MX2007015541A

MX2007015541A - Composiciones de colageno de placenta humana proceso para su preparacion, metodos de uso y equipos que contienen las composiciones.

Info

Publication number: MX2007015541A
Application number: MX2007015541A
Authority: MX
Inventors: Sascha Abramson; Mohit Bhatia; Kristen Labazzo; Qing Liu; Chris Lugo; Wei Wu Matcham
Original assignee: Celgene Corp
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2008-03-06
Also published as: PE20070166A1; CN101237898A; AU2006257878A1; EP1893249A2; IL187982A0; WO2006135843A3; NZ564563A; ZA200800144B; JP2008543783A; CA2610928A1; WO2006135843A2; KR20080031735A; BRPI0611739A2; US20070020225A1

Abstract

La presente invencion proporciona las composiciones que contienen colageno de placenta humana, los metodos de preparacion de las composiciones, los metodos para su uso y los equipos que contienen las composiciones. Las composiciones, los equipos y metodos son utiles, por ejemplo, para aumentar o sustituir el tejido de un mamifero.

Description

COMPOSICIONES DE COLÁGENO DE PLACENTA HUMANA, PROCESO PARA SU PREPARACIÓN, MÉTODOS DE USO Y EQUIPOS QUE CONTIENEN LAS COMPOSICIONES 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las composiciones que contiene colágeno de placenta humana, los métodos de preparación de las composiciones y los métodos para su uso . 2. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN El colágeno es una proteína que forma múltiples estructuras en el cuerpo como tendones, huesos, dientes y láminas que soportan la piel y órganos internos. El colágeno esta compuesto de tres cadenas, enrolladas en una hélice triple. La estructura surge de repeticiones de tres aminoácidos. En las hélices, cada tercer aminoácido es glicina, y muchos de los aminoácidos restantes son prolina o hidroxiprolina.

El colágeno ha sido utilizado en el comercio y en la clínica durante algún tiempo. En la actualidad, el colágeno puede utilizarse para sustituir o aumentar tejido conectivo duro o blando, como la piel, tendones, cartílago, hueso e intersticio. El colágeno sólido ha sido implantado quirúrgicamente, y las formulaciones de colágeno inyectable están disponibles ahora para administración más conveniente. En la actualidad, se dispone en el comercio de diversas composiciones de colágeno inyectable como puede ser Zyderm®, Zyplast®, Cosmoderm® y Cosmoplast®.

Cada composición de colágeno tiene propiedades físicas específicas que pueden ser ventajosas o desventajosas para su uso en técnicas específicas. De este modo, existe la necesidad en la técnica de composición de colágeno con otras propiedades físicas para extender la selección de las composiciones disponibles para los que cuenten con las habilidades en la técnica. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de composiciones de colágeno que son útiles, por ejemplo, para aumentar o sustituir tejido de un mamífero. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención muestran durabilidad y facilidad de inyección ventajosas. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención muestran durabilidad ventajosa luego de la inyección. En algunas modalidades de la invención, las composiciones de colágeno de la invención muestran baja toxicidad ventajosa. En ciertas modalidades de la invención, las composiciones de colágeno muestran propiedades reológicas ventajosas.

En un aspecto, la presente invención proporciona las composiciones que contienen colágeno reticulado. En algunas modalidades, el colágeno se retícula con el reticulador 1, -butanodiol diglicidiléter. En modalidades específicas, las composiciones de colágeno contienen el colágeno atelopéptido.

En este aspecto de la invención, el material de inicio colágeno puede ser cualquier colágeno conocido para los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, el material de inicio colágeno es un colágeno atelopéptido soluble en ácido. En modalidades particulares, el material de inicio colágeno es colágeno de placenta. En otras modalidades particulares, el material de inicio colágeno es colágeno mamífero. Un ejemplo es colágeno humano. En modalidades particulares, el colágeno es de placenta humana. El material inicial colágeno puede ser preparado de acuerdo con cualquiera de los métodos conocidos para los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, el material de inicio colágeno se prepara de acuerdo con los aspectos de la presente invención, como pueden ser aquellos descritos en detalle más adelante. El colágeno puede ser cualquier tipo de colágeno conocido para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno se enriquecen en colágenos tipo I y tipo IV. En otras modalidades, las composiciones de colágeno se reducen en colágeno tipo III. En ciertas modalidades, las composiciones de colágeno están enriquecidas en colágenos tipo I y tipo III. En otras modalidades, las composiciones de colágeno se reducen en colágeno tipo IV.

En otro aspecto, la presente invención propone los métodos de preparación de las composiciones de colágeno de la invención. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención se preparan poniendo en contacto el material de inicio colágeno con el reticulador 1, 4-butanodiol diglicidiléter en condiciones apropiadas para la formación de enlaces cruzados. En modalidades específicas, aproximadamente 4 a 1 de 1, -butanodiol diglicidiléter a colágeno se utiliza con base en el peso. En modalidades particulares, la reacción de reticulación se cataliza por un catalizador como piridina.

En otro aspecto, la presente invención propone procesos para preparar colágeno de placenta soluble en ácido. Aunque la fuente del tejido placentario puede ser cualquier mamífero, en ciertas modalidades se utiliza placenta humana. El tejido placentario puede ser de cualquier parte de la placenta que incluye en amnios, sea soluble o insoluble o ambos, el corión y el cordón umbilical o de toda la placenta. En algunas modalidades, el colágeno placentario soluble en ácido se prepara a partir de placenta humana entera luego de la separación del cordón umbilical.

En algunas modalidades, los procesos consisten en un choque osmótico del tejido placentario. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría particular de operación, se considera que el choque osmótico puede reventar las células del tejido y con ello facilitar la remoción de las células, los componentes celulares y los componentes sanguíneos. El paso del choque osmótico puede producir composiciones de colágeno de la invención con pureza ventajosa. El choque osmótico puede llevarse a cabo en cualquier condición de choque osmótico conocida para los expertos en la técnica. En las modalidades, específicas, el choque osmótico se lleva a cabo por incubación en condiciones de alta salinidad seguido por incubación en una solución de agua. Las incubaciones pueden repetirse de acuerdo con el juicio del experto en la técnica.

Luego del choque osmótico, la composición de colágeno resultante puede ser lavada en condiciones acidas. Las condiciones acidas pueden ser cualquier condición acida conocida para los expertos en la técnica. El ácido acético es un ejemplo de un ácido útil para el lavado ácido. Aunque no se pretende apegarse a ninguna teoría particular de operación, se considera que el lavado ácido puede solubilizar algunos polipéptidos mientras se precipita y facilita la eliminación de los polipéptidos de peso molecular inferior (por ejemplo 30-60 kDa) que puede contaminar la composición de colágeno.

En algunas modalidades, donde se desea colágeno atelopéptido, la composición de colágeno se pone en contacto con una enzima capaz de remover parcial o completamente atelopéptidos del colágeno. Como será evidente para los expertos en la técnica, este paso no será utilizado cuando no se desee colágeno atelopéptido. La enzima puede ser cualquier enzima proteolítica conocida para los expertos en la técnica, que sea capaz de remover atelopéptidos a partir del colágeno. En algunas modalidades, la enzima es pepsina o papaína. En general, la enzima se pone en contacto con la composición de colágeno en condiciones apropiadas para remover el telopéptido conocido para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, la enzima se pone en contacto con la composición de colágeno a temperatura elevada. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría particular de operación, se considera que la temperatura elevada puede mejorar el rendimiento de colágeno tipo I en la composición de colágeno final. En las modalidades específicas, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a 23-27°C durante un tiempo suficiente para remover el telopéptido.

En otro paso, la composición de colágeno puede ser purificada por precipitación salina. La precipitación salina puede ser cualquier precipitación salina conocida para los expertos en la técnica. Sin embargo, en algunas modalidades, la precipitación inicial con bajo contenido de sal es seguida por una precipitación con elevado contenido de sal. El colágeno deseado para las composiciones de colágeno de la invención se queda en el sobrenadante en la precipitación con bajo contenido de sal y se precipita en la precipitación con alto contenido de sal en estos métodos. En modalidades específicas, la precipitación con bajo contenido de sal es con NaCl aproximadamente 0.2 M, mientras que la precipitación con alto contenido de sal es NaCl aproximadamente 0.7 M. En cada precipitación, la composición de colágeno de la invención puede ser recuperada del sobrenadante o precipitada por las técnicas normales como la centrifugación, filtración, suspensión y concentración como será evidente para los expertos en la técnica. Cada precipitación salina puede repetirse de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica, y los precipitados pueden ser lavados según sea necesario de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica. En algunas modalidades, la composición de colágeno puede filtrarse con un filtro de peso molecular bajo para concentrar la muestra y para limpiar las endotoxinas. Por ejemplo, la composición de colágeno puede ser filtrada con un filtro de 100 kDa o un filtro de 30 kDa o ambos, para concentrar y/o eliminar endotoxinas. En algunas modalidades, la composición de colágeno puede filtrarse con un filtro de peso molecular elevado para remover los virus. Como se escribe más adelante, el filtro de peso molecular alto detiene colágeno mientras que permite que las partículas virales pasen a través. Por ejemplo, la composición de colágeno puede ser filtrada con 1000 kDa, 750 kDa o 500 kDa para remover virus como el HIV, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, herpes, parvovirus y otros contaminantes virales conocidos para los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención pueden además ser procesadas por fibrilación. La fibrilación puede llevarse a cabo por cualquier técnica para fibrilar colágeno, conocida para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, la composición de colágeno se fibrila a 3 mg/mL de colágeno, fosfato de sodio 30 mM, pH 7.2 a aproximadamente 32°C durante aproximadamente 20-24 horas.

Cuando se desee, la composición de colágeno de la invención puede ser reticulada. En algunas modalidades, la reticulación se lleva a cabo después de fibrilación.

La reticulación puede ser con cualquier reticulador conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo, en algunas modalidades, el reticulador puede ser gluraldehído, y la reticulación puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos de reticulación de glutaraldehído del colágeno conocidos para los expertos en la técnica.

En otras modalidades, el reticulador puede ser 1,4-butanodiol diglicidiléter o genipita. En modalidades particulares, el reticulador es 1, -butanodiol diglicidiléter. La reticulación puede llevarse a cabo por las técnicas evidentes para los expertos en la técnica o las descritas en la presente. En algunas modalidades, la reticulación con 1, 4-butanodiol diglicidiléter se lleva a cabo con un catalizador como piridina.

En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención puede ser reducida. La reducción puede llevarse a cabo poniendo en contacto la composición de colágeno de la invención con cualquier agente reductor conocido para los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, el agente reductor es borohidruro de sodio. En modalidades particulares, el colágeno se retícula antes de la reducción con el agente reductor.

En algunas modalidades, la composición de colágeno además puede ser procesada por cizallamiento mecánico de acuerdo con los métodos conocidos para los expertos en la técnica. Las técnicas de cizallamiento ejemplares están descritas en la Patente US No. 4,642,117, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se cizalla con un homogeneizador de tejido.

Las composiciones de colágeno que se preparan por los procesos de la invención han mostrado propiedades ventajosas. Por ejemplo, algunas composiciones de colágeno de la invención han tenido una cantidad considerable de colágeno tipo IV, en algunas modalidades, entre 2 y 13%. Además, algunas composiciones de colágeno de la invención han tenido una cantidad más pequeña de colágeno tipo III, en algunas modalidades, aproximadamente 5%. Por lo regular, el colágeno restante de las composiciones de la invención ha sido colágeno tipo I, aproximadamente 80-90% en algunas modalidades. En ciertas modalidades, la composición de colágeno de la invención contiene una cantidad considerable de carbohidrato, por ejemplo al menos 10 µg/mg de carbohidrato, con base en el peso del colágeno. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría específica de operación, se considera que la elevada concentración de carbohidratos se debe al contenido de carbohidrato del colágeno tipo IV. Por consiguiente, en algunos aspectos, la presente invención proporciona composiciones de colágeno que tienen las propiedades anteriores.

En otras modalidades, algunas composiciones de colágeno de la invención contienen entre 0 y 13% de colágeno tipo IV. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención contienen alrededor de 0-5% de colágeno tipo III. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención contienen aproximadamente 80-95% de colágeno tipo I. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención contienen más de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de colágeno tipo I. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención esta considerablemente libre de carbohidrato, por ejemplo, menos de aproximadamente 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 7.5 ó 10 µg/mg de carbohidrato, con base en el peso del colágeno.

En otro aspecto, la presente invención propone las composiciones de colágeno de la invención que además contienen ácido hialurónico. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría particular de operación, se considera que la inclusión de ácido hialurónico puede facilitar la migración de los fibroblastos hacia o a través de una composición de colágeno de la invención. La composición de colágeno que contiene ácido hialurónico puede prepararse poniendo en contacto una composición de colágeno de la invención con ácido hialurónico en condiciones apropiadas evidentes para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el colágeno de la composición se retícula. En otras modalidades, el ácido hialurónico de la composición es reticulado. En otras modalidades, el colágeno y el ácido hialurónico son reticulados. En modalidades particulares, ambos se reticulan entre sí. El reticulador puede ser cualquier reticulador apropiado conocido para los expertos en la técnica que incluye el glutaraldehído, genipina y 1,4-butanodiol diglicidiléter descrito en la presente.

En otro aspecto, la presente invención propone los métodos para aumentar o reemplazar el tejido de un mamífero mediante la administración de una composición de colágeno de la invención a un mamífero que necesite de este. En algunas modalidades, el mamífero es humano. La composición de colágeno puede ser administrada de acuerdo con cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno se administran por inyección. En algunas modalidades, las propiedades reológicas de las composiciones de colágeno son ventajosas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los equipos para administrar las composiciones de colágeno de la invención a un mamífero que necesite de éste. Los equipos por lo regular contienen una composición de colágeno de la invención en un envase conveniente para la distribución a un practicante experto en la técnica. Los equipos además pueden contener medios para administrar la composición de colágeno de la invención a un mamífero. Los medios pueden ser cualquier medio para administrar una composición de colágeno conocida para los expertos en la técnica, como puede ser una jeringa, una jeringa y aguja, una cánula, etcétera. En algunas modalidades, el medio esta prellenado con una composición de colágeno de la invención.

Como se describe antes y se muestra en detalle en las siguientes secciones, las composiciones, procesos, métodos y equipos de la invención tienen utilidad para administrar las composiciones de colágeno mamíferos que necesiten de éste. 4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 4.1 Definiciones Como se utiliza en la presente, los siguientes términos deben tener los siguientes significados: El término "colágeno" se refiere a cualquier colágeno conocido para los expertos en la técnica.

El término "colágeno atelopéptido" se refiere a una forma de colágeno, como lo reconocen los expertos en la técnica, que carece de una o más regiones telopéptido. En algunas modalidades, la región telopéptido puede ser eliminada por digestión de proteasas como está descrito con detalle más adelante.

"Biocompatibilidad" o "Biocompatible" cuando se utiliza en la presente se refiere a la propiedad de ser biológicamente compatible al no producir una respuesta tóxica, dañina o inmunológica o rechazo en tejido vivo. La respuesta corporal a los materiales desconocidos es un aspecto principal cuando se utilizan materiales artificiales en el cuerpo y por tanto la biocompatibilidad de un material es una consideración de diseño importante en estos materiales .

"No pirogénico" cuando se utiliza en la presente se refiere a un material que se ha probado y encontrado que contiene menos de o igual a 0.5 UE/mL de un pirógeno, por ejemplo, endotoxina. Una UE es aproximadamente 0.1 a 0.2 ng de endotoxina por mililitro y varíe de acuerdo con la referencia que se consulte.

El término "individuo" se refiere a los animales como mamíferos, incluido, más no limitado a, primates (por ejemplo humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En algunas modalidades, el individuo es un humano.

El término "etiqueta" se refiere a una presentación de un tema escrito, impreso o gráfico en el envase inmediato de un artículo, por ejemplo el material escrito presentado en un vial que contenga un agente farmacéutico activo.

El término "etiquetado" se refiere a todas las etiquetas y otra material escrita, impresa o gráfica en cualquier artículo o cualquiera de sus envases o envolturas o acompañando tal artículo, por ejemplo, un inserto de envase o video cintas con instrucciones DVD que acompañe o se asocie con un envase de un agente farmacéutico activo. 4.2 Modalidades de la invención La presente invención se dirige a las composiciones de colágeno, los procesos para preparar las composiciones de colágeno, los equipos que contienen las composiciones de colágeno y los métodos para su uso. 4.2.1 Composiciones de colágeno de la invención En una modalidad, la presente invención proporciona las composiciones de colágeno útiles, por ejemplo, para aumentar o reemplazar tejido de un mamífero. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención tienen propiedades ventajosas como durabilidad, facilidad de inyección y las reológicas.

En este aspecto de la invención, el colágeno puede ser cualquier colágeno conocido para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el colágeno es colágeno mamífero. En modalidades particulares, el colágeno es colágeno humano, bovino, ovino, de rata o canguro. En algunas modalidades no mamífero, el colágeno es colágeno de pescado. Aunque el colágeno puede ser de cualquiera de estas fuentes, el colágeno humano es un ejemplo particular.

El colágeno puede ser de cualquier parte de la fuente. Las fuentes útiles incluyen piel bovina, piel caprina, cola de rata, cola de canguro y piel de pescado. En modalidades particulares, el colágeno es colágeno de placenta, por ejemplo colágeno placentario bovino, colágeno placentario ovino o colágeno placentario humano. Un ejemplo es colágeno de placenta humana.

El colágeno puede ser procesado en cualquier forma conocida para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el colágeno consiste en telopéptidos. En otras modalidades, el colágeno es colágeno atelopéptido. Para el propósito de esta invención, el colágeno atelopéptido contiene una cantidad considerable de colágeno que carece de uno o ambos telopéptidos. Por ejemplo, una composición de colágeno atelopéptido puede tener por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% colágeno atelopéptido, con base en el peso del colágeno. En otras modalidades, el colágeno puede ser un colágeno fibrilar como es sabido para los expertos en la técnica. En todavía otras modalidades, el colágeno puede ser colágeno soluble en ácido como lo reconocen los expertos en la técnica. Las técnicas para preparar colágeno atelopéptido, colágeno fibrilar y colágeno soluble en ácido están descritas en las siguientes secciones .

El colágeno puede ser cualquier tipo de colágeno conocido para los expertos en la técnica o una mezcla de tales colágenos. En algunas modalidades, el colágeno está en forma de una composición de colágeno que contiene uno o más tipos de colágeno. Los colágenos particulares pueden ser colágeno tipo I, colágeno tipo II, colágeno tipo III y colágeno tipo IV. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención contiene cantidades particulares de estos colágenos. Una composición particular contiene una cantidad considerable de colágeno tipo I, mientras que también está enriquecido en colágeno tipo IV. En algunas modalidades, una composición de colágeno de la invención contiene entre 1 y 15% colágeno tipo IV, entre 2 y 3% colágeno tipo IV, entre 3 y 12% colágeno tipo IV o entre 4 y 11% colágeno tipo IV. Al mismo tiempo, la composición de colágeno puede tener por lo menos 75%, por lo menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de colágeno tipo I. Por ejemplo, la composición puede tener entre 75 y 95% de colágeno tipo I, entre 77.5 y 92.5% de colágeno tipo I o entre 80 y 90% de colágeno tipo I. Las mismas composiciones de colágeno de la invención pueden tener una cantidad de colágeno tipo III, por ejemplo hasta 1%, hasta 2%, hasta 3%, hasta 4% o hasta 5% de colágeno tipo III. En ciertas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención contienen entre 2 y 13% de colágeno tipo IV, entre 80 y 90% colágeno tipo I y hasta 5% colágeno tipo III. En ciertas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención contienen entre 0 y 13% de colágeno tipo IV, entre 80 y 95* colágeno tipo I y hasta 5% colágeno tipo III.

En ciertas modalidades, una composición de colágeno de la invención contiene una cantidad considerable de carbohidrato, por ejemplo, por lo menos, 10, 15, 20 ó 25 µg/mg de carbohidrato, con base en el peso del colágeno. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría particular de operación, se considera que la concentración alta de carbohidratos se debe al contenido de carbohidrato del colágeno tipo IV.

Estas composiciones de colágeno de la invención pueden obtenerse por cualquier proceso evidente para los expertos en la técnica. Los procesos particulares están descritos con detalle en las secciones siguientes.

Como se describe antes, las composiciones de colágeno de este aspecto de la invención están reticuladas. El reticulador puede ser cualquier reticulador conocido para los expertos en la técnica. Un reticulador particular para este aspecto de la invención es un alquil diol o alquil poliol de acuerdo con la siguiente estructura: RJ -CH2—O— [—X- -CH2—R —] n en donde X es un alquilo de Ci-Cß (lineal o ramificado) y R 1 y R2 son cada uno independientemente hidrógeno o grupos reactivos, y en donde n es un entero desde 1 hasta 100. En modalidades particulares, el reticulador es un reticulador multifuncional. En algunas modalidades, n es 1 y el reticulador es un reticulador bifuncional. En algunas modalidades cada R 1 y R2 es independientemente epóxido o aldehido. En ciertas modalidades, por lo menos uno R 1 ó R2 es epóxido. En ciertas modalidades, el reticulador es glicerol poliglicidil éter (EX-313 EC) o poliglicerol poliglicidiléter (EX-512 EC) .

En algunas modalidades, X es alquilo de C4 lineal y R 1 y R2 son cada uno epóxido, es decir, el reticulador es 1, 4-butanodiol diglicidiléter 1, 4-butanodiol diglicidiléter Otros reticuladores ejemplares y los métodos de su uso para reticular colágeno están descritos en las Patentes US Nos. 5,880,242 y 6,117,979 y en Zeeman y col., 2000, J. Biomed Ma ter Res . 51 (4): 541-8, van Wachem y col., 2000, J Biomed Ma ter Res . 53 (1): 18-27, van Wachem y col., 1999, J. Biomed Mater Res . 47 (2): 270-7, Zeeman y col., 1999, J. Bi omed Mater Res . 46 (3): 424-33, Zeeman y col., 1999, Bi omaterial s 20 (10): 921-31, el contenido de las cuales se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades. En las modalidades particulares, el reticulador se utiliza para reticular colágeno atelopéptido soluble en ácido a partir de cualquier fuente. En las modalidades particulares, el colágeno atelopéptido soluble en ácido es de placenta humana .

La reticulación puede llevarse a cabo por cualquier método evidente para los expertos en la técnica, por ejemplo, por los métodos descritos en las referencias anteriores o de acuerdo con los métodos que se describen en la presente. En algunas modalidades, se utiliza desde cerca de 0.1:10 a 10:0.1 de 1, 4-butanodiol diglicidiléter en relación con la cantidad de colágeno con base en el peso. En algunas modalidades la relación es 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 o 10:1. En algunas modalidades, la relación es 4:1 BDDE : colágeno con base en el peso. En modalidades particulares, la reacción de reticulación se cataliza por un catalizador como piridina, como se describe en la presente.

En otras modalidades, las composiciones de colágeno de la invención se reticulan con genipina. La genipina es un agente reticulador no tóxico que se encuentra en estado natural. Se puede obtener a partir de su compuesto precursor, genipósido, que puede ser aislado del fruto de Gardenia jasminoides . La genipina puede obtenerse en el comercio de Challenge Bioproducts Co., Ltd. 7 Alley 25, Lañe 63, TzuCHinag St. 494 Taichung Taiwan R.O.C., Tel: 886-4-3600852. El uso de genipina como reactivo reticulador está descrito extensamente en la Solicitud de Patente US Publicación No. 20030049301, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad.

En otras modalidades, la composición de colágeno puede ser reticulada con otros reticuladores conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición de colágeno de la invención puede ser reticulada con glutaraldehído de acuerdo con los métodos conocidos para los expertos en la técnica. Estos métodos están descritos extensamente, por ejemplo, en las Patentes US Nos. 4,852,640, 5,428,022, 5,660,692 y 5,008,116 y en McPherson y col., 1986, J. Biomedical Materials Res . 20: 79-92, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad.

En otras modalidades, la composición de colágeno puede ser reticulada con cualquier técnica de reticulación mediada por enzimas conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, la composición de colágeno de la invención puede ser reticulada mediante transglutaminasa de acuerdo con los métodos conocidos para los expertos en la técnica. La transglutaminasa cataliza la formación de enlaces cruzados amida entre residuos de glutamina y glicina del colágeno. Estos métodos están descritos, por ejemplo, en Orban y col., 2004, J. Biomedical Materials Res . 68 (4) : 756-62, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad.

Las composiciones de colágeno de la invención pueden ser reticuladas con un solo reticulador o con una mezcla de reticuladores. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención contiene colágeno de placenta humana soluble en ácido reticulado con 1, 4-butanodiol diglicidiléter. En las modalidades particulares, el colágeno es colágeno atelopéptido.

En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención además pueden contener ácido hialurónico. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría particular de operación, se considera que la inclusión de ácido hialurónico puede facilitar la migración de fibroblastos hacia o a través de una composición de colágeno de la invención. La composición de colágeno que contiene ácido hialurónico puede prepararse poniendo en contacto una composición de colágeno de la invención con ácido hialurónico en condiciones apropiadas evidentes para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el colágeno de la composición es reticulado. En otras modalidades, el ácido hialurónico de la composición se retícula. En otras modalidades el colágeno y ácido hialurónico son reticulados. En modalidades particulares, ambos son reticulados entre sí. El reticulador puede ser cualquier reticulador apropiado conocido para los expertos en la técnica e incluye glutaraldehído, genipina y 1, -butanodiol diglicidiléter descrito en la presente.

En ciertas modalidades, las composiciones que contienen ácido hialurónico pueden tener desde 0.1:99.9 a 99.9:0.1 de ácido hialurónico: colágeno con base en peso/peso. En ciertas modalidades, la relación es 0.1:99.9, 1:99, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 99:1 ó 99.9:0.1. Las composiciones de colágeno que contienen ácido hialurónico no reticulado y los procesos para su preparación, están descritos extensamente en las Patentes US Nos. 4,803,075 y 5,137,875, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades. La reticulación puede llevarse a cabo por las técnicas conocidas para los expertos en la técnica y las descritas en las presente. 4.3 Procesos para la preparación de las composiciones de colágeno de la invención En otro aspecto, la presente invención propone los procesos para preparar las composiciones de colágeno de la invención. Los procesos son útiles, por ejemplo, para preparar las composiciones de colágeno de la invención antes descritas.

En ciertas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención se preparan a partir de placenta humana de acuerdo con los métodos que se describen en la presente. Los pasos iniciales de preparación de las composiciones de colágeno a partir de placenta humana están descritos con detalle en las Patentes US NO. 5,428,022, 5,660,692 y 5,008,116, y en la Solicitud de la Patente US Publicaciones Nos. 20040048796 y 20030187515, el contenido de las cuales se incorpora en la presente para referencia en sus totalidades.

El tejido placentario puede ser de cualquier parte de la placenta incluido el amnios, sea soluble o insoluble o ambos, el corión, el cordón umbilical o de toda la placenta. En algunas modalidades, el colágeno placentario soluble en ácido se prepara a partir de la placenta humana entera sin el cordón umbilical.

El saco placentario está compuesto de dos capas íntimamente conectadas por tejido conectivo suelto. Estas son conocidas como las capas amniótica y coriónica. La capa amniótica es la más interna de las dos capas y entra en contacto con el fluido amniótico que rodea el feto y juntos forman el saco amniótico. La capa amniótica es avascular y está revestida por epitelio columnal sencillo superponiendo una membrana basal y mide 30-60 micrones de espesor. La membrana coriónica es la capa externa del saco y esta densamente celularizada. El árbol vascular se origina en la placenta y se extiende a las membranas placentarias a través de la capa coriónica. La capa coriónica se separa de la capa amniótica por tejido conectivo suelto y se combina, las dos capas miden 120-180 micrones. Las membranas placentarias tienen una matriz de colágeno que está densamente cargada con mucopolisacáridos y se cree que sirven principalmente como saco protector para el desarrollo del feto. Las membranas también mantienen una barrera para agentes infecciosos o e inmunológicos presentes en la circulación materna. Las membranas placentarias tienen transportes activo y pasivo. La mayor parte de las moléculas pequeñas y proteínas pueden viajar libremente a través de estas pero las proteínas grandes como IgM no pueden atravesar la capa basal .

En una modalidad particular, la placenta para uso en los métodos de la invención se toma tan pronto como es posible después del parto de un recién nacido. En todavía otra modalidad particular, la placenta se toma inmediatamente después del parto por cesárea de un recién nacido sano normal. Ventajosamente, la placenta puede ser recolectada en condiciones asépticas. En algunas modalidades, la placenta se almacena durante 48 horas desde el momento del parto antes de cualquier otro tratamiento. En otras modalidades, la placenta se almacena durante hasta 5 días desde el momento del parto previo a cualquier otro tratamiento.

Ventajosamente, la placenta, el cordón umbilical y la sangre del cordón umbilical pueden ser transportados desde la sala de partos a otro lugar, por ejemplo un laboratorio, para otro procesamiento. La placenta puede ser transportada en un dispositivo de transporte estéril como puede ser una bolsa estéril o un envase, el cual esté opcionalmente aislado térmicamente. En algunas modalidades, la placenta se almacena a temperatura ambiente hasta otro tratamiento. En otras modalidades, la placenta se refrigera hasta otro tratamiento, es decir, se almacena a una temperatura de aproximadamente 2° a 8°C. En todavía otras modalidades, la placenta se almacena en condiciones estériles durante hasta 5 días antes de otro tratamiento. En una modalidad particular, la placenta se maneja y procesa en condiciones asépticas, como es sabido para los expertos en la técnica. El laboratorio puede estar equipado con sistema de filtración HEPA (como se define por las clasificación de cuarto limpio, con una clase 1000 o mejor) . En una modalidad particular, el sistema de filtración HEPA se enciende por lo menos una hora antes de utilizar el cuarto de laboratorio para llevar a cabo los métodos de la invención.

En algunas modalidades se saca la sangre de la placenta, es decir, se drena completamente de la sangre del cordón que queda después del nacimiento. En algunas modalidades, se elimina la sangre de la placenta un 70%, un 80%, 90%, 95%, 99%.

La invención comprende el tamizaje de la madre gestante antes del momento del nacimiento, utilizando las técnicas normalizadas conocidas para los expertos, para enfermedades comunicables que incluyen, más no se limitan a, VIH, VHV, VHC, VHTL, sífilis, VCM y otros patógenos virales conocidos por contaminar el tejido placentario. Ventajosamente, los métodos pueden utilizarse para tamizar una enfermedad comunicable siguiendo las reglamentaciones establecidas por la Administración Federal de Medicamentos . La madre gestante puede ser tamizada (por ejemplo una muestra de sangre se toma para propósitos de diagnóstico) durante un mes del nacimiento, particularmente en el transcurso de dos semanas del nacimiento, dentro de una semana de nacimiento o en el momento del nacimiento. Solo los tejidos recolectados de donadores cuyas madres dieron prueba negativa o no reactiva a los patógenos antes mencionados se utilizan para producir una composición de colágeno de la invención. Ventajosamente es posible obtener un historial completo paterno y médico y social del donador de la membrana placentaria, incluido por ejemplo el historial familiar detallado.

En algunas modalidades, el donador es tamizado utilizando pruebas sexológicas y bacteriológicas normalizadas conocidas para un experto en la técnica. Cualquier ensayo o prueba diagnóstica que identifique el patógeno o los patógenos está dentro del alcance del método de la invención, pero los ensayos particulares son aquellos que combinan alta exactitud con la capacidad de alto rendimiento. En una modalidad específica, la invención comprende el tamizaje del donador utilizando las técnicas normalizadas conocidas para un experto en la técnica para antígenos y/o anticuerpos. Un ejemplo no limitativo de los antígenos anticuerpos incluye: tamizaje de anticuerpos (ATY) ; tamizaje de alanina amino transferasa (ALT) ; anticuerpo núcleo de hepatitis (ácido nucleico y ELISA) ; antígeno de superficie de hepatitis B; anticuerpo contra el virus de hepatitis C; VIH-1 y VIH-2; VHTL-1 y VHTL-2; prueba de sífilis (RPR); prueba de anticuerpo VCM; prueba de hepatitis C y VIH. Los ensayos que se utilizan pueden ser ensayos basados en ácidos nucleicos o ensayos basados en ELISA como es sabido para los expertos en la técnica.

La invención comprende además analizar la sangre del cordón umbilical del recién nacido utilizando las técnicas normalizadas conocidas para un experto en la técnica (ver por ejemplo Cotorruelo y col., 2002, Clin . Lab. 48 (6): 271-81; Maine y col., 2001, Expert Rev. Mol . Diagn . , 1 (1): 19-29; Nielsen et al., 1987, J. Clin . Microbiol . 25 (8): 1406-10; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad) . En una modalidad, la sangre del cordón umbilical del recién nacido se analiza para patógenos bacterianos (que incluye, más no se limita a, bacterias gram positivas y gram negativas) y hongos utilizando las técnicas normalizadas conocidas para un experto en la técnica. En una modalidad específica, se determina el tiempo de sangre y el factor RH de la sangre del cordón umbilical del recién nacido utilizando las técnicas normalizadas bien conocidas para los expertos. En otra modalidad, se obtiene CBC con diferencial a partir de la sangre del cordón umbilical del recién nacido utilizando los métodos normalizados conocidos para un experto en la técnica. En todavía otra modalidad, se toma el cultivo bacteriano aeróbico de la sangre del cordón umbilical del recién nacido, utilizando los métodos normalizados conocidos para los expertos en la técnica. Solo los tejidos recolectados de los donadores que tiene un CBC dentro de un limite normal (por ejemplo anormalidad no bruta o derivación del nivel normal) , prueba de negativa para serología y bacteriología, y prueba negativa o no reactiva para enfermedades infecciosas y contaminación se utilizan para producir una composición de colágeno de la invención.

Una vez que se obtiene el tejido placentario humano, éste puede ser tratado de acuerdo con los siguientes pasos para preparar una composición de colágeno de la invención. Aunque los siguientes pasos se presentan en orden sucesivo, un experto en la técnica se dará cuenta que el orden de varios pasos puede ser intercambiado sin exceder el alcance de la invención. Además, varios pasos están indicados como optativos, dependiendo del tipo de composición de colágeno deseada de la invención. Se supone que las técnicas fácilmente evidentes para los expertos en la técnica como intercambio de amortiguador, precipitación, centrifugación, resuspensión, dilución y concentración de la composición de proteína no necesitan ser explicadas en detalle. Una preparación ejemplar se describe en los ejemplos siguientes.

Cualquier porción de la placenta, o la placenta entera, puede utilizarse en los procesos de la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno se preparan a partir de la placenta entera. Sin embargo, en algunas modalidades, las composiciones de colágeno pueden obtenerse de porciones coriónica o amniótica de la placenta.

En estas modalidades, la invención consiste en procesar la membrana placentaria para que se separe el cordón umbilical del disco placentario, y la separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica. En una modalidad particular, la membrana amniótica se separa de la membrana coriónica antes de cortar la membrana placentaria. La separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica puede hacerse comenzando desde el borde de la membrana placentaria. En otra modalidad, la membrana amniótica se separa de la membrana coriónica utilizando disección roma, por ejemplo, con los dedos enguantados. Luego de la separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica y el disco placentario, se corta el fragmento del cordón umbilical, por ejemplo, con tijeras, y se desprende del disco placentario. En algunas modalidades, cuando no es posible la separación de las membranas amniótica y coriónica sin rasgar el tejido, la invención consiste en cortar las membranas amniótica y coriónica del disco placentario como una pieza y luego desprenderlas.

La membrana amniótica, la membrana coriónica y la placenta entera pueden ser almacenadas antes de su uso en los procesos de la invención. Las técnicas de almacenamiento serán evidentes para un experto en la técnica. Las técnicas de almacenamiento ejemplares están descritas en la Solicitud de la Patente US Publicaciones Nos. 20040048796 y 20030187515, el contenido de las cuales se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades.

En los procesos de la invención, el tejido placentario es decelularizado. El tejido placentario puede ser decelularizado de acuerdo con cualquier técnica conocida para el experto en la materia, como pueden ser las descritas con detalle en las Solicitudes de Patente US Publicaciones Nos. 20040048796, y 20030187515, el contenido de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, el tejido placentario se somete a un choque osmótico. El paso del choque osmótico puede producir composiciones de colágeno de la invención con pureza ventajosa. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría específica de operación, se considera que el choque osmótico puede romper células del tejido y con ello facilitar la separación de las células, los componentes celulares y los componentes sanguíneos. El choque osmótico puede ser además del paso de clarificación o puede ser el único paso de clarificación de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica.

El choque osmótico puede llevarse a cabo en cualquiera de las condiciones de choque osmótico conocidas para el experto en la técnica. Tales condiciones pueden ser incubar el tejido en soluciones de elevado potencial osmótico, o de bajo potencial osmótico o de potencial osmótico alto y bajo alternantes. La solución de elevado potencial osmótico puede ser cualquier solución de elevado potencial osmótico conocido para el experto en la técnica, como puede ser una solución que contenga uno o más de los siguientes: NaCl (por ejemplo 0.2 -1.0 M) KCl (por ejemplo 0.2-1.0 ó 2.0 M) , Sulfato de amonio, un monosacárido, un disacárido (por ejemplo sacarosa al 20%) , un polímero hidrófilo (por ejemplo polietilenglicol), glicerol, etcétera. En algunas modalidades, la solución con elevado potencial osmótico es una solución de cloruro de sodio. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl por lo menos 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 2 M ó 2.5 M. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es aproximadamente 0.25-5 M alrededor de 0.5-4 M, alrededor de 0.75-3 M o alrededor de 1.0-2.0 M de NaCl.

La solución de potencial osmótico bajo puede ser cualquier solución de potencial osmótico bajo conocida para el experto en la técnica, como agua, por ejemplo agua deionizada de acuerdo con cualquier método conocido para el experto.

En algunas modalidades, el choque osmótico es en una solución de cloruro de sodio seguida por una solución de agua. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl al menos 0.5 M. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl por lo menos 0.75 M. en algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl por lo menos 1.0 M. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl por lo menos 1.5 M. En algunas modalidades, la solución de cloruro de sodio es NaCl por lo menos 2.0 M. En ciertas modalidades, un lavado con NaCl 0.5 M es seguido por lavado con agua. En algunas modalidades, dos lavados con NaCl 0.5 M son seguidos por un lavado de agua. En algunas modalidades, un lavado con NaCl 2 M es seguido por un lavado con agua.

Estas secuencias pueden repetirse de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica.

En algunas modalidades, la composición de colágeno que resulta del choque osmótico puede ser incubada en condiciones básicas. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría de operación particular, se considera que un lavado básico puede eliminar partículas virales que podrían contaminar la composición de colágeno. Las condiciones básicas pueden ser cualquiera de las condiciones básicas conocidas para los expertos en la técnica. En particular, cualquier base en a cualquier pH conocido para eliminar partículas virales puede utilizarse. Las bases particulares para el lavado básico incluyen bases biocompatibles, bases volátiles y bases conocidas para los expertos en la técnica que sean fácil y seguramente removidas de la composición de colágeno. La base puede ser cualquier base orgánica o inorgánica conocida para los expertos en la técnica en una concentración de, por ejemplo, 0.2-1.0 M. En algunas modalidades, el lavado básico se lleva a cabo en solución de hidróxido de sodio. La solución de hidróxido de sodio puede ser NaOH 0.1 M, NaOH 0.25 M, NaOH 0.5 M o NaOH 1 M. En modalidades particulares, el lavado básico se lleva a cabo en NaOH 0.1 M o 0.5 M.

En algunas modalidades, la composición de colágeno que resulta de choque osmótico puede ser incubada por condiciones acidas. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría de operación particular, se considera que el lavado ácido puede precipitar y/o facilitar la eliminación de los polipéptidos de peso molecular bajo que podrían contaminar la composición de colágeno. Las condiciones acidas pueden ser cualquier condición ácido conocida para el experto en la técnica. En particular, les posible utilizar cualquier ácido a cualquier pH conocido para precipitar proteínas de peso molecular bajo contaminantes. Los ácidos particulares para el lavado ácido son ácidos biocompatibles, ácidos volátiles, y ácidos conocidos para el experto en la técnica para que sean fácil y seguramente removidos de la composición de colágeno. El ácido puede ser cualquier ácido orgánico o inorgánico conocido para los expertos en la técnica como el ácido fórmico, ácido cítrico, ácido clorhídrico o ácido acético o una concentración de, por ejemplo, 0.2-1.0 M. En algunas modalidades, el lavado ácido se lleva a cabo en ácido acético 0.5 M.

El lavado ácido puede llevarse a cabo a cualquier temperatura de acuerdo con el criterio de los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el lavado ácido se lleva a cabo a aproximadamente 0-30°C, aproximadamente 5-25° 5-25° alrededor de 5-20°C o aproximadamente 5-15°C. En algunas modalidades, el lavado ácido se lleva a cabo a aproximadamente 0°C aproximadamente 5°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 25°C, o alrededor de 30°C. En modalidades particulares, el lavado ácido se lleva a cabo a aproximadamente 5-15°C.

El lavado ácido puede llevarse a cabo durante un tiempo adecuado de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. En algunas modalidades, el lavado ácido puede llevarse a cabo durante aproximadamente 1-24 horas, alrededor de 2-20 horas, alrededor de 5-15 horas, alrededor de 8-12 horas o alrededor de 2-5 horas. Cuando se desee, en la solución del lavado ácido puede adicionarse una enzima, como pepsina o papaína. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría de operación particular, se observa que la pepsina en el lavado ácido puede reducir las impurezas de la composición de colágeno. La pepsina puede estar en la solución del lavado ácido en una cantidad de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. En algunas modalidades, en la solución del lavado ácido se encuentra aproximadamente 0.1 g aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 1.0 g, aproximadamente 2.0 g o aproximadamente 5.0 g de pepsina/kg de placenta congelada. En otras modalidades, en la solución del lavado ácido se encuentra aproximadamente 0.1 g, aproximadamente 0.5 g, aproximadamente 1.0 g, alrededor de 2.0 g o alrededor de 5.0 g de pepsina/placenta. En ciertas modalidades, en la solución de lavado ácido se encuentra aproximadamente 0.1-2.0 g/L, aproximadamente 0.2-1.5 g/L o aproximadamente 0.5-1.0 g/L de pepsina. En algunas modalidades, en la solución del lavado ácido se encuentra aproximadamente 0.1 g/L, aproximadamente 0.2 g/L, aproximadamente 0.5 g/L alrededor de 1.0 g/L o aproximadamente 2.0 g/L de pepsina. En modalidades particulares, aproximadamente 0.5 g/L de pepsina esta en la solución del lavado ácido a aproximadamente 5°C-15°C durante aproximadamente 2-5 horas. En modalidades particulares, aproximadamente 0.5 g/L de pepsina esta en la solución de lavado ácido a aproximadamente 5°C-6°C durante aproximadamente 18-24 horas.

En ciertas modalidades donde se desea colágeno atelopéptido, la composición de colágeno se pone en contacto con una enzima capaz de remover parcial o completamente los telopéptidos del colágeno. Como será evidente para los expertos en la técnica, este paso no será utilizando cuando no se desee colágeno atelopéptido. La enzima puede ser cualquier enzima conocida para el experto en la técnica, que sea capaz de remover los telopéptidos del colágeno. En ciertas modalidades, la enzima es pepsina o papaína. Los métodos de tratamiento de composiciones de colágeno con enzimas para eliminar telopéptidos están descritos con detalle en las Patentes US Nos. 4,511,653, 4,582,640, 5,436,135 y 6,548,077, los contenidos de los cuales se incorporan por este medio para referencia en sus totalidades. En general, la enzima se pone en contacto con la composición de colágeno en condiciones apropiadas para la eliminación del telopéptido conocidas para los expertos en la técnica. Estas condiciones pueden ser, por ejemplo, poner en contacto la enzima con la composición de colágeno en pH apropiado. En la concentración apropiada de la enzima, en un volumen apropiado de una solución, a temperatura apropiada y durante un tiempo adecuado.

La composición de colágeno puede ponerse en contacto con la enzima en condiciones de pH bajo de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a pH de aproximadamente 1-3 o aproximadamente 2-3.

En ciertas modalidades, la enzima se pone en contacto con la composición de colágeno a temperatura elevada. Aunque no se pretende apegarse a alguna teoría de operación particular, se considera que la temperatura elevada puede mejorar el rendimiento del colágeno tipo I en la composición final de colágeno. En algunas modalidades, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a aproximadamente 15-40°C, aproximadamente 20-35°, aproximadamente 25-30°C, alrededor de 20-30°, alrededor de 20-30° o aproximadamente 23-27°C. En modalidades particulares, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a aproximadamente 23-27°C durante un tiempo suficiente para eliminar el telopéptido.

La composición de colágeno se pone en contacto con la enzima durante un tiempo suficiente para eliminar el telopéptido de acuerdo con el criterio de los expertos en la técnica. En algunas modalidades, el colágeno se pone en contacto con pepsina durante por lo menos 5, 10, 15, 20, 25, ó 30 horas. En ciertas modalidades, la [lacuna] se pone en contacto con pepsina durante aproximadamente 5-30 horas, aproximadamente 10-25 horas o aproximadamente 20-25 horas. En ciertas modalidades, la [lacuna] se pone en contacto con pepsina durante aproximadamente 8, 16, 24 ó 32 horas.

La composición de colágeno se pone en contacto con la enzima en una cantidad apropiada para eliminar telopéptido de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. En algunas modalidades, aproximadamente 0.1 g, 0.5 g, 1.0 g, 2.0 g o 5.0 g de pepsina/kg de placenta congelada se pone en contacto con la composición de colágeno. En otras modalidades, aproximadamente 0.1 g, 0.5 g, 1.0 g, 2.0 g o 5.0 g de pepsina/placenta se pone en contacto con la composición de colágeno. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se pone en contacto con aproximadamente 0.1-10.0 g/L, aproximadamente 0.5-5 g/L [sic], aproximadamente 1-2.5 g/L o aproximadamente 0.5-1.5 g/L de pepsina. En algunas modalidades, la composición de colágeno se pone En contacto con aproximadamenteO.1 g/L, aproximadamente 0.2 g/L, aproximadamente 0.5 g/L, aproximadamente 1.0 g/L, aproximadamente 2.0 g/L, 5 g/L o 10 g/L de pepsina. En las modalidades particulares, la composición de colágeno se pone en contacto con aproximadamente 0.5-1.0 g/L de pepsina en solución de ácido acético con pH de aproximadamente 2-3, a aproximadamente 23°C-27°C durante aproximadamente 16-24 horas.

La composición de colágeno se pone en contacto con la enzima en una solución apropiada volumen: placenta para eliminar telopéptidos de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. Se observa que una relación alta volumen a placenta puede llevar al máximo el efecto por la pepsina. En ciertas modalidades se utiliza aproximadamente 1, 2, 4 u ocho volúmenes de solución de ácido acético por placenta. En modalidades particulares, se utiliza aproximadamente 2 volúmenes de solución ácido acético por placenta.

En otro paso, la composición de colágeno se purifica por precipitación salina. La precipitación salina puede ser cualquier precipitación salina conocida para el experto en la técnica. La sal puede ser, por ejemplo, sulfato de amonio, KCl, NaCl o cualquier otra sal conocida para el experto en la técnica por ser útil para la precipitación de proteínas. La sal puede ser adicionada a la composición de colágeno por cualquier técnica conocida para los expertos en la materia. Por ejemplo, la sal puede ser adicionada a la composición de colágeno en forma de una solución salina líquida concentrada hasta que se obtenga una concentración deseada. En algunas modalidades, una precipitación salina baja inicial es seguida por una precipitación salina alta. El colágeno deseado para las composiciones de colágeno de la invención permanece en el sobrenadante en la precipitación salina baja y se precipita en la precipitación salina alta en estos métodos. En modalidades particulares, la precipitación salina baja es NaCl aproximadamente 0.2 M, mientras que la precipitación salina alta es NaCl aproximadamente 0.7 M. en ciertas modalidades, se utiliza una precipitación salina alta para purificar la composición de colágeno. En ciertas modalidades, la precipitación salina alta es NaCl a aproximadamente 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M ó 1.0 M. En modalidades particulares, la precipitación salina alta es NaCl a aproximadamente 0.7 M. En cada precipitación, la composición de colágeno de la invención puede ser recuperada del sobrenadante o precipitada por las técnicas normalizadas como centrifugación, filtración, resuspensión y concentración como será evidente para los expertos en la técnica. Cada precipitación salina puede ser repetida de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica, y los precipitados pueden ser lavados según sea necesario de acuerdo con el criterio de un experto en la técnica. Cualquier precipitado resultante puede ser disuelto o resuspendido, por ejemplo en condiciones acidas.

En algunas modalidades, la composición de colágeno puede ser purificada por cromatografía. La cromatografía puede ser cualquier cromatografía conocida para los expertos en la técnica. La cromatografía puede ser, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o de tamaño o de cualquier otra cromatografía conocida para el experto en la técnica que sea útil para la purificación de proteínas. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se purifica por cromatografía de intercambio iónico. En algunas modalidades, un medio de intercambio aniónico y/o absorción puede unir las proteínas impurezas y un medio intercambio catiónico puede unir el colágeno. El colágeno puede ser luego recuperado, por ejemplo, por elusión selectiva por una solución salina. Como puede ser solución de cloruro de sodio.

En algunas modalidades, la composición de colágeno puede ser filtrada con un filtro de peso molecular bajo para concentrar la muestra y para limpiar endotoxinas. Por ejemplo, la composición de colágeno puede ser filtrada con un filtro de 100 kDa o un filtro de 30 kDa o ambos, para concentrar y/o eliminar endotoxinas. En algunas modalidades, la composición de colágeno puede ser filtrada con un filtro de peso molecular elevado para eliminar virus. Por ejemplo, la composición de colágeno puede ser filtrada con 1000 kDa, 700 kDa o 500 kDa para eliminar virus como HIV, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, herpes, parvovirus y otros contaminantes virales no deseados por el experto en la técnica. Estos métodos están descritos con detalle más adelante. Si se desea, las composiciones de colágeno además pueden ser procesadas por fibrilación. La fibrilación puede llevarse a cabo por cualquier técnica para fibrilar colágeno conocida para el experto en la técnica. En algunas modalidades, la composición de colágeno se fibrila a 3-3.5 mg/mL de colágeno fosfato de sodio 30 mM, pH 7.2, aproximadamente 32°C durante aproximadamente 20-24 horas. La fibrilación de las composiciones de colágeno se describe ampliamente en las Patentes US Nos. 4,511,653, 4,582,640 y 5,436,135, el contenido de las cuales se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades. Si es necesario, la composición de colágeno puede ser concentrada de acuerdo con las técnicas normalizadas antes de la fibrilación. Como una opción, la composición de colágeno puede ser lavada una o más veces, por ejemplo en Na2P04, 20 mM, pH 7.4, NaCl 130 mM.

Donde se desee, las composiciones de colágeno de la invención pueden ser reticuladas. En algunas modalidades, la composición de colágeno se fibrila antes de la reticulación. La reticulación puede ser con cualquier reticulador conocido para el experto en la materia, por ejemplo, los reticuladores descritos en la sección anterior. En algunas modalidades, el reticulador puede ser glutaraldehído, y la reticulación puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos de reticulación de colágeno con glutaraldehído conocidos para los expertos en la materia. En otras modalidades, el reticulador puede ser 1, 4-butanodiol diglicidiléter o genipina. En modalidades particulares, el reticulador es 1,4-butanodiol diglicidiléter.

La reticulación puede llevarse cabo por las técnicas evidentes para los expertos en la materia o las descritas en la presente. En algunas modalidades, se utiliza aproximadamente 0.1:10 a 10:0.1 de 1, 4-butanodiol diglicidiléter en relación con la cantidad de colágeno con base en el peso. En ciertas modalidades la relación es 1:10, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 ó 10:1. En ciertas modalidades, la relación es 4:1 BDDE: colágeno con base en el peso. Para la reticulación es posible utilizar las técnicas normalizadas, por ejemplo incubación con BDE a 25°C durante aproximadamente 24 horas o hasta que el pH de la solución llegue a 10.0 a 10.5.

Aunque la reticulación puede proceder sin adición de un catalizador, en algunas modalidades el uso de un catalizador puede acelerar ventajosamente la reacción. Es posible utilizar cualquier catalizador conocido para un experto en la técnica a fin de favorecer la reacción entre un grupo reactivo en el reticulador, como puede ser un grupo epoxi o un grupo aldehido, y uno funcional en el colágeno, como puede ser un grupo amino, carboxilo o hidroxilo. Catalizadores como estos pueden ser ácidos de Lewis y base de Lewis. Los ejemplos pueden ser aminas terciarias: trietilamina, piridina, 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano, (DABCO) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) . El catalizador también puede ser una base inorgánica como hidróxido de sodio o potasio. Otros compuestos, como sales organoborato tetrasustituidas también son aplicables, como puede ser bromuro de etil trifenil fosfonio. En modalidades particulares, la reacción de reticulación se cataliza por un catalizador como piridina.

En algunas modalidades, un enlace covalente entre un reticulador y un colágeno puede reducirse, por ejemplo, para mejorar la estabilidad. La reducción se puede llevar a cabo poniendo en contacto la composición de colágeno de la invención con cualquier agente reductor conocido para los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, el agente reducto es boro hidruro de sodio, bisulfito de sodio, ß-mercaptoetanol, ácido mercaptoacético, mercaptoetilamina, bencilmercaptano, tiocresol, ditiotreitol o una fosfina como tributilfosfina. El borohidruro de sodio es un ejemplo útil. En algunas modalidades, el colágeno es reticulado antes de la reducción con el agente reductor. La reducción de las composiciones de colágeno y las composiciones de colágeno reticulado esta descrito ampliamente en las Patentes US Nos. 4,185,011, 4,597,769, 5,412,076 y 5,763,579, el contenido de las cuales se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades.

En algunas modalidades, donde desea una composición que contenga colágeno y ácido hialurónico, la composición de colágeno puede prepararse poniendo en contacto el colágeno con ácido hialurónico de acuerdo con alguna técnica conocida para el experto en la materia. Las técnicas para preparar composiciones de colágeno que además contienen ácido hialurónico sin reticulación están descritas ampliamente en las Patentes US Nos. 4,803,075 y 5,137,875, el contenido de las cuales se incorpora por este medio para referencia en sus totalidades. Si se desea reticulación, la reticulación puede llevarse a cabo de acuerdo con los métodos que se describen en la presente. En algunas modalidades, el colágeno se retícula antes del contacto con el ácido hialurónico. En otras modalidades, el ácido hialurónico se retícula antes del contacto con el colágeno. En algunas modalidades, el colágeno y el ácido hialurónico se retícula antes del contacto entre sí. En algunas modalidades, el colágeno y el ácido hialurónico se ponen en contacto y luego se reticulan en la misma composición. Cualquiera de estas composiciones puede además ser reducida de acuerdo con los métodos descritos en la presente como será evidente para los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, la composición de colágeno además puede ser procesada por cizallamiento mecánico de acuerdo con los métodos conocidos para el experto en la técnica. Las técnicas de cizallamiento ejemplares están descritas en la Patente US No. 4,642,117, el contenido de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, la composición de colágeno se cizalla con un homogeneizador de tejido conocido para los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, se pueden tomar pasos para limitar la actividad proteasa en las composiciones de colágeno de la invención. Aditivos como queladores de iones metálicos, por ejemplo 1, 10-fenantrolina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) , crean un ambiente desfavorable para muchas de las enzimas proteolíticas. Si se proporcionan las composiciones subóptimas para proteasas como colagenasa puede llevar en la protección de las composiciones de colágeno contra degradación. Las condiciones subóptimas para proteasas pueden lograrse formulando las composiciones para eliminar o limitar la cantidad de iones calcio y zinc disponibles en solución. Muchas proteasas son activas en presencia de iones calcio y zinc y pierden mucha de su actividad en entornos libres de iones calcio y zinc. Ventajosamente, una composición de colágeno se preparará seleccionando las condiciones de pH, disponibilidad reducida de iones calcio y zinc, presencia de quemadores de iones metálicos y el uso de inhibidores proteolíticos específicos para colagenasa. Por ejemplo, una composición de colágeno puede tener una solución amortiguada de agua, pH 5.5 a 8, o pH 7 a 8, libre de iones calcio y zinc y que incluya un quelador de iones metálicos como EDTA. Además, el control de parámetros de temperatura y tiempo durante el tratamiento de una composición de colágeno también puede emplearse para limitar la actividad de las proteasas. 4.4. Caracterización de la composición de colágeno 4.4.1 Caracterización bioquímica Para determinar las composiciones bioquímicas de las composiciones de colágeno de la invención es posible utilizar los ensayos bioquímicos conocidos en la técnica y ejemplificados en la presente. La invención comprende los ensayos bioquímicos para determinar el contenido total de proteína de una muestra, como por ejemplo los ensayos basados en absorbancia y ensayos basados en colorimetría. Los ensayos basados en absorbancia pueden ser, más no se limitan a, los ensayos que miden la absorbancia a 280 nm (ver, por ejemplo, Layne, E, Spetrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins, Methods in Enzymology 3: 447-455 (1957); Stoscheck, CM, Quantiation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990); las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades), 205 nm y ensayos basados en el coeficiente de excitación de la muestra (ver, por ejemplo Scopes, RK, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); Stoscheck, CM. Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1900); las cuales se incorporan en la presente para referencia en sus totalidades) . La invención comprende los métodos para determinar el contenido total de la proteína específica en las composiciones de colágeno de la invención que incluyen, más no se limitan a, colágeno (por ejemplo colágeno tipo I, tipo III, tipo IV), laminina, elastina, fibronectina y glucosalina glucano.

Los ensayos basados en colorimetría incluyen, más no se limitan a, el ensayo Lowry modificado, el ensayo de biuret, el ensayo de Bradford, el ensayo del ácido bicinconínico (Smith) (ver, por ejemplo, Stoschek, CM, Quantitation of Protein, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990) ) .

En una modalidad específica, la medición del contenido de proteína total de una composición de colágeno de la invención utilizando el ensayo de unión al colorante de Bradford (Bradford, M., Analytical Biochemistry, 72, 248 (1976), la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . Un ensayo Bradoford ejemplar para uso en los métodos de la invención puede consistir en lo siguiente: el ensayo puede llevarse a cabo utilizando el ensayo de unión al colorante Bradford disponible a través de BIO-RAD, Basedmond, CA, EUA. El ensayo de proteína se basa en el cambio de color de colorante Azul Brillante de Coomasie R-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteína. El ensayo consiste en preparar una curva de calibración patrón midiendo la absorbancia (a 595 nanómetros) de una serie de patrones de colágeno humano de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de prueba, por ejemplo, la muestra de la membrana amniótica, se determina respecto a la curva patrón. El ensayo se desarrolla en un formato normal que sigue la medición de la concentración de colágeno en el intervalo de 0.2-1.4 mg/mL y como un microensayo que mide la concentración de proteína hasta 25 µg. para el ensayo del patrón, el colágeno disuelto en ácido cítrico 100 mM (pH 2.4) se toma en alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL en concentraciones de 0.1-1 mg/mL en un volumen total de 0.1 L. A cada tubo se adiciona 1 mL del colorante Azul de Coomasie. Las muestras se agitan con vórtice y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se mide la absorbancia a 595 nanómetros (nm) . Para el microensayo, el colágeno disuelto en ácido cítrico 100 mM (pH 2.4) se toma en alícuotas en pozos de una placa de 96 pozos en un volumen total de 0.1 mL (2.5-30 µg/mL). A cada pozo se adiciona 10 µL de reactivo de color. Las muestras se agitan con vórtice, se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de medir la absorbancia en un lector de placas a 595 nm. Para una composición de colágeno de la invención, las muestras a prueba pueden ser ensayadas por triplicado. Se determinan las concentraciones de la proteína haciendo referencia a la curva patrón. La concentración de proteínas se calcula se como porcentaje del peso seco total de la membrana. Dentro de un margen de error de aproximadamente 10%, el contenido de proteína en cada una de las membranas es esencialmente 95% o más del peso seco total de la membrana. El contenido de agua puede ser bajo y dentro del error experimental (aproximadamente 10%) .

La estimación del contenido de colágeno total de las composiciones de colágeno de la invención se puede caracterizan utilizando los métodos conocidos para un experto en la técnica y ejemplificados en la presente. En una modalidad específica, el contenido de colágeno de una composición de colágeno de la invención se mide utilizando un kit de ensayo basado en colorante cuantitativo (SIRCOL) fabricado por Biocolor Ltd, UK. El ensayo utiliza Rojo Sirius (o Direct Red 80) como un colorante de unión a colágeno, específico. El colorante unido a colágeno muestra un aumento que depende de la concentración en la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro UV-vis. El ensayo consiste en preparar una curva de calibración patrón midiendo las absorbancias de una serie de patrones de colágeno bovino de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de prueba, por ejemplo, muestra de membrana amniótica, se determina haciendo referencia a la curva patrón. En un ensayo ejemplar, el colágeno (1 mg/mL) se toma en alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL en concentraciones desde 5-100 µg/100 µL. los volúmenes de muestra se ajustan a 100 µL con agua. A cada muestra se adiciona 1 mL de reactivo colorante SIRCOL a temperatura ambiente. Los tubos de muestra se tapan y se dejan en incubación a temperatura ambiente con agitación mecánica durante 30 mm [sic] . Luego las muestras se centrifugan a 12,000 X g durante 15 minutos y se drena el líquido utilizando un pipeteador. El precipitado rojizo en la base de cada tubo se disuelve en 1 mL de NaOH (hidróxido de sodio) . 0.5 M. La absorbancia UV para las muestras se mide a 540 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman DU-7400 UV-VIS. La curva de calibración patrón se gráfica utilizando la concentración de colágeno en cada muestra contra la absorbancia (DO) a 540 nm. Para determinar el error experimental, se repite el ensayo (n = 10) a una sola concentración baja del patrón de colágeno (10 µg/100 µL) . La muestra de la membrana se ensaya utilizando el mismo protocolo. Adicionando la muestra en un volumen total de 100 µL.

En todavía otras modalidades, para determinar los tipos de colágeno de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos normalizados conocidos en la técnica y ejemplificados en la presente, puede emplearse, por ejemplo, el ensayo ELISA. Un ensayo ejemplar para determinar los tipos de colágeno, por ejemplo, colágenos tipos I, III y IV, en una composición de colágeno de la invención consiste en utilizar un ensayo ELISA sandwich proporcionado, por ejemplo como un equipo de Ant rogen-CIA Collagen-I de Chondrex Inc., Redmond, WA, EUA. Para los estudios tipo III y tipo IV, los anticuerpos primarios (anticuerpo de captura) y secundarios (anticuerpo de detección) y patrones de colágeno pueden obtenerse de Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA. El anticuerpo de detección es un colágeno humano biotinilado tipo I, III ó IV, el cual se une a estreptavidina peroxidasa. La reacción enzimática con un sustrato cromogénico y urea y H2O2 da un color amarillo, el cual se detecta por espectroscopia UV-Vis a 490 nm. Para cuantificar la cantidad del tipo de colágeno, se prepara una curva de calibración patrón con una muestra de una serie de patrones de colágeno humano de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de prueba de membrana amniótica se determina haciendo referencia a la curva patrón. Los protocolos de ensayo se preparan de acuerdo con las recomendaciones del equipo ELISA. Para preparar una curva de calibración patrón, 10-12 pozos de una placa de 96 pozos se recubren con el anticuerpo de captura (anticuerpo anticolágeno humano tipo I, no conjugados) mediante la adición de 100 µL de un anticuerpo de captura diluido 100 X proporcionado con el equipo. Después de la incubación durante la noche, los pozos se lavan con tres veces con un búfer de lavado para eliminar el anticuerpo no unido. El colágeno humano tipo I entonces se adiciona a los pozos en concentración creciente desde 0-5 µg/mL en un volumen de 100 mL. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, se lavan los pozos con el búfer de lavado tres veces para eliminar el colágeno no unido. El anticuerpo biotinilado Collagen-I luego se adiciona al complejo anticuerpo-colágeno en los pozos en un volumen de 100 mL y se deja unir a temperatura ambiente durante 2 horas. El anticuerpo no unido se lava con tres lavados con búfer de lavado. La enzima de detección estreptavidina peroxidasa entonces se une al complejo anticuerpo-colágeno-anticuerpo por adición de una muestra diluida 200 X de la enzima provista con el equipo y dejándola incubar a temperatura ambiente durante una hora. La placa de 96 pozos se lava en repetidas ocasiones (seis veces) para eliminar la enzima no unida.

El sustrato cromogénico + urea/H2?2 se adiciona a cada uno de los pozos en un volumen de 100 µL. se deja proceder la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se termina la reacción mediante la adición de 50 µL de ácido sulfúrico 2.5 N. Se mide la absorbancia a 490 nm.

En todavía otras modalidades, la invención comprende ensayos para determinar el contenido de elastina total de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos conocidos en la técnica que se ejemplifican en la presente. Un ensayo ejemplar para medir el contenido de elastina de una composición de colágeno de la invención puede comprender un equipo de ensayo basado en colorante cuantitativo (FASTIN) fabricado por Biocolor, LTd., Reino Unido. El ensayo utiliza 5, 10,15, 20-tetrafenil-21,23-porfirina, (TPPS) como colorante de unión a elastina específico (ver, por ejemplo, Winkleman, J. (1962), Cáncer Research, 22, 589-596, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad) . El colorante unido a elastina muestra un aumento dependiente de la concentración en la absorbancia a 513 nm en un espectrofotómetro UV-Vis. El ensayo consiste en preparar una curva de calibración patrón midiendo las absorbancias de una serie de patrones de elastina bovina de concentraciones conocidas. La concentración de elastina en una muestra de prueba, por ejemplo, la muestra de la membrana amniótica, se determina haciendo la referencia a la curva patrón. La elastina (1 mg/mL) se toma en alícuota en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL en concentraciones desde 5-100 µg/mL. Los volúmenes de la muestra se ajustan a 100 µL con agua. A cada muestra se adiciona 1 mL de reactivo de precipitación de elastina (ácido tricloroacético + arginina) a 4°C y se almacena durante la noche a la misma temperatura. Luego del paso de precipitación durante la noche, las muestras se centrifugan a 12,000 x g durante 15 minutos y se drena el líquido utilizando un pipeteador. A cada muestra se adiciona un reactivo colorante FASTIN (TPPS) con 100 µL de sulfato de amonio saturado 90%. Los tubos de muestra se tapan y se dejan en incubación a temperatura ambiente con agitación mecánica durante una hora. El sulfato de amonio sirve para precipitar el complejo elastina-colorante. Después del paso de mezclado de una hora, las muestras se centrifugan a 12000 x g durante 15 minutos y se drena el líquido utilizando un pipeteador. El precipitado café en la base de cada tubo se disuelve en 1 mL de reactivo de disociación FASTIN el cual es una solución de guanidina HCl en I-propanol. La absorbancia UV para las muestras se mide a 513 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman DU- 7400 UV-VIS. La curva de calibración patrón se gráfica utilizando la concentración de elastina en cada muestra con la absorbancia (DO) a 513 nm. Para determinar el error experimental en el ensayo, el ensayo se repite (n = 10) a una sola concentración baja del patrón de elastina (10 µg/100 µL) . La muestra de membrana se ensaya utilizando el mismo protocolo, adicionando la muestra en un volumen total de 100 µL. Cada muestra se ensaya por triplicado.

En todavía otras modalidades, la invención comprende los ensayos para determinar el contenido de glucosaminoglucano (GAG) total de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos conocidos en la técnica y que se ejemplifican en la presente. La presencia de GAG en una composición de colágeno de la invención puede medirse utilizando un equipo de ensayo basado en colorante cuantitativo (BLYSCAN) fabricado por Biocolor Ltd, RU. En el ensayo se utiliza azul de 1,9-dimetilmetileno como colorante de unión a GAG específico. El colorante unido a GAG presenta un aumento dependiente de la concentración en la absorbancia a 656 nm en un espectrofotómetro UV-Vis. El ensayo consiste en preparar una curva de calibración patrón midiendo las absorbancias de una serie de patrones GAG bovino de concentraciones conocidas. La concentración de GAG en la muestra de prueba de la membrana amniótica se determina haciendo referencia a la curva patrón. El GAG bovino (0.1 mg/mL) se toma en alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL en concentraciones desde 0.5-5 µg/100 µL. Los volúmenes de muestra se ajustan a 100 µL con agua. A cada muestra se adiciona 1 mL del reactivo colorante 1,9-dimetilmetileno [sic] a temperatura ambiente. Los tubos de muestra se tapan y se dejan en incubación a temperatura ambiente con agitación mecánica durante 30 minutos. Luego se centrifugan las muestra a 12 000 x g durante 15 minutos y se drena el líquido utilizando un pipeteador. El precipitado rojizo en la base de cada tubo se disolvió en 1 mL de un reactivo de disociación del colorante. La absorbancia UV para las muestras se mide a 656 nm utilizando un espectrofotómetro Beckman DU-7400 UV-Vis. La curva de calibración patrón se gráfica utilizando la concentración de GAG en cada muestra contra la absorbancia (DO) a 540 nm. Para determinar el error experimental del ensayo, se repite el ensayo (n = 8) a una sola concentración baja del patrón GAG (1 µg/100 µL) . Se ensaya la muestra de membrana utilizando el mismo protocolo, adicionando la muestra en un volumen total de 100 µL. cada muestra se ensaya por triplicado.

En todavía otras modalidades, la invención comprende ensayos para determinar el contenido de laminina total de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos conocidos en la técnica y que se ejemplifican en la presente. Un ensayo ejemplar para determinar el contenido de laminina total en una composición de colágeno de la invención puede consistir en lo siguiente: un ensayo ELISA sandwich proporcionado como un equipo de Takara Bio Inc., Shiga, Japón (# de Cat. MKI07 puede utilizarse) . El equipo incluye una placa de 96 pozos pre-recubierta con el anticuerpo de captura primario el cual es un anticuerpo monoclonal murino para laminina humana. Los anticuerpos secundarios (anticuerpos de detección) y los patrones de laminina humana se proporcionan con el equipo. El anticuerpo de detección es un anticuerpo laminina humana conjugado con peroxidasa. La reacción enzimática con un sustrato cromogénico tetrametilbencidina y H2O2 da un color azul que se detecta por espectroscopia UV-Vis a 450 nm. Para cuantificar la cantidad de laminina se prepara una curva de calibración patrón con una muestra de una serie de patrones de laminina humana de concentraciones conocidas (proporcionado con el equipo) . La concentración de laminina en una muestra de prueba de membrana amniótica se determina haciendo referencia a la curva patrón. Se preparan protocolos de ensayo de acuerdo con las recomendaciones del equipo ELISA. Para desarrollar una curva de calibración patrón, el patrón laminina humana se adiciona en concentraciones crecientes de 5 ng/mL a 160 ng/mL en un volumen final de 100 µL a pozos individuales de una bandeja de 96 pozos previamente recubierta de anticuerpo proporcionada con el equipo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los pozos se lavan con el búfer de lavado tres veces (PBS con un contenido de 0.05% Tween) para eliminar la laminina no unida. El anticuerpo laminina conjugado a peroxidasa entonces se adiciona al complejo anticuerpo-laminina en los pozos en un volumen de 100 µL y se deja unir a temperatura ambiente durante una hora. La placa de 96 pozos se lava en repetidas ocasiones (4 X) para eliminar el conjugado enzima/anticuerpo no unido. El sustrato cromogénico + H202 se adiciona a cada uno de los pozos en un volumen de 100 µL . la reacción se deja proceder durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se determina la reacción por adición de 100 µL de ácido sulfúrico 2.5 N. Se mide la absorbancia a 450 nm. Las muestras de la membrana solubilizada se prueban en una concentración de 1000 ng/mL. Cada muestra de membrana se prueba por triplicado. La concentración de laminina se presenta como una concentración del peso de la membrana total como se muestra más adelante.

En todavía otras modalidades, la invención comprende ensayos para determinar el contenido de fibronectina total de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos conocidos en la técnica y que se ejemplifican en la presente. Un ensayo ejemplar para determinar el contenido de fibronectina total de una composición de colágeno de la invención puede consistir en lo siguiente: un ensayo ELISA sandwich proporcionado como un equipo de Takara Bio Inc., Shiga, Japón (# de Cat. MK115) puede utilizarse. El equipo incluye una placa de 96 pozos pre-recubierta con el anticuerpo de captura primario, un anticuerpo monoclonal murino para fibronectina humana. Los anticuerpos secundarios (anticuerpos de detección) y los patrones de fibronectina humana se proporcionan con el equipo. El anticuerpo de detección es un anticuerpo fibronectina humana conjugada con peroxidasa de rábano. La reacción enzimática con un sustrato cromogénico tetrametilbencidina y H2O2 da un color azul el cual se detecta por espectroscopia UV-Vis a 450 nm. Para cuantificar la cantidad de fibronectina se prepara una curva de calibración patrón con una muestra de una serie de patrones de fibronectina humana de concentraciones conocidas (proporcionadas con el equipo) . La concentración de fibronectina en una muestra de prueba se determina haciendo referencia a la curva patrón. Se preparan protocolos de ensayo de acuerdo con las recomendaciones del equipo ELISA. Para desarrollar una curva de calibración patrón, se adiciona el patrón de fibronectina humana en concentraciones crecientes de 12.5 ng/mL a 400 ng/mL en un volumen final de 100 µL a pozos individuales de una bandeja de 96 pozos previamente recubierta de anticuerpo proporcionada con el equipo. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, los pozos se lavan con el búfer de lavado tres veces (PBS con un contenido de 0.05% de Tween) para eliminar la fibronectina no unida. El anticuerpo fibronectina conjugado a peroxidasa entonces se adiciona al complejo anticuerpo-fibronectina en los pozos en un volumen de 100 µL y se deja unir a temperatura ambiente durante una hora. Para eliminar el conjugado enzima/anticuerpo no unido la placa de 96 pozos se lava en repetidas veces (4 X) . Se adiciona el sustrato cromogénico + H202 a cada uno de los pozos en un volumen de 100 µL. Se deja proceder la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se termina por adición de 100 µL de ácido sulfúrico 2.5 N. Se mide la absorbancia a 450 nm. Las muestras de la membrana solubilizada se prueban en una concentración de 1000 µg/mL. Cada muestra de membrana se prueba por triplicado. 4.4.2 Estudios de biocompatibilidad La composición de colágeno de la invención es de origen biológico y contiene cantidades significativas de colágeno. No obstante, a diferencia de colágeno obtenido de fuentes animales (bovino y porcino) el colágeno humano es no inmunogénico. Debido a que el tejido humano no inmunogénico es inherentemente biocompatible con otro tejido humano, no es necesario realizar algunas de las pruebas de biocompatibilidad normalizadas (por ejemplo, irritación dérmica y sensibilización, toxicidad sistémica aguda) . La invención comprende los ensayos para determinar la biocompatibilidad de la composición de colágeno de la invención, biocompatibilidad cuando se utiliza en la presente se refiere a la propiedad de ser biológicamente compatible al no producir una respuesta toxica. Dañina o inmunológica o rechazo en tejido vivo. La respuesta corporal a los materiales desconocidos es un problema principal cuando se utilizan materiales artificiales en el cuerpo y por tanto la biocompatibilidad de un material es una consideración de diseño importante en tales materiales. Los ensayos de biocompatibilidad comprendidos dentro de la invención incluyen, más no se limitan a, ensayos de citotoxicidad, pruebas de irritación en el ojo de conejo, ensayos de hemolisis y ensayos de pirogenicidad. Los ensayos de biocompatibilidad de la invención son ensayos basados en células o no basados en células.

En todavía otra modalidad específica, la citotoxicidad de la composición de colágeno de la invención se determina utilizando una prueba de elusión ISO MEM (Ejemplo 6.4.2.2). El propósito de este estudio es evaluar la capacidad de la composición de colágeno para desencadenar una respuesta citotóxica en fibroblastocitos de ratón en cultivo. En un ensayo ejemplar, para extraer las muestras de prueba se utiliza Medio Esencial Mínimo de Eagle (E-MEM) suplementado con 5% suero bovino fetal (FBS) . El medio también es suplementado con uno o más de los siguiente: L-glutamina, HEPES, gentamicina, penicilina, vancomicina y anfotericina B (fungizone) . Los cultivos de células L-929 (fibroblastos de ratón) son crecidos si se utilizan como monocapas en un equipo de laboratorio desechable para cultivo de tejido a 37 ± 1°C en una atmósfera humidificada de 5 ± 1% dióxido de carbono en aire. Las muestras experimentales son extraídas intactas utilizando una relación equivalente de 120 cm de muestra y 20 mL de E-MEM más 5% FBS. Las muestras experimentales se extraen en E-MEM más 5% FBS a 37 ± l°C en 5 ± l% dióxido de carbono durante 24-25 horas. Después del tiempo de extracción, el medio de cultivo de mantenimiento se retira de los pozos de cultivo experimental y se sustituye con 1 mL del medio de prueba/extracto y medio control/extracto y los medios control positivo adicionados con cloruro de cadmio. Los controles positivo, intermedio y negativo se corren en paralelo con las muestras experimentales. El medio de prueba/extracto y el medio control/extracto y los medios control positivo adicionados con cloruro de cadmio se siembran por triplicado y se incuban 72 ± 4 horas a 37 ± 1°C en una atmósfera humidificada de 5 ± 1% de dióxido de carbono en aire. Se evalúa los efectos citotóxicos de los cultivos por observación microscópica en periodos de incubación de 24, 48 y 72 ± 4 horas. Los criterios para evaluar la citotoxicidad incluirán cambios morfológicos en las células, como puede ser granulación, crenación o redondeo o pérdida de células viables de la monocapa por lisis o desprendimiento. La valides de la prueba requiere que los cultivos control negativo mantengan una apariencia normal saludable durante la prueba. Los granos de toxicidad se registran como sigue: 0 Ninguna Granulos intracitoplásmicos pequeños sin lisis celular. 1 Leve No más de 20% de células son redondas, unidas sueltas y sin granulos intracitoplásmicos; se presenta células lisadas ocasionales. 2 Ligero No más de 50% de las células son redondas y desprovistas de granulos intracitoplásmicos; sin lisis celular extensa y áreas vacías entre las células. 3 Moderado No más de 70% de las capas celulares contienen células redondas y/o están lisadas. 4 Grave Casi completa destrucción de las capas celulares.

De acuerdo con la USP, los artículos de prueba con puntuación "0", "1" ó "2" serán considerados no tóxicos.

Los artículos de prueba con puntuación "3" ó "4" serán considerados tóxicos. La muestra control positivo debe tener un registro de "3" ó "4" y la muestra control negativo debe tener un registro de "0" para una prueba válida.

Se sabe que la superficie ocular del conejo es más sensible que la piel humana, por tanto, se utilizan estudios de irritación del ojo del conejo para evaluar la biocompatibilidad de una composición de colágeno de la invención. En un ensayo ejemplar, las muestras son tamizadas para irritación ocular primaria. La membrana amniótica se limpia utilizando una solución acuosa de la sal de sodio del monohidrato del ácido desoxicólico al 0.05% (D-Cell) . La prueba puede practicarse de acuerdo con los lineamientos de las reglamentaciones de la Ley Federal de Sustancias Riesgosas (FHSA, de Federal Hazardous Substances Act), 16 CFR 1500. En un ensayo ejemplar, se considera que los ojos control son clínicamente normales para conejos por examen a simple vista con una fuente de luz auxiliar. Para detectar alguna lesión córnea preexistente, los ojos son tratados con tinción de fluoresceína, se lavan con solución salina fisiológica (PSS) , USP al 0.9% y se observan con luz ultravioleta en cuarto oscuro. Se instila una muestra en el saco conjuntival inferior de un ojo de cada conejo de acuerdo con las técnicas normalizadas. El ojo contrario de cada conejo permanece no tratado y sirve como el control comparativo. Los animales son regresados a sus jaulas luego del tratamiento. A las 24, 48 y 72 horas después de la dosificación, se examina el ojo experimental de cada conejo con una fuente de luz auxiliar y amplificación apropiada en comparación con el ojo control no tratado, y se gradúa para irritación ocular. Para detectar o confirmar lesión cornial, los ojos experimentales son tratados con tinción de fluoresceína, se lavan PSS y se examina en condiciones de oscuridad con una lámpara ultravioleta a las 24 horas. Se registran las reacciones de acuerdo con los criterios de puntaje Draize modificados FHSA. Uno de los tres animales que presente una reacción positiva significativa es un hallazgo límite. Dos de tres animales que presenten una reacción positiva significativa es una respuesta positiva significativa y se considera que el artículo experimental es un irritante.

La invención comprende la determinación de las propiedades hemolíticas de una composición de colágeno de la invención utilizando los métodos conocidos en la técnica y que se ejemplifican en la presente (ver el Ejemplo 6.4.2.4). La hemolisis describe las propiedades hemolíticas de una muestra experimental que hará contacto con la sangre. Se considera como una prueba de tamizaje especialmente significativa a realizar porque mide la fragilidad de la membrana de las células sanguíneas rojas en contacto con los materiales y dispositivos. En un ensayo ejemplar, el procedimiento consiste en exponer el material experimental a una suspensión de células sanguíneas y luego determinar la cantidad de hemoglobina liberada. La prueba se corre en condiciones estáticas con contacto directo de la muestra experimental con la sangre humana. La cantidad de hemoglobina liberada por las células sanguíneas rojas se mide espectrofotométricamente a 540 nm (luego de la conversión a cianomethemoglobina) concurrentemente con los controles negativo y positivo. El índice hemolítico para las muestras y los controles se calcula como sigue: índice hemolítico = hemoglobina liberada (mg/mL) x 100 Hemoglobina presente (mg/mL) donde: hemoglobina liberada (mg/mL) = (constante + X coeficiente) x densidad óptica por 16. Hemoglobina presente (mg/mL) = sangre diluida 10 ± 1 mg/mL.

La invención comprende los métodos para la determinación de la pirogenicidad de las composiciones de colágeno de la invención utilizando los métodos que se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente (ver el ejemplo 6.4.2.5) . En una modalidad, la pirogenicidad de las composiciones de colágeno de la invención se determina midiendo la presencia de endotoxina bacteriana en la composición de colágeno de la invención utilizando por ejemplo la prueba del Lisado de Amebocito de Limulus (LAL) . Esta prueba es un ensayo in vitro para la detección y cuantificación en la endotoxina bacteriana en una prueba ejemplar, 98 muestras de la composición de colágeno (n =1 x lote) , cada una midiendo 1 x 2 cm, se analizan individualmente para extracción. Las extracciones se hacen lavando cada muestra en 30 mL del líquido para extracción durante 40 a 60 minutos a 37 a 40°C con agitación intermitente en un agitador orbital. El pH de cada extracto muestra es entre 6 y 8 según se verifica con papel pH. Los niveles de pirógeno se miden por una prueba Colorimétrica turbidimétrica cinética. Con una sensibilidad de prueba de 0.05 unidades de endotoxinas (UE) por mL. El nivel de endotoxina total por muestra se calcula multiplicando el valor de la endotoxina detectada (UE/mL) por 30 mL (volumen de extracción por dispositivo) y de nuevo por 24 (para simular un dispositivo de tamaño de 6 x 8 cm) . 4.4.3 Estudios microbiológicos La invención comprende los métodos que se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente para determinar la presencia de organismos microbiológicos que pueden ser, pero no se limitan a, Escherichia Coli, Klebsiella pneumoniae, Staphilococcus aureus, Enterococus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphyloccus viridans y Pseudomonas aeruginosa en una composición de colágeno de la invención. Métodos como estos pueden utilizarse en cualquier paso de la preparación de la composición de colágeno. Un proceso ejemplar para los estudios microbiológicos durante el procesamiento consiste en lo siguiente: Analizar muestras microbiológicamente "adicionadas" de la membrana amniótica no procesada y el equipo que se utiliza durante el procesamiento. Las muestras se sumergen durante 5 minutos en salina adicionada con 8 microorganismos como sigue para conservar a propósito la muestra: 1. Escherichia Coli 5. Candida albicans 2. Klebsiella pneumaniae 6. Proteus vulgaris 3. Staphylococcus aureus 7. Staphylococcus viridians 4. Enterococcus faecalis 8. Pseudomonas euroginosa Ventajosamente, los métodos de decelurización y enjuague de la invención pueden reducir el numero de microorganismos en la composición de colágeno de la invención.

La invención comprende los métodos que se conocen en la técnica y se ejemplifican en la presente para determinar la biocarga de las composiciones de colágeno de la invención. Como se utiliza en la presente, "biocarga" es una medida de los organismos contaminantes que se encuentran en una cantidad determinada de material antes de que este sufra un proceso de esterilización industrial. En un método ejemplar se determina la dosis de radiación mínima de ases de electrones que obtendría esterilidad con un Nivel de Garantía de Esterilización de 10.6. Se extraen las membranas por inmersión y agitación manual utilizando solución de Peptona-Tween®. El método de plaqueo es la filtración a través de membrana utilizando agar digerido de soya-caseína. Las placas en condiciones aeróbicas se incuban cuatro días a 30-35°C después de enumeradas. Para hongos, las placas se incuban durante 4 días a 20-25°C después de enumeradas. Para bacterias formadoras de esporas, la porción del extracto recibe un choque térmico, se filtra y plaquea como para bacterias aeróbicas. Las placas se incuban cuatro días a 30.35°C, después de enumeradas para bacterias anaeróbicas, las placas fueron incubadas en condiciones anaeróbicas durante 4 días a 30-35°C después de enumeradas. Los microorganismos utilizados son Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus atrophaeus .

En modalidades particulares, las composiciones de colágeno de la invención tienen menos de dos unidades formadoras de colonias (ufe) para aerobios y hongos, menos de 1, o cero ufe para aerobios y hongos. En todavía otras modalidades, las composiciones de colágeno de la invención tienen menos de 5.1 unidades formadoras de colonias (ufe) , menos de 2 o menos de 1 ufe para anaerobios y esporas.

En modalidades particulares, la composición de colágeno de la invención no es bacteriostática o fungistática como se determina utilizando los métodos que se ejemplifican en la presente y son conocidos para un experto en la técnica (ver el Ejemplo 6.4.3.2). Cuando se utiliza en la presente, bacteriostático se refiere a un agente que inhibe el crecimiento o reproducción bacteriano pero no mata bacterias. Cuando se utiliza en la presente, fungistáticos, se refiere a un agente que impide el crecimiento de hongos por la presencia de agentes químicos o físicos no fungicidas. 4.4.4. Almacenamiento y manejo de la composición de colágeno La invención comprende el almacenamiento de la composición de colágeno de la invención a temperatura ambiente (por ejemplo 25°C) . En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención puede ser almacenada a una temperatura de por lo menos 0°C, por lo menos 4°C, por lo menos 10°C, por lo menos 15°C, por lo menos 20°C, por lo menos 25°C, por lo menos 30°C, por lo menos 35°C, o por lo menos 40°C. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención no se refrigera. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención puede ser refrigerada a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C. En otras modalidades, la composición de colágeno de la invención puede ser almacenada en cualquiera de las temperaturas antes identificadas durante un tiempo prolongado. En una modalidad particular, la composición de colágeno de la invención se almacena en condiciones estériles y no oxidantes. En algunas modalidades, la composición de colágeno que se produce de acuerdo con los métodos de la invención puede almacenarse en cualquiera de las temperaturas especificadas durante 12 meses o más sin alteración en la integridad bioquímica o estructural (por ejemplo, sin degradación) , sin alguna alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas de la composición de colágeno. En algunas modalidades, la composición de colágeno que se produce de conformidad con los métodos de la invención puede almacenarse durante varios años sin alteración de la integridad bioquímica o estructural (por ejemplo sin degradación) , sin alguna alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas de la composición de colágeno. En ciertas modalidades, se espera que la composición de colágeno de la invención preparada de acuerdo con los métodos de la invención dure indefinidamente. La composición de colágeno puede almacenarse en cualquier envase apropiado para almacenamiento a largo plazo. Ventajosamente, la composición de colágeno de la invención puede ser almacenada en un envase Peel-pouch doble, estéril. 4.4.5 Esterilización Las composiciones de colágeno de la invención pueden ser esterilizadas de acuerdo con las técnicas conocidas para los expertos en la materia para esterilizar tales composiciones. En algunas modalidades, las composiciones de la invención se filtran a través de filtros apropiados para producir composiciones esterilizadas, seguido por el tratamiento en condiciones asépticas. Los filtros útiles incluyen filtros de 0.22 µm y 0.1 µm, y otros filtros reconocidos por los expertos en la esterilización.

Además, en algunas modalidades de la invención, una composición de colágeno se filtra para eliminar virus y/o endotoxinas. En algunas modalidades, una composición de colágeno de la invención se filtra de acuerdo con las técnicas normalizadas. En otras modalidades, la composición de colágeno puede filtrarse para eliminar virus y/o endotoxinas de acuerdo con las técnicas que se proporcionan en la presente.

En algunas modalidades, la composición de colágeno se filtra a través de un filtro que permite el paso de endotoxinas y retenga la composición de colágeno. Es posible utilizar cualquier filtro de tamaño, por ejemplo 30 kDa, conocido para los expertos en la materia de filtración de endotoxinas. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se pone en contacto con el filtro en condiciones que permitan a las endotoxinas pasar a través del filtro reteniendo una composición de colágeno. Las condiciones pueden ser cualquier condición para filtración conocida para los expertos en la materia, por ejemplo, centrifugación o bombeo. El filtro debe ser de un tamaño que retenga colágeno permitiendo a las endotoxinas pasar el filtro. En algunas modalidades, el filtro es entre 5 kDa y 100 kDa. En modalidades particulares, el filtro es de aproximadamente 5 kDa, a aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 15 kDa, a aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa, aproximadamente 40 kDa, aproximadamente 50 kDa, aproximadamente 60 kDa aproximadamente 70 kDa, aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 90 kDa ó aproximadamente 100 kDa. El filtro puede ser de cualquier material conocido para el experto en la materia que sea compatible con una composición de colágeno como celulosa, poliéter sulfona y otros evidentes para los expertos. La filtración puede repetirse tantas veces como desee el experto en la materia. La endotoxina puede ser detectada de acuerdo con las técnicas normalizadas para monitorizar el aclaramiento.

En algunas modalidades, la composición de colágeno puede ser filtrada para generar composiciones de colágeno libres de, o reducidas en, partículas virales. Ventajosamente, en estas modalidades de la invención, el filtro retiene una composición de colágeno permitiendo a las partículas virales pasar. Es posible utilizar cualquier filtro conocido para el experto en la materia, útil para el aclaramiento de virus. Por ejemplo, un filtro de 1000 kDa puede ser utilizado para el aclaramiento, o reducción de parvovirus, virus de hepatitis A y VIH. Es posible utilizar un filtro de 750 kDa para el aclaramiento, o reducción, de parvovirus y virus de hepatitis A. Es posible utilizar un filtro de 500 kDa para el aclaramiento, o reducción, de parvovirus.

Por consiguiente, la presente invención proporciona los métodos para producir composiciones de colágeno libres de, o reducidas en, partículas virales que comprende el paso de poner en contacto una composición de colágeno con un filtro de un tamaño que permita a una o más partículas virales pasar a través del filtro reteniendo la composición de colágeno. En ciertas modalidades, la composición de colágeno se pone en contacto con el filtro en condiciones que permitan que una o más partículas virales pase a través del filtro reteniendo la composición de colágeno. Las condiciones pueden ser cualquier condición para la filtración conocida para los expertos en la materia, por ejemplo, centrifugación o bombeo. El filtro debe ser de un tamaño que retenga el colágeno permitiendo que una o más partículas virales pase el filtro. En algunas modalidades, el filtro es entre 500 kDa y 1000 kDa. En modalidades particulares, el filtro es aproximadamente 500 kDa, aproximadamente 750 kDa o aproximadamente 1000 kDa. El filtro puede ser de cualquier material conocido para el experto en la materia por ser compatible con una composición de colágeno como celulosa, poliéter sulfona y otros evidentes para el experto. La filtración puede repetirse tantas veces como desee el experto en la materia. Las partículas virales pueden ser detectadas de acuerdo con las técnicas normalizadas para monitorizar filtración.

La esterilización de una composición de colágeno de la invención también puede llevarse a cabo por irradiación de ases de electrones utilizando los métodos conocidos para un experto en la materia, por ejemplo, Gorham, D. Byrom (ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122. Cualquier dosis de radiación suficiente para matar por lo menos 99.9% de bacterias y otros organismos potencialmente contaminantes esta dentro del alcance de la invención. En una modalidad particular, una dosis de por lo menos 18-25 kGy se utiliza para obtener la esterilización terminal de una composición de colágeno de la invención.

La esterilización de una composición de colágeno de la invención también puede llevarse a cabo poniendo en contacto la composición de colágeno con una solución básica utilizando los métodos conocidos para el experto en la técnica. La solución básica puede ser cualquier solución básica que conozca el experto en la técnica. En particular, es posible utilizar cualquier base a cualquier pH conocido para eliminar partículas virales. Las bases particulares para el lavado básico incluyen las bases biocompatibles, bases volátiles y las bases conocidas para el experto en la técnica por ser fácil y seguramente removidas de la composición de colágeno. En ciertas modalidades, la base puede ser cualquier base orgánica o inorgánica conocida para el experto en la técnica en una concentración de, por ejemplo, 0.2-1.0 M. En ciertas modalidades, el tratamiento base se lleva a cabo en solución de hidróxido de sodio. La solución de hidróxido de sodio puede ser NaOH 0.1 M, NaOH 0.25 M, NaOH 0.5 M o NaOH 1 M. En modalidades particulares, la composición de colágeno se pone en contacto con NaOH 0.1 M o 0.5 M.

El tratamiento básico puede ser llevado a cabo en cualquiera de las condiciones apropiadas para eliminar partículas virales y mantener la calidad del colágeno de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. Por ejemplo, la composición de colágeno puede ponerse en contacto con una solución básica a una temperatura apropiada durante un tiempo apropiado.

En algunas modalidades, el tratamiento con la base se lleva a cabo a aproximadamente 0-30°C, aproximadamente 5-25°C, 5-20°C o 5-15°C. En algunas modalidades, el tratamiento con la base se lleva a cabo a aproximadamente 0°C, aproximadamente 5° 5°, aproximadamente 10°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 23°C, aproximadamente 25°C o aproximadamente 30°C.

El tratamiento base puede llevarse a cabo durante un tiempo aproximado de acuerdo con el criterio del experto en la técnica. En ciertas modalidades, el tratamiento básico puede llevarse a cabo durante aproximadamente 0.25-24 horas, 2-20 horas, 5-15 horas, 8-12 horas, 2-5 horas, 1-4 horas o 0.25-1 hora. 4.5. Formulaciones de las composiciones de colágeno En ciertas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de colágeno inyectables. El colágeno puede ser cualquier colágeno de la invención, por ejemplo colágeno fibrilado, reticulado, que se prepare por uno de los métodos de la presente. Ventajosamente, el colágeno puede ser formulado en agua.

El colágeno puede estar en cualquier concentración útil para el experto en la técnica. En ciertas modalidades, las formulaciones de la invención comprenden 0.1-100 mg/mL, 1-100 mg/mL, 1-75 mg/mL, 1-50 mg/mL, 1-40 mg/mL, 10-40 mg/mL ó 20-40 mg/mL de colágeno. En ciertas modalidades, las formulaciones de la invención comprenden aproximadamente 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL ó 50 mg/mL de colágeno. En una modalidad particular, la presente invención proporciona las formulaciones que contienen aproximadamente 35 mg/mL de colágeno.

En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención pueden combinarse con portadores aceptados para uso farmacéutico o cosmético y de administrarse como composiciones in vi tro o in vivo . Las formas de administración pueden ser, pero no se limitan a, inyecciones, soluciones, cremas, geles, implantes, bombas, ungüentos, emulsiones, suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas, liposomas, pastas, parches tabletas, dispositivos de suministro transdérmico, rocíos, aerosoles, u otros medios conocidos para el experto en la técnica. Estos portadores aceptados para uso farmacéutico cosmético son conocidos para unas personas con las habilidades ordinarias en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse mediante procedimientos conocidos en la técnica utilizando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, los compuestos pueden formularse con excipientes, diluyentes o portadores comunes y formarse en tabletas, cápsulas, suspensiones, polvos y similares. Los ejemplos de los excipientes, diluyentes y portadores que son apropiados para tales formulaciones pueden ser los siguientes: cargas y diluyentes (por ejemplo almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos) ; agentes aglomerantes (por ejemplo carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona) ; agentes humectantes (por ejemplo glicerol) ; agentes desintegradores (por ejemplo carbonato de calcio y bicarbonato de sodio) ; agentes para retardar la disolución (por ejemplo parafina) ; aceleradores de la resorción (por ejemplo compuestos de amonio cuaternarios) ; agentes activos de superficie (por ejemplo alcohol cetílico, monoestearato de glicerol) ; portadores absortitos (por ejemplo caolín y bentonita) emulsificadores; preservadores; edulcorantes; estabilizadores; agentes colorantes; agentes perfume; agentes saborizantes; lubricantes (por ejemplo talco, calcio y estearato de magnesio) ; polietilglicoles sólidos; y mezclas de éstos.

Los términos "portador aceptado para uso farmacéutico o cosmético" o "vehículo aceptado para uso farmacéutico o cosmético" se utiliza en la presente para entender, sin limitación, cualquier líquido, sólido o semisólido que incluye, más no se limita a, agua o salina, un gel, crema, ungüento, disolvente, diluyente, base líquida para ungüento, ungüento, pasta implante, liposoma, micela, micela gigante y similares, los cuales son apropiados para uso en contacto con animal vivo o tejido humano sin provocar respuestas fisiológicas o cosméticas adversas, y que no interacciona con los demás componentes de la composición en una forma dañina. Otros portadores o vehículos aceptados para uso farmacéutico o cosméticos conocidos para el experto en la materia pueden emplearse para preparar las composiciones para el suministro de las moléculas de la presente invención.

Las formulaciones pueden ser así constituidas que estas liberan el ingrediente activo solo o preferentemente en un lugar particular, posiblemente durante un lapso de tiempo. Tales combinaciones proporcionan todavía otro mecanismo para controlar las cinéticas de liberación. Los recubrimientos, envolturas y matrices protectores pueden preparadas, por ejemplo, a partir de sustancias poliméricas o ceras.

Los métodos de administración in vivo de las composiciones de la presente invención, o de las formulaciones que contienen tales composiciones y otros materiales como portadores de la presente invención que son particularmente apropiados para las diferentes formas incluyen, más no se limitan a, administración oral (por ejemplo administración bucal o sublingual), administración anal, administración rectal, administración como supositorio, aplicación tópica, aplicación en aerosol, inhalación, administración intraperitoneal, administración intravenosa, administración transdérmica, administración intradérmica, administración subdérmica, administración intramuscular, administración intrauterina, administración vaginal, administración en una cavidad corporal, administración quirúrgica, en el lugar de un tumor o lesión interna, administración en la luz o parénquima de un órgano, y administración parenteral. Las técnicas útiles en las diferentes formas de administración anteriores incluyen, más no se limitan a, aplicación tópica, ingestión, administración quirúrgica, inyecciones, rocíos, dispositivos de suministro transdérmico, bombas osmóticas, electrodepositación directamente en el sitio deseado u otros medios conocidos para un experto en la materia. Los sitios de aplicación pueden ser externo, como sobre la epidermis, o interno, por ejemplo una úlcera gástrica, un campo quirúrgico o en cualquier parte.

Las composiciones de colágeno de la presente invención pueden aplicarse en forma de cremas, geles, soluciones, suspensiones, liposomas, partículas u otros medios conocidos para un experto en la materia de formulación y suministro de compuestos terapéuticos y cosméticos. Tamaños de partícula ultrafino de los materiales de colágeno pueden utilizarse para suministro por inhalación de los terapéuticos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración subcutánea incluyen, más no se limitan a, implantes, depósito, agujas, cápsulas y bombas osmóticas. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración vaginal incluyen, más no se limitan a, cremas y anillos. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración oral pueden ser, más no se limitan a, pildoras, líquidos, jarabes y suspensiones. Algunos ejemplos de formulaciones apropiadas para administración transdérmica pueden ser, más no se limitan a, geles, cremas, pasta, parches, rocíos y geles. Algunos ejemplos de mecanismos de suministro apropiados para administración subcutánea pueden ser, más no se limitan a, implantes, depósitos, agujas, cápsulas, y bombas osmóticas. Las formulaciones apropiadas para administración parenteral pueden ser, más no se limitan a, soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden contener antioxidantes, soluciones amortiguadoras, bacteriostáticos y solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea pueden prepararse a partir de polvos estériles, granulos y tabletas comúnmente utilizados por un experto en la materia.

Las modalidades en las que las composiciones de la invención se combinan con, por ejemplo, uno o más "portadores aceptados para uso farmacéutico o cosméticos" o excipientes pueden convenientemente prepararse en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por las técnicas farmacéuticas tradicionales. Estas técnicas incluyen el paso de poner en asociación las composiciones que contienen el ingrediente activo y el portador o los portadores o excipiente o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación de manera uniforme e íntima el ingrediente activo con los portadores líquidos. Las formulaciones de dosificación unitaria particulares son aquellas que contienen una dosis o unidad, o una fracción apropiada de esta, del ingrediente administrado. Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados en lo anterior, las formulaciones que contienen las composiciones de la presente invención pueden incluir otros agentes comúnmente utilizados por un experto en la técnica. El volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las inyecciones intramusculares pueden abarcar en volumen desde cerca de 0.1 mL a 1.0 mg .

Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas a personas o animales para proporcionar las sustancias en cualquier intervalo de dosis que produzca los resultados fisiológicos o farmacológicos deseados. La dosificación dependerá de la sustancia o sustancias que se administren, el punto final terapéutico que se desee, la concentración eficaz que se desee en el lugar de acción o en un fluido corporal, y el tipo de administración. La información respecto a las dosis apropiadas de las sustancias son conocidas para las personas con habilidades ordinarias en la técnica y pueden encontrarse en referencias como L. S. Goodman y A.

Gilman, eds., Ther Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing, New York, y Katzung, Basic & Clinical Pharmacology, Applenton & Lang, Norwalk, COnnecticut, (6a Ed., 1995). Un clínico con experiencia de la materia de la terapia deseada puede elegir las dosificaciones específicas y rangos de dosis, y la frecuencia de administración, como se requiera por las circunstancias y las sustancias que se van a administrar.

Las composiciones de colágeno pueden contener uno o más compuestos o sustancias que no sean colágeno. Por ejemplo, la comunicación de colágeno puede estar impregnada, durante la producción o durante la preparación para cirugía, con una biomolécula. Tales biomoléculas pueden ser, más no se limitan a, antibióticos (como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina) , hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumor, agentes antimicóticos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistaminas, agentes anti-inflamatorios, antiinfecciosos que incluyen, más no se limitan a, plata (como sales de plata, que incluye, más no se limita a, nitrato de plata y sulfadiazina de plata) , plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (como la lisosoma [sic]) , agentes para la curación de heridas (como las citocinas que incluyen, más no se limitan a, PDGF, TGF; limosina) , ácido hialurónico, como un agente para la curación de heridas, sellantes de heridas (como fibrina con o sin trombina) , atrayentes celulares y reactivos de andamiaje (como fibronectina) y similares. En un ejemplo específico, la composiciones de colágeno puede ser impregnado con por lo menos un factor de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etcétera. La composición de colágeno también pueden ser impregnada con moléculas orgánicas pequeñas como inhibidores específicos de procesos bioquímicos particulares, por ejemplo, inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de cinasas, inhibidores de crecimiento, medicamentos anticáncer, antibióticos, etcétera.

En todavía otras modalidades, la composición de colágeno de la invención puede combinarse con un hidrogel. Cualquier composición de hidrogel conocida para un experto en la materia esta comprendida dentro de la invención, por ejemplo, cualquiera de las composición de hidrogel descritos en las siguientes revisiones: Graham, 1998, Med. Device Technol. 9 (1): 18-22; Peppas y col., 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50 (1) : 27-46; Nguyen y col., 2002, Biomaterials, 23 (22): 4307-14; Henicl y col., 2002, Adv. Drug. Deliv. Rev. 54 (1): 13-36; Skelhorne y col., 2002, Med. Device. Technol. 13 (9): 19-23; Schmedlen y col., 2002, Biomaterials 23: 4325-32; todas las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad específica, la composición de hidrogel se aplica sobre la composición de colágeno, es decir, se descarga sobre la superficie de la composición de colágeno. La composición de hidrogel por ejemplo, puede ser rociada sobre la composición de colágeno, saturada sobre la superficie de la composición de colágeno, remojada con la composición de colágeno, bañada con la composición de colágeno o recubierta sobre la superficie de la composición de colágeno.

Los hidrogeles útiles en los métodos y composiciones de la invención pueden prepararse a partir de cualquier polímero interactivo con agua o soluble en agua conocido en la técnica que incluye, más no se limita a, alcohol polivinílico (PVA) , polimetacrilato de hidroxietilo, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, ácido hialurónico, dextrano o derivados o análogos de éstos.

En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención además se impregna con una o más biomoléculas antes de ser combinada con un hidrogel. En otras modalidades, la composición del hidrogel además se impregna con una o más biomoléculas antes de ser combinada con una composición de colágeno de la invención, moléculas como estas pueden ser más no se limitan a, antibióticos (como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina) , hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumor, agentes antimicóticos, agentes antivirales, medicamentos para el dolor, antihistaminas, agentes antiinflamatorios, anti-infecciosos que incluyen, más no se limitan a, plata (como sales de plata, que incluye, más no se limita a, plata (como las sales de plata, que incluye más no se limita a, nitrato de plata y sulfadiazina de plata) , plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (como la lisosome) , agentes para la curación de heridas (como las citocinas que incluyen, más no se limitan a, PDGF, TGF; timosina) , ácido hialurónico, como un agente para la curación de heridas, sellantes de heridas (como fibrina con o sin trombina) , atrayentes celulares y reactivos de andamiaje (como fibronectina) y similares. En un ejemplo específico, la composición de colágeno o la composición hidrogel puede ser impregnada con por lo menos un factor de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etcétera. Ventajosa, la biomolécula puede ser un agente terapéutico.

En algunas modalidades, la composición de hidrogel se combina con un laminado que contiene la composición de colágeno de la invención.

La composición de hidrogel/colágeno tiene utilidad en el campo médico que incluye, más no se limita a, el tratamiento de heridas, quemaduras, y estados de la piel (por ejemplo para tratar cicatrización) , usos cosméticos (por ejemplo cirugía cosmética) y cualquier uso como implante. En algunas modalidades, la composición de hidrogel/colágeno se aplica tópicamente a un individuo, es decir, sobre la superficie de la piel, por ejemplo para el tratamiento de una herida. En otras modalidades, la composición de hidrogel/colágeno puede utilizarse en el interior de un individuo, por ejemplo como un implante, para convertirlo en una estructura permanente o semipermanente en el cuerpo. En algunas modalidades, las composiciones de hidrogel se formulan para que sean no biodegradables. En todavía otras modalidades, la composición de hidrogel se formula para que sea biodegradable. En una modalidad específica, la composición de hidrogel se formula para degradarse en algunos días. En otra modalidad específica, la composición de hidrogel se formula para degradarse en algunos meses.

En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención se puebla con células, de modo que las células sean uniformes y confluentes. Las células que pueden utilizarse para poblar una composición de colágeno de la invención incluyen, más no se limitan a, células primordiales, células primordiales humanas, células adultas, diferenciadas, humanas, células primordiales totipotentes, células primordiales pluripotentes, células primordiales multipotentes, células primordiales específicas, del células primordiales tipo embriónicas, células progenitoras prometidas, células fibroblastoides . En otras modalidades, la invención comprende la población de la composición de colágeno de la invención con una clase específica de células progenitoras que incluye, más no se limita a, condrocitos, hepatocitos, células hematopoyéticas, células del parénquima pancreático, neuroblastos y células progenitoras musculares. 4.6 Métodos de uso de las composiciones de colágeno En otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos de uso de las composiciones de colágeno de la invención para uso terapéutico, profiláctico o cosmético.

Las composiciones de colágeno de la presente invención tienen un arreglo amplio de usos potenciales.

Los usos pueden ser, más no se limitan a, la fabricación de tejido y órganos manipulados, incluidas las estructuras como parches o tapones de tejidos o material matriz, prótesis y otros implantes, andamiaje de tejido, reparación o vendaje de heridas, dispositivos hemostáticos, dispositivos para uso en reparación y soporte de tejido, como suturas, tornillos quirúrgicos y ortopédicos, y placas quirúrgicas y ortopédicas, recubrimientos naturales o componentes para implantes sintéticos, implantes y soportes cosméticos, soporte de reparación o estructural para órganos o tejidos, suministro de sustancias, plataformas de bioingeniería, plataformas para probar el efecto de sustancias en células, cultivo de tejidos y otros numerosos usos. Esta discusión de los usos posibles no esta destinado para ser exhaustiva y existen muchas otras modalidades. Además, aunque se proporcionan múltiples ejemplos específicos, más adelante respecto a la combinación del colágeno con otros materiales y/u otras sustancias específicas, es posible utilizar muchas otras combinaciones de materiales y sustancias.

La capacidad para combinar células en un material de colágeno proporciona la capacidad para utilizar las composiciones de la presente invención para construir tejidos, órganos o tejido tipo órgano. Las células incluidos en estos tejidos u órganos pueden incluir células que sirven para una función de suministrar una sustancia, células sembradas que proporcionan el comienzo del tejido del reemplazo, o ambos. Es posible utilizar muchos tipos de células para crear tejidos u órganos. En diversas modalidades se utilizan células primordiales, células primordiales comprometidas y/o células diferenciadas. Los ejemplos de las células primordiales que se utilizan en estas modalidades incluyen, más no se limitan a, células primordiales embriónicas, células primordiales de médula ósea y células primordiales de cordón umbilical para preparar órganos o tejidos tipo órgano como hígados o ríñones. En algunas modalidades, la forma de composición ayuda a enviar señales a las células para crecer y reproducirse en un tipo específico de forma deseada. Otras sustancias, por ejemplo inductores de diferenciación, pueden adicionarse a la matriz para favorecer tipos específicos de crecimiento celular. Además, mezclas diferentes de tipos de células se incorporan en al composición en algunas modalidades. La capacidad para utilizar materiales de colágeno y matrices para biomanipular tejido u órganos crea una amplia variedad de aplicaciones de reemplazo de tejido biomanipulados .

Los ejemplos de los componentes biomanipulados incluyen, más no se limitan a, hueso, estructuras dentales, articulaciones, cartílago, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardiaco, tendones, meniscos, ligamentos, vasos sanguíneos, stents, válvulas cardiacas, córneas, tambores óticos, guías de nervios, parches de tejido u órgano o sellantes, un material de relleno para tejidos faltantes, láminas para reparaciones cosméticas, piel (láminas con células adicionadas para hacer una piel equivalente) , estructuras de tejido blando de la garganta como la tráquea, epiglotis y cuerdas vocales, otras estructuras cartilaginosas como cartílago nasal, placas tarsales, anillos traqueales, cartílago tiroide y cartílago artienoide, tejido conectivo, injertos vasculares y componentes de estos, y láminas para aplicaciones tópicas y reparación a sustitución de órganos como hígados, ríñones y páncreas. En algunas modalidades, tales matrices se combinan con fármacos y matrices para suministro de sustancias de la presente invención en formas que mejorarán la función del implante. Por ejemplo, antibióticos, anti-inflamatorios, anestésicos locales o combinaciones de estos, pueden adicionarse a la matriz de un órgano biomanipulado para acelerar el proceso de curación y reducir la incomodidad. 4.6.1 Aplicaciones cosméticas La piel humana es un material compuesto de la epidermis y la dermis. La capa externa de la capa epidérmica de la piel es el estrato córneo. Por debajo de la capa estrato córneo esta la capa epidermis. Por debajo de la epidermis se encuentra la capa más externa de la dermis denominada dermis papilar, seguido por la dermis reticular y la capa subcutánea.

La piel sirve muchas funciones que incluyen protección, absorción, pigmentogénesis, percepción sensorial, secreción, excreción, termorregulación y regulación de procesos inmunológicos. Estas funciones de la piel se afectan negativamente, por ejemplo, por el envejecimiento exposición excesiva al sol, tabaquismo, trauma y/o factores ambientales, los cuales causan cambios estructurales en la piel y pueden ocasionar deterioro de la función barrera de la piel y un recambio disminuido de las células epidérmicas. El colágeno y elastina dañados pierden la capacidad para contraerse apropiadamente, lo cual da como resultado arrugas de la piel y aspereza superficial. Las arrugas son modificaciones de la piel que se asocian normalmente con envejecimiento cutáneo y se presenta preferentemente sobre la piel expuesta al sol. A medida que el envejecimiento progresa, la cara, así como otras áreas del cuerpo comienzan a mostrar los efectos de la gravedad, la exposición al sol y los años de, por ejemplo, movimiento de los músculos faciales como sonreír, masticar y entornar los ojos. Conforme la piel envejece y se vuelve no saludable, adquiere arrugas, se afloja y presenta marcas, se vuelve áspera y tiene una capacidad disminuida para sintetizar vitamina D. La piel envejecida se vuelve más delgada y tiene una interfaz dermoepidérmica aplanada por las alteraciones del colágeno, elastina y los glucosaminoglucanos. Por lo regular, el envejecimiento de la piel puede caracterizarse por espesor y elasticidad disminuidos y adherencia al tejido subyacente.

El daño a la piel debido al envejecimiento, factores ambientales, exposición al sol y otros elementos, como pérdida de peso, la maternidad, enfermedades (por ejemplo acné y cáncer) y cirugía muchas veces da como resultado deficiencias en el contorno de la piel y otras anomalías de la piel. Para corregir las deficiencias del contorno y otras anomalías de la piel, las personas muchas veces recurren a la cirugía cosmética, como puede ser cirugías estéticas faciales y cirugías de la piel. La cirugía cosmética, no obstante, generalmente es costosa, invasiva y tiene el potencial de dejar cicatrices en las áreas de operación y pueden afectar las funciones biológicas y fisiológicas normales. Así pues, existe la necesidad de terapias alternativas.

La invención propone los métodos para aumentar la piel en un paciente. En una modalidad, un método para aumentar la piel en un paciente consiste en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a un área de la cara o cuerpo de un paciente que necesite del aumento, en donde el área de la cara o cuerpo del paciente se aumenta en comparación con el área antes de la administración del colágeno, "aumento de la piel" en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier cambio del estado natural de la piel de un paciente (por ejemplo de un humano) y las áreas relacionadas debido a actos o efectos externos. Las áreas no limitativas de la piel que puede cambiar por aumento de la piel incluyen la epidermis, dermis, capa subcutánea, grasa, músculo erector del pelo, tallo del cabello, poro del sudor, glándula sebácea o una combinación de estas.

En algunas modalidades, los métodos de la invención consisten en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a un paciente para el tratamiento de patas de gallo, pliegues nasolabiales ("líneas de expresión") , líneas de marioneta, pliegues globulares ("líneas del entrecejo") , o combinaciones de estos. Una composición de colágeno de la invención puede ayudar a llenar las líneas, pliegues u otras arrugas y reestablecer una apariencia más lisa, de apariencia más joven. Una composición de colágeno de la invención pueden utilizarse sola o junto con una o más composiciones inyectables adicionales, un procedimiento de realizamiento, como puede ser un tratamiento lacio, o un procedimiento para volver a contornear, como puede ser la cirugía cosmética facial.

En una modalidad, una composición de colágeno de la invención también puede utilizarse para aumentar áreas arrugadas o hundidas de la cara y/o para adicionar o aumentar la plenitud en áreas de la cara y el cuerpo de un paciente. Las áreas de la cara y/o el cuerpo que requieren aumento puede ser el resultado de, por ejemplo, envejecimiento, trauma, enfermedad, dolencia, factores ambientales, pérdida de peso, maternidad o una combinación de estos. Los ejemplos no limitativos de un área de la cara o el cuerpo de un paciente donde una composición de colágeno de la invención puede inyectarse o de otro modo administrarse incluye la parte inferior del ojo, la cien, parte superior del pómulo, parte inferior del pómulo, mentón, labio, mandíbula, frente, glabela, ceja, mejilla, el área entre labios superior y la nariz, la nariz (como puede ser el puente de la nariz) , cuello, nalgas, cadera, esternón, o cualquier otra parte de la cara o cuerpo o una combinación de éstos .

Una composición de colágeno de la invención puede utilizarse para tratar deficiencias de la piel que incluyen, más no se limitan, arrugas, depresiones u otros pliegues (por ejemplo líneas del entrecejo, líneas de expresión, patas de gallo o líneas de marioneta) , marcas de estiramiento o estrías, cicatrices internas y externas (como pueden ser las cicatrices resultantes de lesión, heridas, accidentes, mordidas, o cirugía) o combinación de estos. En algunas modalidades, una composición de colágeno de la invención puede utilizarse para la corrección de, por ejemplo, ojos "hundidos", vasos visibles que resultan en círculos oscuros, así como ojeras visibles. Una composición de colágeno de la invención también puede utilizarse, por ejemplo, para la corrección de la parte inferior del ojo después de la eliminación agresiva de las almohadillas de grasa debajo del ojo de la blefaroplastia inferior o corrección de la parte inferior de la mejilla después de extracción agresiva de la grasa bucal o pérdida natural. En una modalidad, una composición de colágeno de la invención puede utilizarse para corregir los resultados de rinoplastia, injerto de piel u otras irregulares inducidas por cirugía, como pueden ser hendiduras resultantes de liposucción, en otras modalidades, la composición de colágeno de la invención puede utilizarse para la corrección de cicatrices faciales o corporales (por ejemplo herida, viruela, o cicatrices de acné) . En algunas modalidades, una composición de colágeno se inyecta o de otra manera se administra a un paciente para remodelado facial, el remodelado facial utilizando los métodos de la invención puede llevarse a cabo con un paciente con laxitud del cuello o con una cara muy delgada, cara larga, cara asimétrica, una cara regordeta o que tenga una cara con atrofia de grasa localizada, una retrusión en medio de la cara, ojos hundidos y/o cualquier combinación de éstos.

En una modalidad, los métodos de la invención consisten en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a un paciente para el tratamiento de una deficiencia de la piel, como puede ser deficiencia de la piel causada por enfermedad como cáncer o acné. La deficiencia puede ser el resultado directo o indirecto de la enfermedad. Por ejemplo, una deficiencia de la piel puede ser causada por una enfermedad o puede ser causada por un tratamiento de una enfermedad. 4.6.2 Aplicaciones no cosméticas 4.6.2.1 Llenado de huecos La invención proporciona los métodos para el sellado, llenado y/o de otra manera tratamiento de un hueco dentro del cuerpo de un paciente. En algunas modalidades, los métodos de la invención consisten en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a un paciente para llenar un hueco dentro del cuerpo del paciente. Por ejemplo, una composición de colágeno puede administrarse al paciente en el área donde se ubica el hueco. El término "hueco" se pretende para comprender cualquier espacio hueco no deseado creado por el envejecimiento, enfermedad, cirugía, anormalidades congénitas o una combinación de éstos. Por ejemplo, un hueco puede ser creado luego de remoción quirúrgica de un tumor u otra masa del cuerpo de un paciente. Los ejemplos no limitativos de huecos que pueden ser llenados con la composición de colágeno de la invención pueden ser una fisura, fístula, divércula, aneurisma, quiste, lesión o cualquier otro espacio hueco no deseado en algún órgano o tejido del cuerpo del paciente .

En algunas modalidades, una composición de colágeno de la invención pueden utilizarse para llenar, sellar y/u de otro modo tratar, todo o en parte, una grieta, fisura o fístula dentro de un tejido, órgano u otra estructura del cuerpo (por ejemplo un vaso sanguíneo) , o las uniones entre tejidos adyacentes, órganos o estructuras, para prevenir la infiltración de líquidos biológicos, como puede ser sangre, orina u otros fluidos biológicos. Por ejemplo, una composición de colágeno de la invención puede ser inyectada, implantada, enroscada en, o de otro modo, administrada en la fístula entre las visceras, o en la abertura u orificio de una viscera al exterior del cuerpo del paciente. Una composición de colágeno de la invención puede utilizarse para llenar un hueco u otro defecto formado por estos estados patológicos y estimular la infiltración de los fibroblastos, la curación y el crecimiento interno del tejido.

En una modalidad, se utiliza un método de la invención para llenar, sellar y/u de otro modo tratar una fístula en un paciente que necesita del tratamiento, el método consiste en inyectar o de otro modo administrar al paciente una composición de colágeno de la invención. Una composición de colágeno de la invención puede administrarse al paciente por inyección a través de una aguja hacia uno de los orificios fistulares y llenar la mayor parte o todas las ramas del orificio. De otro modo, hebras o varillas de colágeno pueden ser roscadas en las lesiones de las fístulas a través de un orificio, o el colágeno puede ser introducido en el paciente con un catéter. Diversos tipos de fístulas pueden ser llenados, sellados y/u de otro modo tratados por una composición de colágeno o método de la invención, como puede ser fístulas anales, arteriovenosas, vesiculares, carótido-cavernosa, externa, gástrica, intestinal, parietal, salival, vaginal y anorrectal, o una combinación de éstas.

En una modalidad, se utiliza un método de la invención para llenar, sellar, y/u de otro modo tratar un divertículo en un paciente que necesite del tratamiento, el método consiste en inyectar o de otro modo administrar al paciente una composición de colágeno de la invención. Los divertículos son estructuras fisiológicas anormales que son sacos o aberturas de un órgano tubular o sacular, como puede ser el intestino, la vejiga y similares, y se puede llenar o aumentar utilizando una composición de colágeno de la invención.

En otra modalidad, se utiliza un método para llenar, sellar y/o de otro modo tratar un quiste en un paciente que necesite de tratamiento, el método consiste en inyectar o de otro modo administrar al paciente una composición de colágeno de la invención. Los quistes son sacos anormales que tienen un revestimiento membranoso que contiene gas, fluido o material semisólido. En algunas modalidades, el quiste es un pseudoquiste, el cual tiene una acumulación de, por ejemplo, fluido pero no contiene un revestimiento epitelial u otro membranoso. Los ejemplos no limitativos adicionales de quistes que pueden ser llenados, sellados y/o de otro modo tratados por la invención incluyen quistes sebáceos, dermoides, óseos o cerosos, o una combinación de éstos.

En otra modalidad, un método de la invención consiste en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención para llenar en todo, o en parte, cualquier hueco creado como resultado de remoción quirúrgica, química o biológica de crecimientos innecesarios o no deseados, fluidos, células o tejidos de un paciente. Una composición de colágeno puede ser inyectada localmente o de otro modo administrada en el lugar del hueco para aumentar el tejido remanente o circundante, ayudar en el proceso de curación y llevar al mínimo el riesgo de infección. Este aumento es especialmente útil para sitios huecos creados después de decisión de tumor, como puede ser después de cirugía de cáncer de mama, cirugía para eliminar tejido conectivo tumoroso, tejidos óseos o tejido cartilaginoso, y similares.

La presente invención además proporciona el método para provocar el aumento inyectando o de otro modo administrando una composición de colágeno de la invención no directamente en el cuerpo, si no extracorpóreamente en órganos, componentes de órganos o tejidos antes de la inclusión de los tejidos, órganos o componentes de órganos . 4.6.2.2 Abultamiento de tejido En una modalidad, los métodos de la invención consisten en administrar una composición de colágeno de la invención a un paciente para abultar el tejido. "abultamiento de tejido" en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier cambio del estado natural de los tejidos blandos no dérmicos del paciente (por ejemplo de un humano) debido a actos o efectos externos. Los tejidos comprendidos por la invención pueden ser, más no se limitan a, tejidos musculares, tejidos conectivos, grasas y, tejidos nerviosos. Los tejidos comprendidos por la presente invención pueden ser parte de múltiples órganos o partes del cuerpo que incluye, más no se limita a, el esfínter, el esfínter de la vejiga y la uretra. 4.6.2.3 Incontinencia urinaria La incontinencia urinaria (que incluye incontinencia urinaria por estrés) es la fuga repentina de orina que ocurre con actividades que dan como resultado un aumento en la presión intra-abdominal, como puede ser toser, estornudar, reír o el ejercicio. Durante estas actividades, la presión intra-abdominal entra transitoriamente por encima de la resistencia uretral, dando como resultado de este modo una fuga repentina de orina, normalmente una cantidad pequeña. La incontinencia por estrés generalmente es un problema de almacenamiento de la vejiga en la que la resistencia del esfínter uretral esta disminuida, y el esfínter no puede impedir el flujo de orina cuando existe presión aumentada desde el abdomen. La incontinencia urinaria puede ocurrir como resultado de músculos pélvicos debilitados que soportan la vejiga y la uretra, y por mal funcionamiento del esfínter uretral. Por ejemplo, el trauma previo al área de la uretra, lesión neurológica y algunos medicamentos pueden debilitar la uretra. La incontinencia urinaria se observa más comúnmente en mujeres después de la menopausia, cirugía pélvica o nacimiento de un niño, por ejemplo, después de embarazos múltiples y nacimientos vaginales, o quienes tienen prolapso pélvico (protrusión de la vejiga, uretra o pared rectal en el espacio vaginal), con cistocele, cistouretrocele o rectocele) y normalmente se relaciona a una pérdida del soporte vaginal anterior. En hombres, la incontinencia puede observarse después de cirugía prostática, más comúnmente prostectomia radical, en la cual puede haber lesión al esfínter uretral externo.

La invención comprende un método para manejar o tratar incontinencia urinaria, o un síntoma o estado resultante de ésta, que consiste en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a un paciente que necesite de esto, en donde el tejido del esfínter del paciente es aumentado y se mejora o reestablece la continencia en el paciente. La composición de colágeno puede ser inyectada o de otro modo administrada periuretralmente para aumentar el volumen del tejido alrededor de la uretra para el manejo y/o tratamiento de incontinencia urinaria. El mejoramiento en la incontinencia por estrés puede lograrse aumentando el volumen de tejido y con ello aumentando la resistencia a la efusión de orina.

En algunas modalidades, una composición de colágeno de la invención se inyecta o de otro modo se administra a un paciente en el área alrededor de la uretra, por ejemplo, para cerrar un agujero en la uretra a través de la cual se fuga la orina o para acumular el espesor de la pared de la uretra de modo que ésta selle herméticamente cuando se esta reteniendo la orina.

En otra modalidad, una composición de colágeno de la invención se inyecta o de otro modo se administra a un paciente alrededor de la uretra justo fuera del músculo de la uretra en la salida de la vejiga. La inyección del material para el abultamiento puede hacerse a través de la piel, a través de la uretra o, en mujeres, a través de la vagina.

Cuando se utilizan agujas para la inyección de las composiciones de colágeno de la invención, la colocación de la aguja puede ser guiada mediante el uso de cistoscopia insertado en la uretra. Los procedimientos de abultamiento uretral pueden hacerse bajo anestesia local, pero algunos pacientes pueden requerir anestesia general, regional o espinal. Es posible utilizar un anestésico local de modo que el paciente puede levantarse después de una inyección, y se pueda determinar si se ha logrado la continencia. Si la continencia no ha sido reestablecida, es posible administrar al paciente una o más inyecciones ulteriores. El procedimiento puede necesitar ser repetido después de algunos meses para lograr el control de la vejiga. La inyección de colágeno ayuda a controlar la fuga urinaria mediante el abultamiento del área alrededor de la uretra, comprimiendo así el esfínter. 4.6.2.4 Reflujo vesicoureteral El reflujo vesicoureteral (VUR) (o reflujo urinario) se caracteriza por el flujo retrogrado de la orina a partir de la vejiga a los ríñones. El VUR no tratado puede ocasionar efectos devastadores a largo plazo sobre la función renal y en la salud general del paciente. Un paciente con VUR tiene un riesgo aumentado de desarrollar una infección de las vías urinarias, cicatrización renal, pielonefritis, hipertensión e insuficiencia renal progresiva.

La invención proporciona un método para el manejo o tratamiento de VUR, o un síntoma o estado resultante de este, que consiste en inyectar o de otro modo administrar a un paciente que necesite de este, una composición de colágeno de la invención, en donde la pared ureteral del paciente se aumenta, y los síntomas de VUR se reduce o elimina. La composición de colágeno puede ser inyectada (por ejemplo una inyección subtrigonal) o de otro modo puede administrarse, como puede ser bajo una guía endoscópica en el respaldo detrusor bajo el orificio ureteral utilizando cualquier método conocido para los expertos en la técnica. 4.6.2.5 Enfermedad de reflujo gastroesofágico La enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) es un trastorno que normalmente ocurre por que el esfínter esofágico inferior (LES) -la válvula muscular donde el esófago se une al estómago- no se cierra apropiadamente, se relaja o debilita, y el contenido del estómago se regresa, o refluj a, hacia el esófago. Cuando el ácido del estómago, u ocasionalmente las sales biliares, entran en contacto con el esófago provocan la sensación de acidez que la mayor parte de nosotros ocasionalmente sentimos, cuando el ácido refluj ado del estómago toca el revestimiento del esófago, provoca una sensación de acidez en el pecho o garganta (asedia o pirosis) , y el fluido puede ser sentido en la parte posterior de la boca (ingestión acida) . Con el tiempo, el reflujo del ácido del estómago daña el revestimiento del tejido del esófago, provocando inflamación y dolor. En adultos, el GERD no tratado, de larga duración puede dar origen a daño permanente del esófago y en ocasiones incluso cáncer. Cualquiera, recién nacidos, niños y mujeres embarazadas pueden tener GERD.

La invención propone un método para el manejo o tratamiento de GERD, o un síntoma o estado resultante de este, que consiste en inyectar o de otro modo administrar a un paciente que necesite de este una composición de colágeno de la invención, en donde el LES del paciente es aumentado, y se reducen o eliminan los síntomas de GERD. En algunas modalidades, la composición de colágeno se administra bajo guía endoscópica hacia la pared esofágica en el nivel de a unión esofagogástrica . Destinado para impedir el reflujo, el efecto de abultamiento resulta de una combinación de material retenido y la respuesta de tejido consiguiente. Una composición de colágeno de la invención puede ser inyectada a través de agujas para inyección normales o de agujero grande (por ejemplo de calibre grande) . 4.6.2.6 Cuerdas vocales y laringe La invención propone los métodos para el manejo o tratamiento de una enfermedad, trastorno (como puede ser un trastorno neurológico) u otra anormalidad que afecte una o ambas cuerdas vocales (pliegues) y/o la laringe (caja de la voz) . Los ejemplos no limitativos de estas enfermedades, trastornos u otras anormalidades de la laringe y las cuerdas vocales son incompetencia glótica, parálisis unilateral de la cuerda vocal, parálisis bilateral de la cuerda vocal, disfonía paralítica, disfonía no paralítica, disfonía espasmódica o una combinación de estos. En otras modalidades, los métodos de la invención también pueden utilizarse para manejar o tratar enfermedades, trastornos u otras anormalidades que resultan en las cuerdas vocales cerrándose inapropiadamente, como puede ser una parálisis incompleta de la cuerda vocal ("paresis"), cuevas vocales generalmente debilitadas, por ejemplo, con edad avanzada ("presbilaringe") y/o cicatrización de las cuerdas vocales (por ejemplo a partir de cirugía o radioterapia previa) .

La invención comprende los métodos que proporcionan soporte o volumen a un pliegue vocal en un paciente que carece de volumen (como puede ser en la curvatura o atrofia del pliegue vocal) o la morbilidad (como puede ser en la parálisis) de la cuerda vocal una vez tenida. En algunas modalidades, las cuerdas vocales y/u otros tejidos blandos de la laringe pueden ser aumentados con una composición de colágeno de la invención, sola o en combinación con otros tratamientos o medicamentos. En una modalidad, una composición de colágeno de la invención aumenta o adiciona volumen a uno (o ambos) pliegues vocales, de modo que pueden hacer contacto con el otro pliegue vocal.

Cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica puede utilizarse para la administración de una composición de colágeno de la invención a una cuerda (s) vocal (es) o laringe de un paciente. En algunas modalidades, se utiliza una aguja curva para inyectar una composición de colágeno de la invención a través de la boca del paciente. En otras modalidades, puede utilizarse una aguja (por ejemplo una aguja corta de calibre mayor) para inyectar una composición de colágeno de la invención directamente a través de la piel y la manzana de adán del paciente. Una composición de colágeno de la invención puede administrarse a un paciente monitorizando los pliegues vocales del paciente con un laringoscopio en un monitor de video. 4.6.2.7 Incompetencia glótica En una modalidad, la invención propone un método para el manejo o tratamiento de incompetencia glótica. El aumento de colágeno laríngeo percutáneo puede suceder por inyección de colágeno de la invención utilizando una aguja en las cuerdas vocales de un paciente utilizando los métodos conocidos en la técnica. En algunos casos, el paciente tiene hipotonía y/o incompetencia glótica que afecta la función de la voz de la laringe, rigidez muscular aumentada y habilidad disminuida para el movimiento del músculo tiroaritenoide. En otra modalidad, la hipofonía es un resultado de enfermedad de Parkinson. En una modalidad, un método de la invención para el manejo o tratamiento de incompetencia glótica en un paciente que necesita de éste consiste en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención a las cuerdas vocales de un paciente, en donde la inyección aumenta la cuerda vocal y mejora el cierre glótico, de modo que se reduzca o elimine la incompetencia glótica en el paciente. El paciente puede o no tener cuerdas vocales móviles antes de la administración de una composición de colágeno de la invención. 4.6.2.8 Disfonia La disfonía es cualquier deterioro de la voz o dificultad o hablar. La disfonía puede o no estar asociada con parálisis laríngea o de las cuerdas vocales. La invención proporciona los métodos para el manejo o tratamiento de disfonía, como puede ser disfonía paralítica, disfonía no paralítica o disfonía espasmódica. En una modalidad, un método para manejar o tratar distonia [sic] en un paciente consiste en inyectar o administrar una composición de colágeno de la invención al paciente que necesita de ésta, en donde la distonia se mejora en el paciente en comparación con antes de la administración de la composición de colágeno. En algunos casos, la inyección de colágeno laríngea permite además medialización de uno o ambos pliegues vocales por aumento pequeños para mejorar la fonación en conjunto con o después de la tiroplastía de medialización. 4.6.2.9 Parálisis de las cuerdas vocales La cuerda vocal es esencialmente un músculo cubierto con una membrana mucosa. Cuando el músculo no está conectado a un nervio, el músculo se atrofia. Por tanto, las cuerdas vocales paralizadas comunes son de tamaño pequeño y curvas. Además, dependiendo el tipo de parálisis, la cuerda vocal puede o no tener movimiento bastante cerca de la mitad para que la otra cuerda vocal la toque. Cuando las cuerdas vocales son incapaces de encontrarse, se difícil para el paciente hacer un sonido (o por lo menos un sonido fuerte) . Así pues, la invención proporciona los métodos para aumentar o abultar una cuerda vocal atrofiada en un paciente con parálisis de las cuerdas vocales, en donde la capacidad de las cuerdas vocales para entrar en contacto se mejora.

La parálisis unilateral del pliegue vocal que es la inmovilidad de un pliegue vocal, normalmente debido a la disfunción del nervio, y muchas veces la laringe no puede cerrar completamente. El nervio laríngeo recurrente es el nervio principal que realiza la mayor parte del movimiento de cada pliegue vocal, y puede ser dañado, por ejemplo por diversas enfermedades, algunas cirugías o infección viral. En algunas modalidades, la parálisis de las cuerdas vocales en un paciente es un síntoma o resultado de cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, tuberculosis o sarcoide (o cualquier cosa que haga que los ganglios linfáticos se agranden en el pecho) , accidente cerebro vascular, una enfermedad neurológica (por ejemplo Charcot-Tooth, Shy-Drager, y atrofia multisistemas) .

La parálisis bilateral de las cuerdas vocales es la inmovilidad (normalmente cerca de la línea media) de ambos pliegue vocales. En algunas modalidades, la parálisis bilateral del pliegue vocal en un paciente es un síntoma o resultado de, por ejemplo, accidente cerebro vascular u otro estado neurológico (como puede ser malformación de Arnold-Chiari) , cáncer de tiroides, cirugía (como puede ser una cirugía mayor de cerebro) o tiroidectomía .

La invención proporciona los métodos para el uso en el manejo o tratamiento de parálisis de las cuerdas vocales. En una modalidad, se proporciona un método para manejar o tratar parálisis unilateral o bilateral de las cuerdas vocales, o un síntoma relacionado con estos en un paciente, que consiste en inyectar o de otro modo administrar una composición de colágeno de la invención al paciente, en donde se mejora en el paciente el cierre del pliegue vocal. En una modalidad, una composición de colágeno de la invención aumenta o adiciona volumen a un (o ambos) pliegue vocal paralizado de modo que pueda hacer contacto con el otro pliegue vocal. La inyección de una composición de colágeno de la invención al paciente que necesita de este puede ser a través de la boca del paciente o directamente a través de la piel y la manzana de adán. 4.6.2.10 Suministros de medicamento La composición de colágeno de la invención puede utilizarse como un vehículo para suministro de medicamentos para el suministro controlado de un medicamento, por ejemplo, un agente terapéutico. En algunas modalidades, la composición de colágeno entrega uno o más agentes terapéuticos a un individuo, por ejemplo un humano. Los agentes terapéuticos comprendidos dentro del alcance de la invención son proteínas, péptido, polisacáridos, conjugados polisacáridos, vacunas a base de genética, vacunas vivas atenuadas, células enteras. Un ejemplo no limitativo de medicamentos para uso en los métodos de la invención es antibióticos, agentes anticáncer, agentes antibacterianos, agentes antivirales; vacunas; anestésicos; analgésicos; agentes antiasmáticos; agentes anti-inflamatorios; antidepresivos; agentes antiartríticos; agentes antidiabéticos; antimicóticos; estimulantes del sistema nervioso central; hormonas; inmunosupresores; relajantes musculares; prostaglandinas.

La composición de colágeno puede utilizarse como un vehículo de suministro para el suministro controlado de una o más moléculas pequeñas a un individuo, por ejemplo un humano. En algunas modalidades, la composición de colágeno suministra una o más moléculas pequeñas a un individuo, por ejemplo un humano. Cuando se utiliza en la presente, el término "molécula pequeña" y términos análogos incluye, más no se limita a, péptido, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleóticos, análogos de nucléotidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluidos los compuestos hetero orgánicos y orgnaometálicos) que tiene peso molecular menor de aproximadamente 10,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que contengan peso molecular menor que aproximadamente 5000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que contengan peso molecular menor que aproximadamente 1000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que contengan peso molecular menor que aproximadamente 500 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tengan peso molecular menor que aproximadamente 100 gramos y sales, esteres y otras formas aceptadas para uso farmacéutico de estos compuestos. También están comprendidas las sales, esteres y otras formas aceptadas para uso farmacéutico de estos compuestos.

En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención como vehículo para el suministro de medicamentos da como resultado mejor absorción del medicamento; mejor perfil farmacocinética y distribución sistémica del medicamento en relación con otros sistemas de suministro de medicamentos conocidos en la técnica. Por farmacocinética mejorada se entiende que un mejoramiento del perfil farmacocinética se logra como se mide, por ejemplo, por los parámetros normalizados de la farmacocinética como es el tiempo para obtener la concentración máxima en plasma (Tmáx) ; la magnitud de la concentración máxima en plasma (CmáX) ; tiempo para obtener una concentración en sangre o plasma detectable (Tlag) . Por absorción mejorada se entiende que la absorción del medicamento se mejora según se mide por estos parámetros. La medición de los parámetros farmacocinéticos se hace rutinariamente en la técnica.

En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención además contienen una o más biomoléculas, por ejemplo, agentes terapéuticos, que incluye más no se limita a, antibióticos, hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumor, agentes antimicóticos, agentes antivirales, medicamentos contra el dolor, antihistaminas, agentes anti-inflamatorios, anti-infecciosos, agentes curadores de heridas, sellantes de heridas, atrayentes celulares y reactivos de andamiaje, enzimas, antagonistas o agonistas de receptor; hormonas, factores de crecimiento, médula ósea autógena u otros tipos de células, antibióticos, agentes antimicrobianos y anticuerpos, y similares, o combinaciones de estos. En un ejemplo específico, las composiciones de colágeno de la invención pueden ser impregnadas con uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etcétera. Las composiciones de colágeno de la invención también pueden ser impregnadas con una o más moléculas pequeñas, que incluyen, más no se limita a, moléculas orgánicas pequeñas como los inhibidores específicos de procesos bioquímicos particulares, por ejemplo, inhibidores de los receptores de membrana, hormonas, inhibidores de cinasas, inhibidores de crecimiento, medicamentos anticáncer, antibióticos, etcétera.

En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención se impregnan con una biomolécula, durante la producción o antes de la inyección, dependiendo de su uso propuesto. En algunas modalidades, las composiciones de colágeno de la invención comprenden uno o más interferones (a-IFN, ß-IFN, ?-IFN) , factores estimuladores de colonias (CSF) , factores estimuladores de colonias de granulocitos (GCSF) , factores estimuladores de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) , factores de necrosis tumoral (TNF) , factores de crecimiento del nervio (NGF) , factores de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , linfotoxinas, factores de crecimiento epidérmico (EGF) , factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento de células endoteliales vasculares, eritropoyetina, factores de crecimiento transformante (TGF) , oncostatina M, interleucinas (IL1-, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, etcétera) , miembros de las familias de estos o combinaciones de éstos. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención contiene análogos con actividad biológica, fragmentos o derivados de estos factores de crecimiento u otras biomoléculas.

Los agentes activos particulares para uso en los métodos de la presente invención incluyen factores de crecimiento, como puede ser los factores de crecimiento transformante (los TGF), factores de crecimiento de fibroblastos (EGF) , factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) , factores de crecimiento epidérmico (EGF), péptidos activados de tejido conectivo (CTAP) , factores osteogénicos y análogos, fragmentos y derivados con actividad biológica de tales factores de crecimiento. Los miembros de la familia del súper gen del factor de crecimiento transformante (TGF) , que son proteínas reguladoras multifuncionales, son útiles. Los miembros de la familia del súper gen de TGF incluyen los factores de crecimiento transformante beta (por ejemplo TGF-ßl, TGF-ß2, TGF-ß3) ; proteínas morfogenéticas de hueso (por ejemplo BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9) ; factores de crecimiento de unión a heparina (por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento tipo insulina (IGF)); inhibinas (por ejemplo inhibina A, inhibina B) ; factores diferenciadores de crecimiento (por ejemplo GDF-1) ; y activitas (por ejemplo activina A, activina B, activina AB) . 4.6.2.11 Heridas y quemaduras La composición de colágeno de la invención se espera que tenga una utilidad clínica mejorada como vendaje para heridas, para aumentar o reemplazar la reparación de tejido duro y/o blando en comparación con otros biomateriales conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en las Patentes US Nos. 3,157,524; 4,320,201; 3,800,792; 4,837,285; 5,116,620, debido en parte a sus propiedades físicas. La composición de colágeno de la invención debido a que retiene estructura cuaternaria nativa del colágeno proporciona mejor crecimiento interno del tejido a través de la migración de las células hacia los intersticios de la matriz de colágeno. La composición de colágeno de la invención permite a las células unirse y crecer en la matriz de colágeno, y sintetizar sus propias macromoléculas. Con ello las células producen una nueva matriz que permite el crecimiento de nuevo tejido. Tal desarrollo celular no se observa en otras formas conocidas de colágeno como fibras, vellones y colágeno soluble.

En algunas modalidades, la invención comprende el tratamiento de una herida mediante la colocación de la composición de colágeno de la invención directamente sobre la piel del individuo, es decir, sobre el estrato córneo, sobre el lugar de la herida, de modo que la herida quede cubierta, por ejemplo, utilizando una cinta adhesiva. En otras modalidades, la invención comprende el tratamiento de una herida utilizando la composición de colágeno de la invención como un implante, por ejemplo, como un implante subcutáneo.

La invención comprende el mejoramiento de la tasa de curación de heridas por la adición de una macromolécula con capacidad de favorecer el crecimiento interno de tejido a la composición de colágeno de la invención. Estas macromoléculas incluyen, más no se limitan a, ácido hialurónico, fibronectina, laminina y proteoglucanos (ver, por ejemplo, Doillon y col., (1987) Biomaterials 8: 195-200; y Doillon y Silver (1986) Biomaterials 7: 3 8).

En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención se utiliza para el manejo de heridas que incluye, más no se limita a, heridas parciales y de espesor completo, úlceras por presión, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crónicas, heridas tunelizadas/socavadas, heridas quirúrgicas (por ejemplo sitios donadores/injertos, cirugía post-Moh-s, cirugía post-láser, pediátrico, dehiscencia de una herida) , heridas por trauma (por ejemplo abrasiones, laceraciones, quemaduras de segundo grado y rasgado de la piel) y heridas con drenado. En algunas modalidades, la composición de colágeno de la invención está destinada para uso una vez.

La invención además comprende la incorporación de los agentes farmacológicos activos que incluye, más no se limita a, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento tipo insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante beta, factor de angiogénesis, antibióticos, agentes antimicóticos, agentes espermicidas, hormonas, enzimas, inhibidores de enzimas en la composición de colágeno de la invención como esta descrito en la presente en la Sección 5.4.2.7 para el suministro a la piel, y cualquier biomolécula descrita antes. En algunas modalidades, los agentes farmacológicos activos se proporcionan en una cantidad fisiológica eficaz.

En algunas modalidades, la composición de colágeno se puebla además por células vivas, que incluye más no se limita a, células primordiales halogénicas, células primordiales y células adultas antologas, antes de ser aplicada al sitio de la herida.

La composición de colágeno de la invención es particularmente útil para el tratamiento de infecciones de heridas, por ejemplo, infecciones de heridas luego de un rompimiento de las heridas quirúrgicas o traumáticas. En una modalidad particular, la composición de colágeno del colágeno se impregna con una cantidad terapéutica eficaz de un agente útil en el tratamiento de una infección de herida, que incluye más no se limita a, un antibiótico, un agente antimicrobiano y un agente antibacteriano. La composición de colágeno de la invención tiene utilidad clínica y terapéutica en el tratamiento de infecciones de heridas a partir de cualquier microorganismo conocido en la técnica, por ejemplo, los microorganismos que infectan heridas que se originan desde dentro del cuerpo humano, el cual es un depósito conocido para organismos patógenos, o de origen del entorno. Un ejemplo no limitativo de los microorganismos, el crecimiento de los cuales en heridas pueden reducirse o impedirse por los métodos y composiciones de la invención son S. aureus, St. epidermis, Streptococci beta hemolítico, E. coli, Klebsiella, y Pseudomonas species, y entre las bacterias anaeróbicas, el Clostridium welchii o tartium, los cuales son la causa de gangrena gaseosa, principalmente en heridas traumáticas profundas .

En otras modalidades, la composición de colágeno de la invención se utiliza para el tratamiento de heridas, que incluye más no se limita a, heridas epidérmicas, heridas de la piel, heridas crónicas, heridas agudas, heridas externas, heridas internas (por ejemplo, la composición de colágeno puede ser envuelta alrededor de un sitio de anastomosis durante cirugía para evitar fuga de sangre de las líneas de sutura, y para impedir al cuerpo formación de adhesiones al material de sutura) , heridas congénitas (por ejemplo epidermólisis bullosa distrófica) . En particular, la composición de colágeno tiene mejor utilidad en el tratamiento de úlceras de presión (por ejemplo, úlceras por decúbito) . Las úlceras por presión ocurren con frecuencia en pacientes sometidos a cama durante tiempo prolongado, por ejemplo, cuadripléjicos y parapléjicos que sufren pérdida de piel debido a los efectos de la presión localizada. Las úlceras por presión resultantes presentan erosión dérmica y pérdida de la epidermis y apéndices de la piel. En todavía otras modalidades más específicas, la composición de colágeno de la invención se utiliza para el manejo de heridas que incluyen, más no se limitan a, heridas de espesor parcial y completo, úlceras por presión, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crónicas, úlceras tunelizadas/socavadas, heridas quirúrgicas (por ejemplo sitios donadores/injertos, cirugía post-Moh-s, cirugía post-láser, pediátrico, dehiscencia de heridas) , herida por trauma (por ejemplo abrasiones, laceraciones, quemaduras de segundo grado y rasgado de la piel) y heridas que drenan.

La composición de colágeno de la invención también puede utilizarse en el tratamiento de quemaduras, que incluye pero no se limita a quemaduras de primer grado, quemaduras de segundo grado (quemaduras de parte del espesor) , quemaduras de tercer grado (quemaduras del espesor completo) , infección de heridas de quemadura, infecciones de heridas de quemadura escindidas y no escindidas, infección de heridas de injerto, infección del sitio de donador, pérdida de epitelio a partir de una herida de quemadura previamente injertada o curada o sitio donador de injerto de piel, e impétigo de herida de quemadura . 4.6.2.12 Dental La composición de colágeno de la invención tiene utilidad particular en odontología, por ejemplo, cirugía periodontal, regeneración guiada de tejido para la regeneración de tejido periodontal, regeneración guiada de hueso y cobertura de raíz. La invención comprende el uso de la composición de colágeno de la invención para favorecer la regeneración de defectos intraóseos periodontales, que incluye más no se limita a, defectos periodontales bilaterales acoplados, defectos intraóseos interdentales, defectos intraóseos de 3 paredes, profundos, defectos intraóseos de 2 paredes, y defectos intraóseos 2 y 3. Se espera que la composición de colágeno de la invención tenga una utilidad terapéutica mejorada y mejores parámetros clínicos para el tratamiento de defectos intraóseos periodontales en relación con otras técnicas conocidas en la materia, por ejemplo, el uso de membranas de colágeno reticulado como las descritas en Quteish y col., 1992, J. Clin. Periodontol. 19 (7): 476-84; Chung y col., 1990, J. Periodontol. 61 (12): 732-6; Mattson y col., 1995, J. Periodontol. 66 (7): 635-45; Benque y col., 1997, J. Clin. Periodontol. 24 (8): 544-9; Mattson y col., 1999, J. Periodontol. 70 (5) : 510-7) . Los ejemplos de los parámetros clínicos que se mejoran utilizando la composición de colágeno de la invención incluyen, más no se limitan a, puntajes del índice de la placa y gingival, sondeo de la profundidad de la bolsa, sondeo de la profundidad de la unión y clasificación del involucramiento de la furcación y defecto óseo, los cuales son conocidos para el experto en la materia.

La invención también comprende el uso de la composición de colágeno de la invención en el tratamiento de defectos de la furcación clase II que incluye, más no se limita a, defectos bilaterales, defectos de la furcación molar mandibular clase II, bucal, apareados, y defectos de la furcación mandibular bilateral. La utilidad de la composición de colágeno de la invención en el tratamiento de defectos de la furcación clase II puede explicarse en parte por su capacidad para regenerar periodontio perdido en los defectos de la furcación. Se espera que la composición de colágeno de la invención tenga una utilidad terapéutica y clínica mejorada en relación con las membranas de colágeno que se utilizan en la técnica para el tratamiento de defectos de la furcación clase II, como pueden ser los descritos en Paul y col., 1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang y col., 1994, J. Periodontol., 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black y col., 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukma y col., 1995, J. Periodontol 67: 650-7).

La invención además comprende el uso de la composición de colágeno de la invención en procedimientos de revestimiento de raíz. La utilidad de la composición de colágeno de la invención en el revestimiento de la raíz puede aplicarse en parte debido a su capacidad para sustituir tejido gingival perdido, daño o enfermo con base en los principios de la regeneración guiada del tejido. Se espera que la composición de colágeno de la invención tenga una utilidad clínica mejorada en el revestimiento de raíz en comparación con las membranas de colágeno en la técnica tradicionalmente utilizada para revestimiento de raíz como puede ser la descrita en Shieh y col., 1997, J. Periodontol. 68: 770-8; Zahedi y col., 1998, J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan y col., 1997 J. Mármara Univ. Dent. Fa. 2: 588: 98; Wang y col., 1997, J. Dent. Res. 78 (Spec Issue) : 199 (resumen 106), por las rezones antes mencionadas.

La invención además comprende el uso de la composición de colágeno en un individuo con una enfermedad periodontal que incluye, más no se limita, periodintitis y gingivitis. La composición de colágeno de la invención también tiene utilidad clínica como un auxiliar para el raspado y procedimientos de planificación de raíz. La invención comprende el tratamiento a un individuo con una enfermedad periodontal utilizando la composición de colágeno de la invención. Un método ejemplar para tratar una enfermedad periodontal en un individuo con el uso de una composición de colágeno de la invención consiste en insertar una composición de colágeno, la cual puede ser impregnada con un antibiótico como gluconato de clorexidina, en uno o más bolsas periodontales en el individuo, por ejemplo, más de o igual a 5 mm.

Ventajosamente, la composición de colágeno puede ser biodegradable .

La composición de colágeno de la invención para uso en odontología puede ser impregnada con una o más biomoléculas dependiendo del tipo de alteración detal que se este tratando. Cualquier biomolécula conocida en la técnica para el tratamiento de trastornos dentales esta comprendida en los métodos y composiciones de la invención. En una modalidad específica, la composición de colágeno utilizada en el tratamiento para un trastorno dental asociada con una infección puede ser impregnada con uno o más antibióticos, que incluyen, más no se limitan a, doxociclina, tetraciclina, gluconato de clorexidina y minociclina. 4.6.2.13 Otros usos La composición de colágeno de la presente invención puede utilizarse como barrera de adhesión postoperatoria en los ovarios o cuernos uterinos. La composición de colágeno puede también utilizarse como una barrera de adhesión en el cerebro (por ejemplo, en la prevención de adhesión meníngeo-cerebral) . En este caso, la composición de colágeno puede utilizarse para reconocer el espacio subdural que separa la paquimeninge y leptomeringe. En general, la composición de colágeno puede utilizarse como una envoltura en los órganos internos lesionados, por ejemplo, el baso, o como una hoja adherida al pulmón para controlar la infiltración post-operatoria. La composición de colágeno también puede utilizarse para soportar el tratamiento quirúrgico de injertos de la membrana timpánica (en perforaciones timpánicas) , o como un revestimiento en cavidades mastoides. La composición de colágeno puede utilizarse como un tejido de revestimiento en neovaginoplastia. En cirugía cardiovascular, la composición de colágeno puede utilizarse como material de cierre pericárdico. La composición de colágeno también puede utilizarse en la terminación de anastomosis en vasovasostomia . 4.7 Equipos que contienen composiciones de colágeno En otro aspecto, la presente invención proporciona los equipos que contienen las composiciones de colágeno de la invención. Por ejemplo, la presente invención proporciona los equipos para aumentar o sustituir tejido de un mamífero. Los equipos contienen uno o más composiciones de colágeno de la invención en un paquete para la distribución a un practicante de habilidades en la técnica. Los equipos pueden contener una etiqueta o rotulados con instrucciones sobre el uso de la composición de colágeno para aumentar o sustituir tejido de un mamífero de acuerdo con los métodos de la invención. En algunas modalidades, los equipos pueden tener componentes útiles para llevar a cabo los métodos como medios para administrar una composición de colágeno como puede ser una o más jeringas, cánulas, catéteres, etcétera. En algunas modalidades, los equipos pueden tener componentes útiles para el desecho seguro de medios para administrar la composición de colágeno (por ejemplo, un envase de "objetos puntiagudos" para las jeringas utilizadas) . En algunas modalidades, los equipos pueden tener la composición en jeringas previamente llenadas, paquetes para una dosis unitaria o para la unidad de uso. 5. EJEMPLOS En las secciones siguientes, los expertos en la técnica se darán cuenta que la frase "a aproximadamente 23°C" puede referirse a la temperatura ambiente. 5.1 Ejemplo 1: Aislamiento de colágeno a partir de las placentas Este ejemplo muestra el aislamiento de colágeno a partir de las placentas.

Las placentas congeladas se obtienen de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Las placentas se descongelan envolviendo en una bandeja de Nalgene con agua durante 4 horas. Estas luego se retiran de la envoltura de plástico y se colocan en NaCl 0.5 M (2 litros/placenta) durante 4 horas hasta descongelación. El fragmento de cordón umbilical se corta de cada placenta, y cada placenta se rebana en aproximadamente 4 tiras a aproximadamente 23°C.

Los lotes de tiras de placenta, de aproximadamente 3-4 en cada lote, se trituran utilizando un triturador de carne a aproximadamente 23°C.

Las placentas trituradas se adicionan a un tanque Nalgene de 50 L con NaCl 0.5 M (5 L/placenta) y se mezclan utilizando un mezclador motorizado a 75-100 rpm (24 h a 4°C) .

Después de 24 horas, el tejido se aisla de la mezcla. El mezclador se detiene permitiendo que el tejido repose en la base del mezclador a aproximadamente 23°C. El fluido (-50 L) se retira utilizando una bomba peristáltica a aproximadamente 23°C. De otro modo, el tejido y el fluido se bombean utilizando una bomba peristáltica y filtro a través de un tamiz No. 10 a aproximadamente 23°C, y el tejido aislado se coloca otra vez en el tanque mezclador.

Se adiciona NaCl 0.5 M (5 L/placenta) reciente a la mezcla y se mezcla durante 24 horas a 4°C mezclador motorizado, 75-100 rpm) . Después de 24 h, el tejido se aisla utilizando un método antes descrito.

El tejido se lava con agua (5 L/placenta) y se mezcla durante 24 h a 41 (mezclador motorizado) , 75-100 rpm. Después de 24 h, el tejido se aisla utilizando un método antes descrito. El tejido se lava otra vez con NaCl 0.5 M, NaCl 0.5 M reciente y luego agua de acuerdo con los cuatro párrafos anteriores.

El tejido libre de componentes de la sangre se aisla. El tejido tiene un color blanco.

Se adiciona ácido acético 0.5 M (1 L/placenta) al tejido limpio en un tanque mezclador y se mezcla durante 18-24 h a 4°C con mezclador motorizado a 75-100 rpm. Se separa el tejido utilizando un método antes descrito.

Se adiciona ácido acético 0.5 M fresco al tejido (1 L/placenta) con 1 gL de pepsina. La muestra se mezcla en un tanque durante 24 h a 23°C con un mezclador motorizado a 75-100 rpm. Después de 24 h, la muestra se filtra a través de un tamiz número 10 y tamices No. 50-100 a aproximadamente 23°C.

Se incuba la muestra a aproximadamente 23°C durante 1 h hasta que se forma un precipitado y comienza a sedimentar. Se centrifuga la muestra 10,000 g durante 30 min, y se separa el sobrenadante del sedimento decantando cuidadosamente la botella de centrifuga. De otro modo, la solución (a aproximadamente 23°C) se filtra pasando a través de una serie de filtros que incluye 20 um, 5 mm, 5 mm, 2.7 mm, 0.45 µm, y, si se desea, 0.22 µm.

El sobrenadante o filtrado se adiciona a un envase de vidrio o plástico claro, alto y angosto. La concentración de NaCl de la solución se lleva a NaCl 0.7 M donde normalmente se forma un precipitado blanco. Se deja que el precipitado se mueva a la parte superior de la mezcla. Se deja que la muestra se incube durante la noche sin mezclado ni agitación a 4-23°C. Se aspira o drena el sobrenadante del precipitado salino para eliminar la fase líquida como sea posible (a aproximadamente 23°C) .

El precipitado resultante se disuelve en 5 veces el volumen de HCl 10 mM y la precipitación salina del precipitado anterior se repite. El precipitado resultante se disuelve otra vez en cinco veces el volumen de HCl 10 mM, y la precipitación salina del párrafo anterior se repite otra vez. La muestra resultante debe contener ácido acético aproximadamente 5 mM en HCl ~10 mM con una concentración de colágeno de aproximadamente 0.5 mg/ml.

Mediante el uso de un dispositivo (diafiltración) de filtración de flujo tangencial (TFF) , la muestra (a 4°C) se concentra a 3 mg/mL. Se mide la concentración de ácido acético utilizando HPLC. Cuando la muestra esta concentrada, se adiciona más HCl 10 mM y se continua la concentración hasta que la concentración de ácido acético alcance <1 mM.

Después de que la concentración de ácido acético ya llega a < 1 mM, la concentración se continúa hasta que la muestra comienza a volverse viscosa. El proceso de concentración se interrumpe cuando la concentración de colágeno, medida por el ensayo SIRCOL™ (Biocolor Ltd., Newtownabbey, Irlanda del Norte, RU) es en el intervalo de 3-4 mg/mL.

La muestra final de colágeno se filtra utilizando filtros de 0.22 µm y 0.1 µm en un envase aséptico cerrado (estéril) . Este paso se realiza a aproximadamente 23°C.

La solución final se almacena a 4°C, 5.2. Ejemplo 2: Aislamiento de colágeno a partir de placentas Este ejemplo muestra otro proceso para el aislamiento de colágeno a partir de placentas de acuerdo con la invención.

Se obtienen las placentas congeladas, el tejido se procesa y se lava con ácido acético 0.5 M (1 L/placenta) durante 28-24 horas a 4°C, y se aislan de la mezcla como esta descrito en el Ejemplo 1. Ácido acético 0.5 M (1 L/placenta) con 0.5 g pepsina/placenta se adiciona al tejido en un tanque mezclador durante 22-24 horas, a aproximadamente 5-6°C con un mezclador motorizado a 75-100 rpm.

Se adiciona al tejido ácido acético 0.5 M reciente (2 volúmenes de solución de ácido acético/placenta) con 2 g de pepsina/placenta. La muestra se mezcla en tanque durante 24 h a 23°C con un mezclador motorizado a 75-100 rpm. Después de 24 h, la muestra se filtra a través de un tamiz No. 10 y tamices No. 50-100 a aproximadamente 23°C.

Se adiciona NaCl a la solución filtrada llevando la concentración salina a 0.7 M donde normalmente se forma un precipitado blanco. Se deja que el precipitado se mueva a la parta alta de la mezcla. La muestra se deja incubar durante la noche sin mezclado ni agitación a 4-23°C. Se aspira o drena el sobrenadante del precipitado salino para eliminar tanta fase líquida como sea posible (a aproximadamente 23°C) .

El precipitado resultante se disuelve en HCl 10 mM y además se procesa como se describe en el ejemplo 1. De acuerdo con este proceso, >1.5 g de colágeno humano placentario puede separarse de cada placenta en donde la muestra de colágeno final contiene >98% de colágeno y >90% de colágeno tipo I. 5.3. Ejemplo 3: Aislamiento de colágeno a partir de placentas Este ejemplo muestra otro proceso para la separación de colágeno a partir de placentas de acuerdo con la invención.

Se obtienen las placentas congeladas, el tejido se procesa y precipita con sangre y el precipitado resultante se disuelve en HCl 10 mM como esta descrito en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2.

Una solución de hidróxido de sodio 1 N (NaOH) (aproximadamente 160 mL/placenta) se adiciona a la muestra a una velocidad de 50 mL/min y se mezcla durante 60 min a 5-6°C con un mezclador motorizado a 60-100 rpm.

NaCl 4 M y HCl 10 mM se adiciona para llevar la concentración salina a 0.7 M donde normalmente se forma un precipitado blanco. El precipitado se deja que se mueva a la parte alta de la mezcla. La muestra se deja en incubación durante la noche sin mezclado ni agitación a 4-23°C. Se aspira o drena el sobrenadante del precipitado salino para eliminar tanta fase líquida como sea posible (a aproximadamente 23°C) .

Se disuelve el precipitado resultante en HCl 10 mM y se además se procesa como esta descrito en el Ejemplo 1. 5.4. Ejemplo 4: Precipitación del colágeno fibrilado Colágeno placentario humano (HPC) en HCl 10 mM (~3mg/mL, pH ~2) se mantiene en un recipiente de reacción enchaquetado con agua, con capacidad de agitación, a 4°C.

Con agitación, búfer de neutralización (Na2HP04, 0.2 M, pH 9.2) se adiciona al colágeno en una porción de 1.5 partes de búfer neutralizante para 8.5 partes de solución de colágeno para una concentración de ion fosfato de 30 mM. El pH se ajusta a 7.2 según sea necesario y se detiene la agitación.

Se hace una rampa de temperaturas a 32°C a l°C/min y luego se mantiene a 32°C durante 20-24 h. El colágeno se transfiere a tubos de centrífuga y el volumen total se disminuye por lo menos 10 veces.

Para eliminar colágeno no fibrilado, la suspensión de colágeno fibrilado se lava 3X en salina amortiguada con fosfasto (NaHP04 20 inM y NaCl 130 mM, pH 7.4) .

La suspensión de colágeno fibrilado a ~3 mg/mL se cizalla pasando a través de un tamiz malla 60 a 2900 mL/min. El colágeno pasa a través del tamiz ~75 X.

La concentración de colágeno se confirma por análisis gravimétrico térmico. La temperatura de desnaturalización del colágeno se confirma por calorimetría diferencial de barrido.

La suspensión de colágeno fibrilado se mantiene a 4°C. 5.5. Ejemplo 5: Preparación de colágeno reticulado fibrilado La suspensión de colágeno fibrilado en PBS (~ 2.5 mg/mL, pH 7.4) se mantiene en un recipiente de reacción enchaquetado con agua con capacidad de agitación, aproximadamente a 25°C. Mientras se agita vigorosamente la suspensión de colágeno fibrilado, se adiciona 50 mM de butandioldigliciléter (BDDE) . Se ajusta el pH con NaOH ÍM hasta que se logra un pH de 9.5. La reacción se agita a aproximadamente 5°C durante 24 horas después de lo cual la suspensión de colágeno reticulado resultante se lava una vez y se resuspende en glicina 0.5 M, pH 10. La reacción de reticulación se deja extinguir con agitación a aproximadamente 25°C durante 24 horas. La suspensión de colágeno reticulado resultante se lava 3X con PBS.

Se confirma la concentración de colágeno por análisis temogravimétrico. La temperatura de desnaturalización del colágeno se confirma por calorimetría diferencial de barrido.

Se mantiene a 4°C la suspensión de colágeno fibrilado, reticulado. 5.6 Ejemplo 6: Preparación de colágeno fibrilado, reticulado, inyectable Este ejemplo demuestra el cizallamiento de colágeno fibrilado, reticulado para mejorar la facilidad de inyección y duración.

Colágeno fibrilado, reticulado se cizalla con un homogeneizador de tejido y cualquiera de las partículas excesivamente grandes se tamiza de la suspensión. El colágeno se concentra a ~35 mg/mL (confirmado por, por ejemplo, análisis temogravimétrico) . 5.7 Ejemplo 7: Aclaramiento viral Este ejemplo demuestra el aclaramiento de las partículas virales a partir de una composición de colágeno de la invención.

Una composición de colágeno de 3 mg/mL preparada de acuerdo con el ejemplo 4, 5 ó 6 se disuelve en un volumen 5 veces de HCl 10 mM, pH 2-2.3.

La composición diluida de colágeno entonces se aplica al dispositivo de filtración. Para la filtración, tubo de No. 16 se anexa a los puertos de alimentación y el retenido de un dispositivo de filtración de flujo tangencial Minimate™ (Pall Corporation, Santa Clara, CA) . Otro tubo se anexa al puerto de ventilación (recolección de desechos) . Se conecta una bomba peristáltica a la línea de alimentación entre los puertos de la muestra y la alimentación. La velocidad de la bomba se ajusta a 0-30 mL/min. La composición de colágeno diluido se coloca en un envase, y el tubo de alimentación y el tubo del retenido del dispositivo se aplican al mismo envase. Se coloca un recipiente para la recolección de desechos para recolectar el fluido separado del puerto de ventilación. Se enciende la bomba y se deja correr a aproximadamente 4-27°C. Se deja que la muestra se concentre hasta que el volumen del colágeno restante alcance el volumen original antes de la dilución.

La muestra de colágeno recolectada se vuelve a diluir cinco veces y se repite el proceso de concentración. El proceso de dilución y concentración se repite hasta 6 veces o más para producir una composición de colágeno limpia.

La composición de colágeno limpia además puede ser tratada de acuerdo con el ejemplo 3, 4 y/o 6 según sea apropiado. 5.8 Ejemplo 8: Preparación de la composición de colágeno inyectable La composición de colágeno del Ejemplo 6 ó 7 se carga en jeringas de 1 mL, ajustadas con ajustas calibre 30 y se almacenan a 4°C. 5.9 Ejemplo 9: Preparación de la composición de colágeno inyectable a partir de placentas Este ejemplo ilustra la preparación de composición de colágeno inyectable humano a partir de placentas humanas .

Paso 1: El colágeno placentario humano (HPC) se aisla de la placenta como se describe en los Ejemplos 1-3 y la muestra de colágeno en HCl 10 mM se almacena a 4°C.

Paso 2: El HPC aislado se fibrila como se describe en el Ejemplo 4.

Paso 3: el HPC fibrilado se retícula como se describe en el Ejemplo 5.

Paso 4: el HPC reticulado se cizalla y se concentra como se describe en el Ejemplo 6.

Paso 5: el HPC cizallado se aclara de partículas virales como se describe en el Ejemplo 7.

Paso 6: el HPC aclarado se carga en jeringas y se almacena a 4°C como se describe en el Ejemplo 8.

Aproximadamente 26 jeringas de colágeno placentario humano inyectable/placenta pueden prepararse con este proceso.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente para referencia como si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específica o individualmente indicada para ser incorporada para referencia. Aunque la invención antes mencionada ha sido descrita en algún detalle por medio de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y compresión, será evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a esta sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Colágeno atelopéptido soluble en ácido reticulado con 1, 4-butanodiol diglicidiléter.

2. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, caracterizado porque el colágeno es colágeno mamífero.

3. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es colágeno bovino, ovino o de rata.

4. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es colágeno humano.

5. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es colágeno placentario.

6. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es fibrilado antes de la reticulación.

7. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es colágeno placentario humano.

8. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que se retícula con un compuesto epóxidico multifuncional.

9. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 8, que se retícula con 1, 4-butanodiol diglicidiléter.

10. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, que es reducido.

11. El colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 10, que se reduce con borohidruro de sodio.

12. La composición que colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1, en donde por lo menos 80% del colágeno de la composición es colágeno tipo I.

13. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque 80-90% de colágeno de la composición es colágeno tipo I.

14. La composición de la reivindicación 12, en donde menos de 10% de colágeno de la composición es colágeno tipo III.

15. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque 2-13% del colágeno de la composición es colágeno tipo IV.

16. La composición de la reivindicación 12, que contiene por lo menos 10 µg/mg de carbohidrato.

17. La composición de la reivindicación 12, que además contiene ácido hialurónico.

18. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque el ácido hialurónico está reticulado.

19. Un método para aumentar, abultar o reemplazar tejido de un mamífero que consiste en administrar el colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1 al tejido del mamífero.

20. El método de la reivindicación 13, caracterizado porque el colágeno atelopéptido reticulado se administra por inyección.

21. Un equipo para aumentar, abultar o reemplazar tejido de un mamífero, que contiene el colágeno atelopéptido reticulado de la reivindicación 1 y una etiqueta con instrucciones para administrar el colágeno atelopéptido reticulado.

22. El equipo de la reivindicación 21, además contiene medios para administrar el colágeno atelopéptido reticulado.

23. El equipo de la reivindicación 22, caracterizado porque el medio es una jeringa.

24. Un proceso para preparar colágeno atelopéptido a partir del tejido de un mamífero que contiene colágeno, el proceso comprende el paso de: a) poner en contacto el tejido con una solución para choque osmótico para producir una solución de colágeno.

25. El proceso de la reivindicación 24, caracterizado porque la solución de choque osmótico contiene agua con un potencial osmótico menor que el de NaCl 50 mM.

26. El proceso de la reivindicación 24, caracterizado porque el paso (a) es precedido o seguido por el contacto del tejido con una solución que tenga el potencial osmótico de una solución de NaCl por lo menos 0.5 M.

27. El proceso de la reivindicación 24, que además comprende el paso de: b) poner en contacto el tejido con una solución de lavado ácido .

28. El proceso de la reivindicación 27, caracterizado porque la solución de lavado acida consiste en ácido acético 0.5 M.

29. El proceso de la reivindicación 27, que además comprende el paso de: c) separar los telopéptidos del colágeno.

30. El proceso de la reivindicación 29, caracterizado porque los telopéptidos se separan poniendo en contacto la solución de colágeno con una enzima con capacidad de remover telopéptidos bajo condiciones apropiadas para la eliminación de los telopéptidos.

31. El proceso de la reivindicación 30, caracterizado porque la enzima es pepsina o papaína.

32. El proceso de la reivindicación 31, caracterizado porque las condiciones comprenden una temperatura de 23-25°C.

33. El proceso de la reivindicación 29, que además comprende el paso de: d) poner en contacto el colágeno con una solución de fuerza iónica baja.

34. El proceso de la reivindicación 33, caracterizado porque la solución de fuerza iónica baja consiste en NaCl 0.2 M.

35. El proceso de la reivindicación 33, además comprende el paso de: e) precipitar colágeno con una solución de fuerza iónica alta.

36. El proceso de la reivindicación 35, caracterizado porque la solución de fuerza iónica alta consiste en NaCl 0.7 M.

37. El proceso de la reivindicación 36, caracterizado porque se repite el paso 35. e).

El proceso de la reivindicación 36, además comprende el paso de filtración del colágeno.

El proceso de la reivindicación 35, además comprende el paso de: f) fibrilar el colágeno.

El proceso de la reivindicación 39, además comprende el paso de: g) la reticulación del colágeno para producir colágeno reticulado.

El proceso de la reivindicación 40, caracterizado porque el colágeno se retícula con glutaraldehído, genipina o 1, 4-butanodiol diglicidiléter

El proceso de la reivindicación 39, además comprende el paso de: h) reducir el colágeno reticulado.

El proceso de la reivindicación 42, caracterizado porque el colágeno reticulado se reduce poniendo en contacto el colágeno reticulado con borohidruro de sodio.

44. El proceso de la reivindicación 42, además comprende el paso de: i) cizallar el colágeno reticulado.

45. Un proceso para reticular colágeno atelopéptido soluble en ácido comprende el paso de poner en contacto el colágeno atelopéptido soluble en ácido con 1, 4-butanodiol diglicidiléter en condiciones apropiadas para reticular el colágeno atelopéptido soluble en ácido.

46. El proceso de la reivindicación 45, caracterizado porque el colágeno atelopéptido soluble en ácido es de placenta humana.

47. El proceso de la reivindicación 45, caracterizado porque el colágeno atelopéptido soluble en ácido se pone en contacto con 400% de 1, -butanodiol diglicidiléter, con base en el peso.

48. El proceso de la reivindicación 45, caracterizado porque el colágeno atelopéptido soluble en ácido se pone en contacto con 1, 4-butanodiol diglicidiléter en presencia de un catalizador. El proceso de la reivindicación 48, caracterizado porque el catalizador es piridina. Un proceso para reducir la cantidad de partículas virales en una composición de colágeno que comprende el paso de poner en contacto una composición de colágeno con un filtro de un tamaño que permita que una o más partículas virales pasen a través del filtro reteniendo la composición de colágeno. El proceso de la reivindicación 50, caracterizado porque el filtro es de aproximadamente 500 kDa, aproximadamente 750 kDa o alrededor de 1000 kDa.