胶原蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基 质,通过多途径参与修复过程。近年来,胶原蛋白广泛应用于医疗卫生领域中,制成的胶 原蛋白产品如胶原注射液、止血纤维、止血海绵等都展示出了良好的应用前景。
针对皮肤伤口,对于健康个体或小伤口而言,大部分无需任何外部干预即可进行组织 再生并恢复创面皮肤的正常功能。但是,如果个体衰老、伤口过大或机体处于疾病状态, 尤其是伤口愈合的免疫反应过程已经失调,可能会阻止正常组织的再生,从而导致伤口愈 合失败或发展为慢性炎症。皮肤伤口的治疗是临床常见的问题之一,如何促进伤口创面的 愈合、提高愈合质量一直是研究的热点。因此,寻找一种促进血管生成以及胶原产生进而 促进伤口愈合的无毒无害的药物是急需的。
月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(Ethyl lauroyl arginate HCL,LAE)是一种由脂肪酸和二元氨 基酸缩合而成的有机物,为白色吸湿性固体,在pH 3~7范围内化学性质稳定,熔点50~ 58℃,该温度下247g的LAE可分散于1kg的水中,它在水和油中的分配系数大于10,即 主要存在于水相中。研究发现,月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐LAE具有抗菌能力强、生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高的特点。而其中最具代表性的特点是月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐代谢无残留,相关研究显示月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在人体与动物体内可快速进行自然代谢,生成月桂酸和精氨酸,进一步被代谢为鸟氨酸、尿素、二氧化碳和水。月 桂酰精氨酸乙酯盐酸盐代谢过程中所产生的所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的,与人和动物日常摄取的食物在体内的代谢产物相同。
例如,中国专利申请CN201910549188.8、发明名称为“新的药物包裹制品及其制备方 法和应用”公开了月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐用于制备药物包裹制品的用途。提供了制备含 有月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐及其离子对衍生物的药物包裹制品的方法及其制备的药物包裹 制品。该发明的药物包裹制品,具有天然无毒、高效抑菌、易于被动物降解且能发挥药物协 同作用的特点。
中国专利申请CN201910549266.4、发明名称为“抗菌型保鲜膜及其制备方法和应用” 公开了一种抗菌型保鲜膜,其包括月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其离子对衍生物。该发明还提 供制备含有所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐及其离子对衍生物的保鲜膜的方法及其制备的保 鲜膜,具有抑菌无毒、性能稳定、易于加工的特点。
中国专利申请CN201910543733.2、发明名称为“新型皮革防霉护理剂及其制备方法和 应用”公开了月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐LAE用于制备环保无毒的皮革防霉剂或防霉型护理 剂的用途,并提供制备所述皮革或皮革护理剂的防腐剂或防霉型的方法及其制备的皮革防 霉剂或防霉型护理剂。该专利发明的皮革防霉剂或防霉型护理剂,具有天然无毒、高效抑菌、 易于降解、环境友好的特点。
中国专利申请CN201610466729、发明名称为“一种温和的婴童洗发沐浴泡泡”公开了 一种温和的婴童洗发沐浴泡泡,其针对婴童毛发及肤质的特点,选用椰油酰谷氨酸二钠、 椰油酰胺丙基甜菜碱及磺酸羟丙酯月桂基葡糖苷交联聚合物钠复配作为表面活性剂体系, 选用山茶籽油、α-葡聚糖寡糖/菊粉复配物作为调理成分,野菊花提取物和月桂酰精氨酸乙 酯盐酸盐复配作为防腐体系,该发明中各原料互相协作,清洁效果好,温和无刺激。
中国专利申请CN200580051259、发明名称为“包括阳离子表面活性剂的防腐体系”首 次公开月桂酰精氨酸乙酯及其盐酸盐用于防腐体系中的用途,在食品、化妆品中添加包含 0.2g/kg LAE的该体系从而起到防腐作用。该发明研究了月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐的抑菌机 理,并提出如何将月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐用于食品、化妆品等防腐作用的应用,因此美 国食品安全局于2005年批准月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐用于食品防腐剂;2012年欧盟食品安 全局、澳大利亚和新西兰也都批准了月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐用于食品防腐剂。同时,鉴 于该发明首次提出在化妆品方面的应用,后续研究中发现月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐可用于 口腔护理方面的产品(例如US20100330136A1、EP2361606A2、EP231603A2),如漱口水、 牙膏等,可有效抑制口腔内牙斑的形成,它与漱口水中的其它化学成分兼容且化学性质稳 定;月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐可用于有局部治疗功效的化妆品中,这些化妆品有以下的特 性:抗菌效果,低毒,没有致敏作用,对皮肤没有刺激。目前,研究人员正在研制清洁的洗手液和用于皮肤表面的抑菌剂。
月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐主要用于医药、化妆品行业,在医药方面,月桂酰精氨酸乙 酯盐酸盐主要用于抑制产品中微生物的滋生方面,而对于月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在促进 伤口愈合方面,还未有相关研究。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足,本发明的目的是提出如式(I)所示的月桂酰精氨酸乙 酯盐酸盐(LAE化合物)或其组合物在制备促进伤口愈合的药物中的应用。
式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(LAE化合物)是一种由脂肪酸和二元氨基酸缩 合而成的有机物,又名N-月桂酰基-L-精氨酸乙酯盐酸盐、月桂酰精氨酸乙酯、HCL月桂精 氨酸乙酯盐酸盐、N-月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐、月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐、月桂酰精氨酸 乙酯、月桂酰-L-精氨酸乙酯、L-月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐,英文名:ETHYL LAUROYLARGINATE HCL,分子式为C20H41ClN4O3,分子量:421.01754,CAS号:60372-77-2。
所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐LAE在药物中的含量为0.001-200μg/ml;优选地,为100-200μg/ml。
本发明应用中,所述组合物还包含药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体内和/或体外促进 胶原、血管内皮生长因子的基因的转录水平和蛋白水平。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物促进成纤维细胞的生 长、迁移、增殖。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够在体外促进人成 纤维细胞HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的迁移。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够在体外促进人成 纤维细胞HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的增殖。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够显著促进小鼠模 型中的伤口愈合。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够显著促进体内的 胶原沉积。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够显著促进体内表 皮再生。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物能够显著促进体内血 管的新生。
本发明还提出了式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体内和/或体外提高 胶原、血管内皮生长因子表达等与伤口愈合相关的基因的转录水平和蛋白水平中的应用。
式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体外促进人成纤维细胞HAF和小 鼠皮肤成纤维细胞3T3的collagenⅠ、collagenⅢ以及vegf等基因转录水平以及蛋白水平;在 体内促进伤口周围组织的collagenⅠ、collagenⅢ以及vegf的基因转录水平以及蛋白水平。
本发明还提出了式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在促进人成纤维细胞 HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的迁移中的应用。
本发明应用中,式(I)月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物可以促进人成纤维细胞HAF 和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的横向与纵向迁移。
本发明提出了式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在促进人成纤维细胞 HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3增殖中的应用。
本发明应用中,式(I)月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体外促进人成纤维细胞 HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的增殖。
本发明还提出了式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在促进小鼠模型伤口 愈合中的应用。
本发明应用中,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物可以促进表皮再生, 血管新生和胶原沉积,提高小鼠伤口愈合的速率。
本发明通过前期实验基础得到式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐,该化合物能够在 体内和体外显著促进胶原的表达。
本发明提出的式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物不仅能够显著促进人成 纤维细胞HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3的增殖与迁移,而且能促进胶原的表达。此外,本 发明从体外和体内实验证明了该化合物或其组合物能够促进伤口愈合。本发明进一步实验证 明,式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物通过促进成纤维细胞的增殖与迁移, 促进血管新生和胶原的表达与沉积,进而促进伤口愈合。根据以上结果,本发明提出的式(I) 所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物可以治疗伤口愈合。
本发明中,“月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐(Ethyl lauroyl arginate HCL,LAE)”是指,一种 由脂肪酸和二元氨基酸缩合而成的有机物,为白色吸湿性固体,在pH 3~7范围内化学性质 稳定,熔点50~58℃,该温度下247g的LAE可分散于1kg的水中,它在水和油中的分配 系数大于10,即主要存在于水相中。本发明提出的月桂酰精氨酸乙酯LAE具有抗菌能力强、 生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高的特点。而其中最具代表性的特点是月桂酰 精氨酸乙酯代谢无残留,月桂酰精氨酸乙酯在人体与动物体内可快速进行自然代谢,生成月 桂酸和精氨酸,进一步被代谢为鸟氨酸、尿素、二氧化碳和水。月桂酰精氨酸乙酯代谢过程 中所产生的所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的,与人和动物日常摄取的食物在体内 的代谢产物相同。
本发明中,“伤口愈合”是指,机体遭受外力作用后,皮肤等组织出现离断或缺损后的愈 合过程,主要包括各种组织的再生、肉芽组织增生,瘢痕组织形成等。
本发明还提出了一种包含如式(I)所示的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐化合物LAE、和/或 LAE的水合物、和/或LAE药学上可接受的盐、和/或LAE药学上可接受的载体的组合物在制 备促进伤口愈合的药物中的应用。
本发明中,所述伤口愈合包括急性伤口愈合和慢性伤口愈合。
所述急性伤口包括外伤引起的新鲜伤口、大面积软组织缺损、烧伤伤口、术后裸露伤口;
所述慢性伤口包括各种是手术后感染的切口、溃疡、褥疮、未经初期有效处理的外伤伤 口。
本发明的有益效果包括:本发明应用中所采用的化合物月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐是国内 外公认的一种广谱抑菌剂,已被很多国家批准允许应用于食品保鲜,其代谢过程中所产生的 所有初级代谢产物及终产物都是无毒无害的。已有研究主要聚焦于它的抗菌防腐的作用上, 应用于洗护用品添加剂,食品添加剂,饲料添加剂等方面。本发明根据月桂酰精氨酸乙酯盐 酸盐LAE生物毒性低、体内代谢效果好、与环境相容性高且常温下与其他化合物不发生反应 的特点,首次提出将LAE作为促伤口愈合的药物成分。其次,目前临床促伤口愈合的药物的 主要方式是施加生长因子,这种治疗方式造价高昂,增加患者的经济负担,有些还会增加患 者患癌风险。而本发明应用中所采用的化合物月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐造价低廉且安全,而 且对于伤口愈合具有很好的促进效果,实验表明,低浓度(<10μg/ml)的月桂酰精氨酸乙酯 盐酸盐能显著促进成纤维细胞的增殖和迁移,促进与伤口愈合相关基因的表达;在小鼠模型 中,剂量为200μg/ml的月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐能够有效促进胶原蛋白和血管内皮生长因子 的表达,从而实现促进伤口愈合的目的。
附图说明
图1:LAE在体外促进伤口愈合相关的基因在转录水平、蛋白水平的表达。
图2:LAE促进成纤维细胞的体外增殖。
图3:LAE促进成纤维细胞的体外横向迁移。
图4:LAE促进成纤维细胞的体外纵向迁移。
图5:LAE促进小鼠急性切除伤口的愈合。
图6:LAE在体内促进伤口愈合相关的基因在转录水平、蛋白水平的表达。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、 实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有 特别限制内容。
实施例一:LAE在体外促进伤口愈合相关的基因在转录水平、蛋白水平的表达
原理与目的:qPCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,该 技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到 固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与第二 抗体反应,经过放射自显影和数据分析,来检测和定量电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。通过qPCR和Western Blot可以定量分析LAE在体外对成纤维细胞胶原以及血管内 皮生长因子的转录水平和蛋白水平的影响。
方法:将人成纤维细胞HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3在DMEM培养基培养至对数生长期后消化、重悬细胞,以适当的密度将细胞接种于6孔板,混匀,使细胞均匀分散;培养 细胞至适当密度,加入依照浓度梯度(10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml,0.01μg/ml)设置的含 LAE培养基使其作用于贴壁细胞,阴性对照和阳性对照组加入与LAE组等量的培养基,将6 孔板静置在37℃,含5%CO2的培养箱中培养24时后提取RNA和总蛋白。订购vegf、collagen Ⅰ、collagenⅢ和β-actin的序列引物,根据qPCR试剂说明书定量LAE对上皮成纤维细胞内胶原及血管内皮生长因子的转录水平的影响。订购CollagenⅠ、CollagenⅢ、VEGF、β-actin抗体,将提取的总蛋白定量后用5×Loading buffer稀释,进行免疫印迹试验,定量LAE在体外对成纤维细胞胶原以及血管内皮生长因子的蛋白水平的影响。
结果分析:结果如图1所示,在3T3细胞中,LAE浓度在1μg/mL时可以显著促进其基因collagenⅠ、collagenⅢ的转录水平至1.7-3倍;LAE浓度在0.1μg/mL浓度时,可以促进vegf 基因的转录约1.3倍。在HAF细胞中,LAE浓度在0.1μg/mL时可以显著促进基因collagenⅠ、 collagenⅢ的转录水平至2倍左右,促进vegf基因的转录约6.7倍。这表明,LAE可以在较 低浓度下,显著促进体外成纤维细胞中,血管内皮生长因子以及与伤口愈合相关的胶原基因 的表达。
实施例二:LAE促进成纤维细胞的体外增殖
原理与目的:伤口愈合需要受损皮肤部位的细胞增殖,而细胞克隆形成实验是用来检测 细胞增殖能力的重要技术方法之一。将具有增殖活力的贴壁细胞分散为单个细胞使其存在于 完全培养基上时,细胞能够在体外增殖并形成肉眼可见的单克隆集落。依据这种单个细胞贴 壁增殖特性,人们设计了平板克隆实验,该实验能够反映细胞是否具有群体依赖性,以及单 个细胞的增殖能力。
方法:将HAF和3T3细胞培养至对数生长期后消化、重悬,以3×103个/孔的密度将细 胞接种于6孔板,混匀。加入依照浓度梯度(10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml,0.01μg/ml,0.001 μg/ml)设置的含LAE培养基使其作用于贴壁细胞,对照组加入与LAE组等量的培养基,将 6孔板静置在37℃,含5%CO2的培养箱中培养1周左右。弃去培养基后,用4%多聚甲醛固 定数小时,加入1%浓度的结晶紫染液1ml/孔,过夜染色。洗去板内未结合的多余染液,晾 干后拍照。对克隆细胞集落数进行肉眼计数,计算最终克隆形成率。(克隆形成率=形成克隆 数目/接种细胞数目×100%;最终克隆形成率=加药组克隆形成率/空白组克隆形成率×100%)。
结果与分析:如图2所示,LAE浓度在1μg/mL和10μg/mL时都可以促进成纤维细胞3T3和HAF的克隆形成,其中,LAE浓度在1μg/mL时,可以显著提升成纤维细胞3T3和 HAF的克隆形成能力至约1.6倍。此结果表明,低浓度的LAE可以显著促进成纤维细胞的体 外克隆形成能力。
实施例三:LAE促进成纤维细胞的体外横向迁移
原理与目的:迁移是细胞的重要特性,在伤口愈合的过程中,细胞会响应微环境的刺激, 通过迁移、增殖来促进伤口愈合。当单层细胞在培养皿中达到一定密度时,用10μl灭菌枪头 制造一条宽度均匀的空白区域,即为“划痕”,划痕边缘的细胞会横向迁移,逐渐进入空白区 域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞横向迁移的过程。通过统计非增殖状态下 迁移的细胞数量,可以评价药物对细胞横向迁移能力的影响。
方法:将成纤维细胞HAF和3T3培养至对数生长期后消化、重悬吹打细胞,以适当的密 度将细胞接种于6孔板,混匀,使细胞均匀分散;待细胞贴壁后,用灭菌的10μl灭菌枪头在单层细胞上划直线;PBS清洗两遍后加入依照浓度梯度(10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml,0.01μg/ml,0.001μg/ml)设置的含LAE培养基使其作用于贴壁细胞,对照孔加入与药物组等量的培养基;于显微镜下记录划痕的初始宽度,放到细胞培养箱中继续培养24-48小时,直至加药组的划痕区内几近迁满细胞,然后在显微镜下拍照,以对照组划痕区域迁移细胞数为100, 绘制LAE处理组细胞相对于对照组的迁移数目百分比统计图。
结果与分析:结果如图3所示,在对照组中的成纤维细胞未迁满划痕空白区域内时,部 分LAE处理组的成纤维细胞已迁满划痕区。通过数据分析发现,相比于对照组,当LAE浓 度为0.01μg/ml时,体外成纤维细胞3T3和HAF的横向迁移率显著提升至1.4倍左右。此结果表明,LAE浓度为0.01μg/ml时,在体外可以显著促进成纤维细胞3T3细胞和HAF细胞 的横向迁移。
实施例四:LAE促进成纤维细胞的体外纵向迁移
原理与目的:Transwell小室是一个可以挂在24孔板上的杯状装置,底部是一层薄薄的 聚碳酸酯膜,膜上存在8.0-12.0μm的微孔,成为一种有通透性的支架,利用该通透性,使小 室内的细胞在小室下部趋化因子的吸引作用下,向孔板内移动,透过聚碳酸酯薄膜并最终附 着在薄膜的下表面,然后通过对外膜上吸附的细胞进行固定、结晶紫染色、计数统计,从而 研究LAE对细胞纵向迁移能力的促进作用。
方法:选取生长状态良好的上皮成纤维细胞。将小室悬挂在24孔板内,在Transwell实 验中,首先使用不添加FBS的培养基按照配制浓度梯度(20μg/ml,2μg/ml,0.2μg/ml,0.02 μg/ml,0.002μg/ml)的含LAE溶液300μl,与300μl含5×104个/孔细胞的细胞悬液(无血 清)混合;取出孔板上方的小室,吸取细胞和LAE混合液550μl接种到小室上层区域;使用 添加FBS的培养基,配制浓度梯度(10μg/ml,1μg/ml,0.1μg/ml,0.01μg/ml,0.001μg/ml) 的含LAE溶液,在小室相应的下方孔板内加入1ml,对照组孔内不添加LAE;将含有小室 的24孔板放在37℃,5%CO2的培养环境中培养24-48小时左右;吸弃小室内和24孔板内的培养基,PBS清洗两次,在孔板内加入400μl 4%的多聚甲醛进行固定,室温处理1小时;吸弃24孔板内的多聚甲醛固定液,加入PBS清洗2-3次;加入约1ml 1%的结晶紫染色液染色10-15分钟,回收多余染色液;用水浸泡并清洗小室,然后用棉签轻轻擦拭小室内部的染色液和未迁移到下室的细胞,自然晾干;在显微镜下拍照,统计每个Transwell小室薄膜下表 面的上、下、左、右、中,5个视野的细胞数目,计算LAE对细胞纵向迁移能力的影响。然 后横坐标设置为LAE浓度,纵坐标设置为细胞迁移率,绘制细胞迁移曲线。
结果与分析:结果如图4所示,相同处理时间内,LAE处理组的3T3和HAF细胞能够更多地迁移到薄膜的下室,其中,LAE浓度为0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml时,成纤 维细胞3T3的纵向相对迁移率显著提升至1.4-1.9倍;在1μg/ml浓度下,LAE也可以促进 HAF细胞的纵向迁移。以上结果说明,LAE可以促进成纤维细胞3T3和HAF的纵向迁移。
实施例五:LAE促进小鼠急性切除伤口的愈合
原理与目的:急性切除伤口模型是指使用剪刀或者打孔器切除小鼠背部一定面积的皮肤, 伤口愈合过程的各个阶段,包括肉芽形成、胶原沉积、再上皮化和收缩过程等,都可以在这 一模型中进行模拟和观察研究。各种局部用药的疗效测试以及一些影响愈合的外界因素的作 用分析,也都可以利用此实验模型来进行。
方法:订购雄性BALB/c小鼠36只,周龄约6周,体重约20g。腹腔麻醉小鼠,用剃毛刀脱去小鼠背部毛发。第二天,用浸泡75%乙醇的脱脂棉球擦拭小鼠背部皮肤,使用灭菌的剪刀,镊子,切除小鼠背部皮层,形成直径约0.8cm的圆形伤口,拍照后记为第0天。当天 将36只小鼠分组,分别为一组对照组和三组实验组。具体分组情况如下:(1)对照组(control组),12只,伤口局部外敷100μl Q水;(2)LAE低浓度组,12只,伤口局部外敷100μl 浓度为100μg/ml的LAE;(3)LAE高浓度组,6只,伤口局部外敷100μl浓度为200μg/ml 的LAE。分组第二天,麻醉小鼠后,对伤口拍照,记为第1天。拍照后,按照分组给药,并 用无菌的滤纸片和纱布包扎。给药频率为每2天一次(在给药第11天后停止给药)并每2天 拍摄一次伤口照片。分析伤口面积,计算伤口相对面积。伤口相对面积(%)=(当前伤口面 积/原始伤口面积)*100%。
结果与分析:结果如图5所示,随着时间的增加,各组小鼠的伤口面积均减少,伤口愈 合率增加。相比于对照组,在给药第5至第9天,不论是LAE低浓度组还是高浓度组都能显著促进伤口面积的减少;在第11天,对照组伤口相对面积约为27.2%,LAE高浓度组伤口相对面积约为15.5%;在第14天,对照组伤口仍有结痂未脱离而LAE处理组伤口处的结痂已经完全脱落,可以看见新生的皮肤。该结果表明,LAE可以有效促进小鼠急性伤口愈合,LAE高浓度组促进效果更好。
实施例六:LAE在体内促进伤口愈合相关的基因在转录水平、蛋白水平的表达
原理与目的:qPCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,该 技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到 固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物 学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与第二 抗体反应,经过放射自显影和数据分析,来检测和定量电泳分离的特异性目的基因表达的蛋 白成分。通过qPCR和Western Blot可以定量分析LAE对小鼠皮肤伤口组织处的胶原以及血 管内皮生长因子的转录水平和蛋白水平的影响。
方法:在第7天和第14天取实验组和对照组小鼠的伤口皮肤组织,使用研磨仪破碎组织 后,提取皮肤伤口组织的总蛋白和总RNA。根据qPCR试剂说明书定量LAE对小鼠皮肤组织血管内皮生长因子以及胶原等转录水平的影响;订购CollagenⅠ、CollagenⅢ、VEGF、β-actin 抗体,将提取的总蛋白定量后用5×Loading buffer稀释,进行免疫印迹试验,定量LAE对小 鼠皮肤组织血管内皮生长因子及胶原等蛋白水平的影响。
结果与分析:如图6所示,在转录水平上:LAE低浓度组和高浓度组都能显著促进小鼠 皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的转录,在第7天,LAE低浓度组能够促进小鼠皮肤伤口 组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因的转录分别为3.4倍和3.2倍,LAE高浓度组能够促进小鼠皮 肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因的转录分别为4.9倍和4.7倍;LAE高浓度组在第7天 对VEGF的转录也有显著促进作用,其促进作用约为2倍。在第14天,LAE低浓度组能够 促进小鼠皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因的转录分别为4.3倍和3.0倍,LAE高浓度 组能够促进小鼠皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因的转录分别为3.5倍和2.7倍,对 VEGF的转录无显著促进作用。在蛋白水平上:第7天结果与转录水平大体一致,LAE低浓 度组和高浓度组都能显著促进小鼠皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白沉积,LAE低浓 度组能够促进小鼠皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达分别为3.7倍和2.9倍,促 进VEGF的表达2.3倍;LAE高浓度组能够促进小鼠皮肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋 白表达分别为7.5倍和3.1倍,促进VEGF的表达2.5倍。实验结果表明,在第7天,小鼠皮 肤伤口组织的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的转录水平与蛋白水平基本一致,LAE可以显著促进胶原沉 积,胶原沉积在伤口愈合的组织修复过程中尤为重要,能够加快细胞的生长,促进细胞的粘 附增殖,促进细胞的分化,使肉芽或上皮能逐渐生长,从而加速伤口的愈合时间。在该阶段, LAE高浓度处理组的VEGF表达也有显著增加,VEGF的提高会增大血管壁的通透性,为血 管内皮细胞的迁移和血管形成提供基础,进而为伤口愈合修复提供更多的营养成分并带走代 谢物质,从而加速伤口愈合的过程。这与小鼠急性切除伤口的愈合结果一致,在一定程度上 阐明了LAE能显著促进小鼠急性切除伤口模型中伤口面积的减少的分子机制。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技 术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。
Claims (11)
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述组合物还包含药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体内和/或体外促进胶原、血管内皮生长因子的基因的转录水平和蛋白水平。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物在体内促进胶原沉积、表皮再生和/或血管的新生。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐或其组合物促进成纤维细胞的生长、迁移、增殖。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所示迁移包括纵向迁移和横向迁移。
7.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述成纤维细胞包括人成纤维细胞HAF和小鼠皮肤成纤维细胞3T3。
8.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述基因包括collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、vegf。
9.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述伤口包括急性伤口和慢性伤口。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于,所述急性伤口包括外伤引起的新鲜伤口、大面积软组织缺损、烧伤伤口、术后裸露伤口;所述慢性伤口包括手术后感染的切口、溃疡、褥疮、未经初期有效处理的外伤伤口。
11.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述月桂酰精氨酸乙酯盐酸盐在药物中的含量为0.001-200μg/ml。
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