JP6382854B2 - ＩｎＳｉｔｕで重合する注射可能なコラーゲン組成物 - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本願は２０１３年３月１４日に出願した米国仮出願第６１／８５１，１１９号に基づく優先権を主張し、当該米国仮出願は、本明細書中に参照により援用される。

発明の背景
１．発明の分野
本発明は、コラーゲン組成物及びそれらの使用方法の分野に関する。

２．関連する先行技術の記載
コラーゲン組成物は３０年以上に渡り、皺（ｄｅｒｍａｌ ｗｒｉｎｋｌｅ）や皮膚の襞（ｄｅｒｍａｌ ｆｏｌｄ）等の軟組織の欠損部を増補又は平坦化するために、深い皺（ｆｕｒｒｏｗ）を抑制し、又は皮膚の輪郭のむら（ｕｎｅｖｅｎｎｅｓｓ）及び弛緩（ｌａｘｉｔｙ）を回復するのに利用されている。

軟組織の増補に利用されるコラーゲン組成物は、動物の皮膚から抽出した可溶化コラーゲンから調製された再構成コラーゲン原線維、可溶性組換えヒトコラーゲンから調製した再構成コラーゲン原線維、又はヒト皮膚から調製した全形コラーゲン原線維又は線維のいずれかからなる。いずれの場合も、コラーゲン組成物は、コラーゲン原線維／線維又は架橋したコラーゲン原線維／線維からなる。

軟組織は主にコラーゲンを基礎としたマトリックスからなり、コラーゲン又はコラーゲンを基礎とした組成物を用いて軟組織の欠損を補修するのは理にかなっている。１９８１年以来米国で軟組織増補に利用出来る１２種類以上のＦＤＡで認可されたコラーゲン製品が存在する。これらの製品は、一般に皮膚充填材と称される。しかしながら、現時点で、殆どのコラーゲンを基礎とした充填材は、米国の市場ではもはや利用できない。それらはより耐久性のある、ヒアルロン酸を含有する製品、及びヒドロキシアパタイト微小ビーズ、ポリ−Ｌ−乳酸粒子及びポリメチルメタクリレート微小球を含有する製品に取って代わられている。

軟組織増補に利用できる改善されたコラーゲンを基礎とした組成物についての関心は尚も存在する。しかしながら、そのような組成物は、強化された耐久性を示さなければならない。

発明の概要
特定の態様において、本発明は、注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物であって、酸可溶性コラーゲン、ＥＤＴＡ及びポリオールを含有する中性溶液を含有し、中性のｐＨで注射可能であって、かつイオンを含有する液体に暴露されると当該酸可溶性コラーゲンが重合する、注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物に関する。

幾つかの態様において、本発明は、軟組織を増補する方法であって、軟組織の欠損部に酸可溶性コラーゲン組成物を注射することを含み、当該組成物が、酸可溶性コラーゲン及びＥＤＴＡを含有する中性溶液を含有し、中性のｐＨで注射可能であって、かつ組織に暴露されると当該酸可溶性コラーゲンが重合する、当該方法に関する。

幾つかの態様において、本発明は、生体適合性医療用移植材であって、ポリマー又は金属製移植材、及び当該移植材の少なくとも一部を被覆する中性の酸可溶性コラーゲン組成物のコーティングを含み、当該コラーゲン組成物が、当該移植材の表面上で固形化している、当該生体適合性医療用移植材に関する。

本発明の追加の側面は、それに付属する有利かつ新規な特徴と共に、以降の明細書の部分に記載されており、そして部分的には、以降の記載を検討することにより当業者にとって自明であり、又は本発明の実施から学ばれ得ることである。本発明の目的及び長所は特許請求の範囲に特に指摘されている手段及び組み合わせによって実現され、達成されてもよい。

図１ａ及び１ｂは、生理食塩水中の本発明の一つの態様の組成物の重合を示す。

図２は、ラット皮膚に移植して６ヶ月経過した本発明の一つの態様の組成物の移植材を示す。

図３は、ラット皮膚に移植して６ヶ月経過した本発明の一つの態様の組成物の移植材を示す。

図４は、ラット皮膚に移植して６ヶ月経過した本発明の一つの態様の組成物の移植材を示す。

図５は、本発明の一つの態様のコラーゲン原線維のＴＥＭ顕微鏡画像を示す。

本発明は、特に軟組織増補及び組織再生の用途を有する特異のコラーゲン組成物に関する。本発明は、注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物であって、酸可溶性コラーゲン、ＥＤＴＡ及びポリオールを含有する中性溶液を含有し、中性のｐＨで注射可能であって、かつイオンを含有する液体に暴露されると当該酸可溶性コラーゲンが重合する、注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物に関する。幾つかの態様において、当該注射可能なｉｎ ｓｉｔｕで重合する可溶性コラーゲン組成物は、透明で、注射可能で、中性のｐＨで粘性の溶液である。当該組成物は、生体液又は他のイオンを含有する液体と接触し、又は混合されると、最初にゲル化し、その後線維化が続く重合が迅速に進行して、線維性コラーゲンマトリックスを形成する。

前記コラーゲン組成物はＥＤＴＡで化学的に処理されて、抗コラゲナーゼ及び抗微生物特性を呈する中性ｐＨで温度安定性の粘性溶液を形成する。加えて、好ましくは、Ｄ−マンニトール又は他のポリオール浸透圧促進剤等のポリオールが加えられて、生理的レベルに浸透圧を収め、当該可溶性コラーゲン組成物を保存中に安定化するのを助ける。Ｄ−マンニトールは、生体適合性も改善する。スクロース、フルクトース及び他の多糖類も、保存中の組成物の安定化を補助するために添加され得る。

前記組成物は、軟組織増補及び組織再生の促進における使用に適している。抗コラゲナーゼ特性は、組織酵素による分解を減少又は阻止し、抗微生物特性は、追加の無菌性の保証及びバイオフィルム形成の予防を提供する。また、当該組成物は、医療用移植材のコーティングにも有用である。

更に、本発明は、本発明のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物を使用して、軟組織を増補し、及び組織を再生する方法を含む。当該組成物は、好ましくは、透明で、粘性で、可溶性で、生体適合性の、中性のｐＨのコラーゲンで、細い注射針（例えば２７又は３０ゲージ）で容易に注射が可能で、組織に注射されると直ちにゲル化し、続いて原線維を形成する。組織液と接触すると、当該組成物は殆どたちどころに、即座に原線維を形成して不透明なコラーゲンマトリックスを形成するコラーゲン分子単位を含有する、粘着性の透明なゲルを形成する。加えて、前記組成物は、抗コラゲナーゼ及び殺細菌性活性をもたらすのに十分なレベルでＥＤＴＡ２ナトリウムを含有するように処理されている。Ｉｎ ｓｉｔｕで形成されたコラーゲンマトリックスは、予想外なことに、公知の注射用コラーゲンフィラーを越えて耐久性を延長する特異な性質を呈することが見出された。ＥＤＴＡは、間質コラーゲン及びコラーゲンマトリックスを消化する組織メタロプロテイナーゼを阻害することにより、抗コラゲナーゼ活性を有する。また、ＥＤＴＡは、組成物に追加の滅菌性を提供し、潜在的にバイオフィルム形成を提供する、殺菌活性をもたらす。

本発明の組成物は、耐久性及び維持された注射体積を示し、４週間、１２週間、及び６ヶ月超に渡り、元の注射体積が殆ど又は全く減少しない。この特徴は、注射後に体積が増大して、数ヶ月の期間中に体積が漸減する殆どのヒアルロン酸と異なる。幾つかの態様において、皮膚組織等の組織内に注射されたとき、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物は、周囲の組織マトリックスと統合する線維性の物質を形成する。

本明細書中、以下の用語は以下の意味で用いられる。

「コラーゲン」は、プロセシング又は改変されたものを含む全ての種類のコラーゲンを意味する。コラーゲンは、ヒト又は動物起源であってもよく、又は組換え技術を使用して生産されたものであってもよい。本明細書中、コラーゲンは、精製されたコラーゲン及び様々なコラーゲン誘導体であってもよい。

「組織」は、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトの器官内の、同様に特質化した細胞の集合を意味し、そこで細胞は、当該器官の細胞外液に暴露される。

「ｉｎ ｓｉｔｕ重合」は、前記可溶性コラーゲンが組織に注射されたとき、注射前ではなく、粘着性コラーゲンゲル、続いてコラーゲン線維性塊を形成することを意味する。

「ゲル塊」は、前記粘着性コラーゲン溶液が生体溶液中に注射され、組織内に注射され、又は重合を開始するイオンに暴露された後、直ちに形成される透明なゲルを意味する。当該透明なゲル塊は、生体的と接触後数分以内に粘着性の原線維性コラーゲン塊に変化するにつれて、より不透明になる。

Ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン調製に使用されるコラーゲンは、動物の皮膚、例えばウシの皮膚又はブタの皮膚から抽出されてもよく、又は細胞由来のヒトコラーゲンでもよく、又は組換えヒトコラーゲンであってもよい。当該ベースコラーゲンは、酸性溶液中で利用可能であるのが好ましい。任意の酸可溶性、原線維形成コラーゲンが使用されてもよい。しかしながら、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンが、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物を調製するのに好ましい。

本発明の一つの態様において、生理的温度で溶液の形態を維持する中性酸可溶性コラーゲンが、本発明のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンに使用される。そのような溶液を形成するためのコラーゲンの最初の処理のための１つの方法は、米国特許第５，４９２，１３５号に記載されており、当該文献は参照により本明細書中に援用される。一つの態様において、可溶性コラーゲンは、ウシ又はブタ組織を含む動物供給源から単離及び精製されてもよく、又は組換えヒトコラーゲンであってもよい。得られた酸性コラーゲン溶液は、好ましくは、ＥＤＴＡ２ナトリウム溶液に対して広範囲に透析されて、未成熟なコラーゲンの原線維形成を防ぐ。段階的な透析の過程で、１Ｎ水酸化ナトリウムを使用してＥＤＴＡ２ナトリウム透析溶液のｐＨを調整することにより、コラーゲン溶液のｐＨは酸性レベルから中性レベルに上がる。得られた中性ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．５である。中性ｐＨにおいて、コラーゲン調製物は典型的な原線維形成を呈さず、生体液又は他のイオンを含有する液体に接触するまで透明なままである。

コラーゲンは、効果的な組織バルクを提供するために２７〜３１ゲージの針及びカニューレを通じて注射されるのに充分な量で、かつそれが２７ゲージ以上の針又はカニューレを通じて注射されない、若しくは注射対象の細胞が侵入できない程に狭いマトリックスを形成しない濃度で、本発明の組成物中に存在する。幾つかの態様において、前記組成物は、濃度５〜７０ｍｇ／ｍｌ（０．５−７．０％ｗ／ｖ）、２５〜６５ｍｇ／ｍｌ（２．５−６．５％ｗ／ｖ）又は２０〜４０ｍｇ／ｍｌ（２−５％ｗ／ｖ）の濃度で酸可溶性コラーゲンを含有する。

前記組成物中に存在するＥＤＴＡは、好ましくはＥＤＴＡ２ナトリウムである。透析後に前記注射可能な組成物中に残留するＥＤＴＡは、好ましくは、組織メタロプロテアーゼの活性を阻害し、滅菌性を補償し、潜在的にバイオフィルム形成を阻害する殺菌活性を提供するのに十分な抗コラゲナーゼ活性を提供するのに十分な濃度で存在する。幾つかの態様において、前記注射可能な組成物中のＥＤＴＡの濃度は、１０〜５０ｍＭ、２５ｍＭ〜４０ｍＭ、又は３０ｍＭ〜３５ｍＭである。

幾つかの態様において、本発明の組成物は、当該組成物に生理的オスモル濃度を提供し、保存中に当該可溶性コラーゲン組成物の安定化を補助するため、ポリオールを含有する。当該ポリオールは、生体適合性の改善ももたらし得る。オスモル濃度は、好ましくは２８０〜３６０ｍｍｏｌ／ｋｇである。幾つかの態様において、ポリオールは糖アルコール又は他の浸透圧促進剤であり、好ましくはＤ−マンニトールである。幾つかの態様において、前記組成物は、２．５％〜４％、又は３．０％〜３．９％、又は３．５％の濃度でポリオールを含有する。

スクロース又はフルクトース等の二糖類が、前記粘性のコラーゲン溶液の安定化の補助のために前記組成物中に含有されてもよい。幾つかの態様において、当該二糖類は、最終濃度５０ｍＭ〜５００ｍＭ、又は１００ｍＭ〜４００ｍＭで添加される。

前記組成物は、注射投与を可能とする中性ｐＨ溶液である。幾つかの態様において、前記組成物の粘性は、細いゲージの針又はカニューレ、例えば２７、３０又は３１ゲージの針又はカニューレを通じて注射されるのに適している。粘性の低さは、押出し力の減少を可能とする。前記組成物は、顕著な押出し力の差を要さずに、２７、３０又は３１ゲージの針を通じて注射され得る。適用の容易さに加え、注射可能なコラーゲン溶液の送達は、周囲の組織への侵襲的傷害を最小限にしつつ、投与部位へのアクセスを可能とする。

生体液、組織、又は他のイオンを含有する液体に暴露されたとき、コラーゲン溶液は重合する。好ましくは、組成物は迅速かつ殆ど即時にゲル化し、続いて原線維を形成して、コラーゲン原線維マトリックスを形成する。幾つかの態様において、前記組成物は最初に組織に暴露後１８０秒以内、又は１０〜１２０秒以内、又は１０〜６０秒以内にゲル塊に重合する。

前記組成物は、ゲル化後迅速にコラーゲン原線維マトリックスを形成する。幾つかの態様において、コラーゲンマトリックスは、全形のコラーゲン原線維を含有する白濁の塊である。幾つかの態様において、前記組成物は、組織に暴露後１０分以内、又は５分以内にコラーゲン原線維マトリックスを形成する。

コラーゲン溶液の粘性は、軟組織又は他の特定の送達部位の欠損を埋めて、ゲル化及び原線維形成が起こるまで所望の組織部位に維持するのに充分である。また、迅速なゲル化及びマトリックス形成のため、形成されたコラーゲンマトリックスの体積は、注射された体積と等しく、使用者が皮膚の欠損を処置するのに適した体積をより正確に判定することを容易にする。これは、注射後に体積が増大する大抵のヒアルロナン注射製品よりも有利である。

本発明は、軟組織増補又は組織再生のための方法にも関する。当該方法は、中性の酸可溶性コラーゲン組成物を軟組織欠損部に注射することを含み、当該酸可溶性コラーゲンは、組織に暴露されると重合する。組織内に注射され、組織液と接触すると、当該組成物は、迅速に、殆ど瞬時にゲル化し、その後、迅速に原線維が形成されて、コラーゲン原線維マトリックスが形成される。コラーゲン原線維マトリックスは軟組織欠損を充填する。本明細書中、充填は、欠損が完全に充填されることを要しない。しかしながら、完全な欠損部の充填も想定される。幾つかの態様において、当該組成物は、上記の濃度でＥＤＴＡを含有する。当該組成物は、上記濃度でポリオールを含有する。幾つかの態様において、当該組成物は、上記で議論した期間中に、重合し、コラーゲン原線維マトリックスを形成する。

前記軟組織増補方法は、様々な軟組織の欠損に使用されてもよい。軟組織の欠損は、皺（ｗｒｉｎｋｌｅｓ）、皮膚の襞（ｄｅｒｍａｌ ｆｏｌｄ）、皮膚の弛緩、皮膚の輪郭の欠陥（ｓｋｉｎ ｃｏｎｔｏｕｒ ｄｅｆｅｃｔ）、皮膚の小皺（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｎｅ ｌｉｎｅ）、皮膚の深い皺（ｄｅｒｍａｌ ｆｕｒｒｏｗ）及び皮膚のむら（ｄｅｒｍａｌ ｕｎｅｖｅｎｎｅｓｓ）を含む。前記組成物は、様々な組織の部位に注射されてもよい。前記方法は、特に顔の皮膚又は唇の軟組織欠損に注射されるのに適している。注射される組成物の量は、治療される軟組織の欠損に基づいて、当業者によって判定される。多くの適用において、０．１〜０．５ｍＬの体積が使用され得る。

本発明の方法は、驚異的な耐久性を有するｉｎ ｓｉｔｕコラーゲンマトリックスを提供する。本明細書中、視認できるレベルまで分解しない場合、マトリックスは耐久性である。文脈中、耐久性は、マトリックスが無傷で、注入した体積を十分に維持して、長期的な臨床的効果を提供することを意味する。本発明の方法は、前記注射後４週間、１２週間及び６ヶ月以上にもわたって耐久性を維持するコラーゲン原線維マトリックスを生産し得る。幾つかの態様において、本発明の方法により生産したコラーゲンマトリックスは、好ましくは周囲の組織のマトリックスと統合することにより、周囲の組織と一体化する。

本発明は、軟組織増補を促進又は改善するために本明細書中に記載のコラーゲン組成物を注射する方法にも関する。本発明の組成物により形成されるコラーゲンマトリックスは、血管再形成及び細胞増殖を支持及び／又は刺激する生体骨格又はマトリックスを提供する。これは、対象自身の組織のリモデリングを支持する。

本発明は、中性の酸可溶性コラーゲン溶液の、医療用移植材及びデバイスの生体適合性コーディングとしての使用、及び当該移植材又はデバイスをコーティングする方法にも関する。幾つかの態様は、生体適合性ポリマー又は金属製の医療用移植材又はデバイスに関し、当該移植材又はデバイスは、本明細書中に記載のコラーゲン組成物により形成されるコラーゲンを含有する。幾つかの態様において、当該デバイス又は移植材は、ステンレス鋼で構成される。当該コーティングは、当該移植材又はデバイスの一部又は全体を被覆する。当該コーティングは、酸可溶性コラーゲンを含有する中性溶液を含有し、当該コラーゲンは、当該移植材又はデバイスの表面上で固形化する。理論に拘束されないが、コラーゲンは、移植材又はデバイスの表面と直接二価イオン交換をするか、又は移植材若しくはデバイスの表面で乾燥することにより、線維化すると考えられる。前記組成物は、本明細書中に記載される、ＥＤＴＡ及びポリオールのいずれか又は両方を含有してもよい。幾つかの態様において、当該コーティングは、３０日以上移植材の上で安定である。

また、本発明は、本明細書中に開示のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液を医療用移植材又はデバイスに適用する方法にも関する。当該溶液は当業者に既知の任意の方法により、例えば浸漬コーティング又は噴霧コーティングにより、適用されてもよい。約３０分後、材料上に薄い透明なコーティングが形成される。当該コーティングは強固かつ耐久性で、移植材又はデバイスから剥がすのは困難である。そのようなコーティングの適用は、ポリマー又は金属製の移植材及びデバイスに、生体適合性を付与し、生体分解に対する耐性を改善し、剥離の問題を減少し、組織との接着を促進し、拒絶を減少し、及び現在的に抗微生物特性を付加することが期待される。また、当該コーティングは、移植材又はデバイスの小さな凹凸を埋めて、均一で滑らかなコーティングを形成し得る。

本発明は、軟組織増補用の他のコラーゲンベースの組成物よりも多くの長所を提供する。例えば本明細書中に記載のコラーゲン組成物は、生体適合性で、生体分解性で、中性ｐＨの溶液中で安定である。当該組成物は、移植前に重合する他のコラーゲンベース組成物と異なり、コラーゲンマトリックスをｉｎ ｓｉｔｕで形成することを特徴とする。本発明は、架橋剤、追加の繊維成分、又は合成ポリマーの使用を要しない。コラーゲンを化学的に操作して中性ｐＨの安定な溶液を形成できることにより、細いゲージの針を通じて注射投与が可能となる。適用の容易性に加えて、コラーゲン溶液の注射送達は、周囲の組織に侵襲的傷害を最小化しつつ、投与部位にアクセスすることを可能とする。コラーゲン溶液の粘性は、軟組織の欠損部又は他の特定の送達部位を充填し、ゲル化及び原線維形成が起こるまで所望の組織部位に留置させるのに充分である。形成されたコラーゲンマトリックスの体積は、注射した体積に等しく、これは、使用者が皮膚の欠損を治療するのに適した体積のより正確な判定をするのに便利である。これは、注射後に体積が増大する殆どのヒアルロナン注射製品よりも有利である。ＥＤＴＡ２ナトリウムの添加は、抗コラゲナーゼ活性を提供して、組織コラゲナーゼ及び他のメタロプロテアーゼを阻害することにより、コラーゲン移植材の耐久性を延長し、かつ、殺菌活性をもたらして、潜在的なバイオフィルム形成を防ぎ、組成物の滅菌性を提供する。Ｄ−マンニトールの添加、又は類似の糖アルコールの添加は、組成物に生理的浸透圧を提供し、組織への注射又はコーティングとしての適用の前に組成物の安定化を助ける。動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ試験は、６ヶ月以上に渡り軟組織増補を維持することを実証している。ＥＤＴＡ２ナトリウムを添加して無菌で調製した組成物は、一般に滅菌であると示される。ＥＤＴＡ２ナトリウムからの寄与は、滅菌組成物の提供に貢献する。加えて、当該組成物は、治療剤、幹細胞又は他の増殖刺激剤の使用を要さずに、組織再生を促進する能力を呈した。

本発明の幾つかの側面は、以下の非限定的な例により例示される。

実施例１
単一のＥＤＴＡ溶液に対する透析及びｐＨ調整によるｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物の調製
Ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物は、ＤｅＶｏｒｅ ａｎｄ Ｅｉｆｅｒｍａｎ（米国特許第５，４９２，１３５号）の文献に基づく方法を使用して調製された。精製可溶性ウシＩ型コラーゲンをＡｄｖａｎｃｅｄ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ， Ｉｎｃから購入した。ペプシン消化コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍＬ）に塩化ナトリウムを添加し、０．８Ｍの濃度まで添加して、コラーゲンを沈殿させた。白濁の沈殿を３０分３５００ＲＰＭで遠心分離により回収し、過剰の液体を濾紙で吸い取って、約４０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。当該濃縮したコラーゲン沈殿を、分子量カットオフ１００，０００ダルトンの透析チューブ中に入れ、０．５Ｍ酢酸に対して１６〜１８時間以上、そして０．１Ｍ酢酸に対して１６〜１８時間透析した。得られた透明で粘性で再溶解したコラーゲン濃縮物を、０．０３５Ｍ（３５ｍＭ）ＤＥＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、２ナトリウム塩２水和物ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ 〜９９％）に対して透析した。２５ｍＭ以上、好ましくは３５ｍＭの濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムに対して透析するのが重要であった。透析は、５日間続行され、当初のｐＨ４．５から最後のｐＨ７．５まで毎日ｐＨが調整された。最後に透明で粘性の濃縮物が回収され、気泡を除くために遠心分離された。当該最後の透明で粘性のコラーゲンはｐＨ７．４で、室温で原線維形成を起こさなかった。コラーゲン原線維形成は、ゲル化及び重合反応が引き起こされるようにコラーゲンが生体液又はイオンを含有する液体に暴露されるまで引き起こされなかった。

ゲル化及び原線維形成の評価
上記のように調製された調製されたｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの一部を、図１ａに記載のように、０．８Ｍ塩化ナトリウムに３７℃で注入した。試験試料は、ゲル及び線維性コラーゲンの発生について観察された。図１ｂに示すように、透明で粘性のコラーゲン溶液は、６０秒以内に白色の不透明なコラーゲンマトリックスを形成した。

実施例２
ヒト皮膚生検の評価
実施例１に記載のように調製されたｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン約０．２ｃｃを、手の皮膚内に注射した。４週間後に生検を取り除き、Ｈ＆Ｅ染色に処理した。組織学的評価は、炎症反応が僅かで優れた生体適合性を示し、被験者の繊維芽細胞の明らかな侵入が見られた。

実施例３
ラット組織におけるｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの注射の評価
可溶性ペプシン消化ウシコラーゲンをＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘから購入した。Ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンは、実施例１に記載のように、３５ｍＭＥＤＴＡに対して、塩沈殿され、濃縮され、酸処理されたコラーゲンを、ｐＨを段階的に７．５まで上げながら、広範囲に透析することにより調製した。コラーゲン濃度は、ヒドロキシプロリン解析によりアッセイされた時、３７ｍｇ／ｍＬであった。ラットの皮膚４か所にそれぞれ０．４ｃｃのｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンが注射された。注射部位は紅斑及び浮腫が毎日１週間試験され、以降は毎週６ヶ月試験された。動物は２週間、１ヶ月、３か月及び６ヶ月で屠殺した。ラットの皮膚を回収し、試験された移植部位を肉眼で観察し、切除そして組織評価のための調製の前に撮影した。切片をＨ＆Ｅで染色し、評価のために顕微鏡写真を撮影した。ラット皮膚の下側の評価は、各時点で不透明なコラーゲン移植部位を明確に示した（図２）コラーゲン移植物は、各時点でＨ＆Ｅ染色切片で明確に観察され、移植体積に殆ど変化が無かった。炎症細胞反応は僅かか最小限で、移植物自体は組織化されたコラーゲン構造からなり、繊維芽細胞の侵入が見られた（図３及び４）。

実施例４
複数のｐＨ調整したＥＤＴＡ溶液に対する透析によるｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物の調製
精製した可溶性のＩ型コラーゲンを、ＳｕｎＭａｘ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。可溶性ペプシン消化コラーゲン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に飽和塩化ナトリウムを０．８Ｍの濃度まで添加して、コラーゲンを沈殿させた。白濁の沈殿を１５分５０００ＲＰＭで遠心分離により回収した。当該濃縮したコラーゲン沈殿を、分子量カットオフ１０，０００ダルトンの透析チューブ中に入れ、又は分子量カットオ２０，０００ダルトンの透析カセット中に入れ、０．５Ｍ酢酸に対して１６〜１８時間以上、そして０．１Ｍ酢酸に対して１６〜１８時間透析した。得られた透明で粘性で再溶解したコラーゲン濃縮物を、０．０３５Ｍ（３５ｍＭ）ＤＥＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、２ナトリウム塩２水和物ＳｉｇｍａＵｌｔｒａ 〜９９％）に対して透析した。２５ｍＭ以上、好ましくは３５ｍＭの濃度のＥＤＴＡ２ナトリウムに対して透析するのが重要であった。当初のｐＨは５．０±０．２であった。透析は、１２時間以上続行された。透析チューブ又はカセットは、ｐＨ５．５±０．２の３５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する透析チャンバーに移され、１２時間以上透析された。透析チューブ又はカセットは再びｐＨ６．０の３５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する透析チャンバーに移され、１２時間以上透析された。続いて、ｐＨ６．５及び７．２の３５ｍＭ ＥＤＴＡに対して透析工程が実施されて、最終的にコラーゲンのｐＨは約７．０であった。当該最後の透明で粘性のコラーゲンはｐＨ７．１で、室温で原線維形成を起こさなかった。コラーゲン原線維形成は、ゲル化及び重合反応が引き起こされるようにコラーゲンが生体液又はイオンを含有する液体に暴露されるまで引き起こされなかった。

実施例５
ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンに対するＤ−マンニトールの効果
実施例４に記載のように調製されたコラーゲン溶液を３．８％ Ｄ−マンニトール（３４６ｍｍｏｌ／ｋｇ）を含有する３５ｍＭ ＥＤＴＡに対する最後の透析工程に供した。Ｄ−マンニトールを含有するコラーゲン溶液の安定性（清澄性及び透明性の維持）が、Ｄ−マンニトールを含有しないコラーゲン溶液と、３６℃で溶液をインキュベーションすることにより比較した。安定性は、最大２２５分間コラーゲン溶液を視覚的に観察することにより評価した。その結果、Ｄ−マンニトールは、コラーゲン溶液の安定性を、対照（７５分間）と比較して顕著に延長する（少なくとも２２５分間）ことを実証した。

実施例６
Ｄ−マンニトールを含有するｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの皮膚内刺激スコア（Ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ Ｓｃｏｒｅ）の改善
ＩＳＯ １０９９３−１０に基づくウサギでの皮膚内刺激試験が、ＮＡＳＭＡで実施された。試験試料は、実施例５で最後の透析工程が３．５％Ｄ−マンニトールに対して実施された点を除いて実施例４及び５に記載されたように調製されたｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンを含んでいた。試験試料０．１ｍＬを、各組成物において３頭の動物の背中の隔離した５箇所に皮膚内注射した。陽性対照試料及び陰性試料も追加で試験された。注射部位の紅斑及び浮腫が、注射直後並びに注射後２４、４８及び７２時間で試験された。観察は注射後７日間２４時間周期で続けられた。Ｄ−マンニトール非存在下のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液のスコアは陽性対照試料と類似であった。しかしながら、Ｄ−マンニトール存在下のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液のスコアははＤ−マンニトール非存在下のスコアよりも低く；ＮＡＳＭＡ試験プロトコールにおける評価スケールに基づいて、Ｄ−マンニトール存在下組成物は０．７であるのに対し、Ｄ−マンニトール非存在下の組成物は１．４であった。これらの結果は予想外で、Ｄ−マンニトールの添加が、ｉｎ ｓｉｔｕ重合組成物の生体適合性を促進することを示唆する。

実施例７
Ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液の安定化に対するスクロースの効果
実施例４に記載のように調製したコラーゲン溶液を、３．５％ Ｄ−マンニトール及び１００ｍＭスクロースを含有する３５ｍＭ ＥＤＴＡに対して最後の透析工程に供した。この組成物を、実施例５においてＤ−マンニトールに対する最後の透析工程に供したコラーゲン溶液と比較した。３７℃での溶液安定性（溶液が透明及び清澄を維持した時間）を、コラーゲン溶液を視覚的に観察することにより評価した。３．５％ Ｄ−マンニトール及び１００ｍＭスクロースに対して透析した溶液は、Ｄ−マンニトール単独に対して透析した溶液と比較して、安定性の顕著な増大を呈した。安定性のアッセイの一つにおいて、３．５％ Ｄ−マンニトール及び１００ｍＭスクロースに対して透析した溶液は、Ｄ−マンニトールに対して透析した溶液と比較して４倍の安定性の増大を呈した。この観察は、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの長期間の室温（２０〜２５℃）での安定性が、スクロース添加により顕著に向上し得ることを示唆する。

実施例８
ウサギ皮膚内組織におけるｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの評価
通常の麻酔科で、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット３頭に、実施例４に記載の方法により調製した単量体ウシコラーゲン（ＲＰＣウシ）の試料及び１つの対照物質（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）を、深部皮膚内注射により移植した。この注射は、背骨から２ｃｍ以上離れた各側の３箇所（他の試験試料を含んで計６か所）に行われた。試験及び対照物質は、所定の投与位置に１カ所あたり０．１５〜０．２５ｍＬの体積で注射された。

臨床的観察及び皮膚の評点（紅斑及び浮腫）は、注射直後及び屠殺前に実施され、その後、所定の動物が、それぞれ２、５及び８週間で安楽死させられた。試験期間中毎日観察が実施された。屠殺後、移植部位及び流入領域リンパ節（特定される場合）が回収され、炎症が肉眼で評価され、そして組織学的検査に供された。

全体的に、ウサギ耳モデルに対するｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの注射は、刺激及び炎症は最小限又は穏和であった。組織応答は、対照に対する組織応答と同程度であった。

実施例９
ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンに対するウサギの局所組織応答の評価
ＩＳＯ １０９９３ ６， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｄｅｖｉｃｅｓ − Ｐａｒｔ ６： Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｌｏｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎに従い、実施例４に記載のように調製されたｉｎ ｓｉｔｕ重合ブタコラーゲンをウサギの皮下組織に注射して局所組織応答を評価した。

前記ｉｎ ｓｉｔｕ重合ブタコラーゲン溶液、出資者が提供した対照物質及び陰性対照物質を、位置マーカーと共に、皮下移植し、３頭の動物（期間あたり）を、４週及び１２週で安楽死させた。皮下組織を切り出して移植部位を肉眼で検査した。更に何らかの組織応答を判定するために、各動物から切り出した代表的な移植部位の顕微鏡下での評価を実施した。

組織応答は、４及び１２週では、出資者が提供した対照物質及び陰性対照物質と比較して肉眼で顕著ではなかった。顕微鏡下での観察において、４及び１２週では、試験物質は無傷を保ち、資者が提供した対照物質及び陰性対照物質と比較して無刺激と分類された。試験切片の追加の検鏡で、４〜１２週間で体積が維持され、周囲の組織と一体化することが示された。

実施例２、３、６、８及び９に示した臨床的観察及び組織学的結果は、本発明の新規ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン及びｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物が卓越した生体適合性及びｉｎ ｖｉｖｏ耐久性を有することを示した。実施例３に示した６ヶ月の耐久性は、軟組織増補用の殆どの注射可能なコラーゲンベース組成物において臨床的に報告された耐久性を越えている。

実施例１０
重合したｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの透過型電子顕微鏡による観察
重合プロトコール：実施例４に記載のようにして調製された約０．１ｍＬのｉｎ ｓｉｔｕ 重合コラーゲンを、マイクロ遠心管中、３７℃、ｐＨ７．２の２ｘリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに添加した。８〜１０分後、重合したコラーゲン試料をＴＥＭ設備中でミニグリッド（直径〜２ｍｍ）に滴下した。残りを蒸発させて薄いフィルムを形成させた。ＴＥＭ解析のために造影剤を添加した。ＴＥＭ顕微鏡写真は、良好に繋ぎ合わされた無傷のコラーゲン原線維を示した（図５）。

実施例１１
抗コラゲナーゼ活性の実証
この試験は、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物のコラゲナーゼ阻害を判定するために実施された。精製コラーゲン原線維を対照物質とし、実施例４に記載のようにして調製されたコラーゲン溶液を、ｉｎ ｖｉｖｏ条件を模倣するように試験前に重合した。ヒドロキシプロリンアッセイをコラゲナーゼ分解の前に実施して、この試験に同一の量のコラーゲンが使用されたことを保証した。ヒドロキシプロリンアッセイはコラゲナーゼ分解後にも実施され、反応後のコラーゲン残留を測定した。

その結果、３５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する試験コラーゲンは、標準コラーゲン試料と比較して、コラゲナーゼ消化に対して約３５％強い耐性を示した。

実施例１２
殺細菌活性の実証
この試験は、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物の殺細菌活性を評価するために実施された。実施例４に記載のようにして調製されたＬｏｔ ００２２ ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲンの２つの試験試料を、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に暴露した。試験前に当該試験試料を重合して足場を形成させて、ｉｎ ｖｉｖｏでの類似の条件を模倣した。抗細菌効果は、ＳＥＭイメージングにより評価された。試料は、細菌溶液（〜１００ＣＦＵ／ｍＬ）に２日間暴露された。コラーゲン足場が細菌溶液から除去され、１ｘリン酸緩衝生理食塩水で洗浄され、固定溶液（２％パラホルムアルデヒド及び２％グルタルアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸緩衝液中）で処理され、純水で洗浄後、イメージングに供した。ＳＥＭ顕微鏡写真は、細菌コロニーの消失を明らかに実証した。

実施例１３
コーティングとしてのｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液の使用
以下の５つの異なる材料をｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液でコーティングした。
１．ステンレス鋼板（平坦で５０及び２２０グリットのサンドペーパーを使用して表面を荒らしてある）
２．チタン製骨スクリュー
３．ポリプロピレン縫合糸（Ｐｒｏｌｅｎｅ）
４．ポリプロピレン網（Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ， Ｂａｒｄ）
５．ＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）骨スクリュー（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｎｅｐｈｅｗ）

前記粘性の可溶性コラーゲンは、全ての材料で厚いコーティングを形成した。試料をペトリ皿に置き、重合させ、乾燥させた。乾燥後、コーティングはとても薄く、透明で、幾つかの材料において観察が困難であった。

以下の１つ以上の方法を使用して、前記フィルムが特徴付けられた。
１．明視野顕微鏡−Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡を使用してＲＰＣの透明なコーティングを捕捉した。顕微鏡画像はコーティングの厚さの測定を提供した。
２．走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）−ＳＥＭ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ）イメージングは、コーティングの均一性及び質を調査するために利用された。
３．ＦＴＩＲ分光法−走査の前及び後がポリマー材料から取得されて、コラーゲンコーティングの存在が判定された。
４．ドロップ形状アナライザー−金属プレートの表面エネルギーをコーティング前後に判定して、接触角／表面エネルギーの変化を判定した。
５．安定性試験−コーティングの重合後、コーティングされた材料をＰＢＳ中において、３０日間３７℃でインキュベーションし、コーティングの安定性を判定した。３０日後、材料を回収し、明視野顕微鏡で観察して、コーティングの安定性及び厚さを判定した。

結果は、ポリマー構造及びポリマー網の上に平滑かつ適合したコラーゲンコーティングの存在を示した。同様に、磨かれたステンレス鋼板は、ｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン溶液で効果的に被覆された。全体的に、本発明のｉｎ ｓｉｔｕ重合コラーゲン組成物は、金属及びポリマー材料の両方の表面上で重合及び接着し、３７℃のリン酸緩衝生理食塩水上で３０日以上安定であった。

以上のように、本発明は、自明な及び本発明に内在する他の利点と共に、上記の本発明の目的を達成するように適合されることが認められる。

本発明の範囲から逸脱せずに本発明から多くの可能な態様が形成され得るから、本明細書中に記載され、又は添付の図面に示される全ての事項は例示として解釈され、本発明の範囲を限定しないことを理解されたい。

特定の態様が示され議論されているが、当然に様々な改変がなされ得て、下記の特許請求の範囲に含まれる場合を除いて、本発明は特定の形状又は本明細書中に記載の部分又は工程の構成に限定されない。更に、他の特徴及び組み合わせを参照せずに、幾つかの特徴及び組み合わせが利用可能で、採用され得ることを理解されたい。これは、特許請求の範囲内として想定され、及び範囲内である。

Claims (32)

1. 注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物であって、
   酸可溶性コラーゲン、ＥＤＴＡ及びポリオールを含有する中性溶液を含有し、
   中性のｐＨで注射可能であって、かつ
   イオンを含有する液体に暴露されると当該酸可溶性コラーゲンが原線維形成を開始して、不透明なコラーゲン原線維マトリックスが形成される、
   注射可能な酸可溶性コラーゲン組成物。
2. ５〜７０ｍｇ／ｍｌの濃度の前記酸可溶性コラーゲンを含有する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物中の前記酸可溶性コラーゲンの濃度が２５〜６５ｍｇ／ｍｌである、請求項２に記載の組成物。
4. 前記組成物中の前記酸可溶性コラーゲンの濃度が２０〜４０ｍｇ／ｍｌである、請求項３に記載の組成物。
5. 前記ＥＤＴＡがＥＤＴＡ２ナトリウムである、請求項１に記載の組成物。
6. １０〜５０ｍＭの濃度で前記ＥＤＴＡを含有する、請求項１の組成物。
7. 前記組成物中の前記ＥＤＴＡの濃度が２５〜４０ｍｇ／ｍｌである、請求項６に記載の組成物。
8. 前記組成物中の前記ＥＤＴＡの濃度が３０〜３５ｍｇ／ｍｌである、請求項７に記載の組成物。
9. 前記ポリオールが糖アルコールである、請求項１に記載の組成物。
10. 前記ポリオールがＤ−マンニトールである、請求項９に記載の組成物。
11. ２．５〜４％の濃度で前記ポリオールを含有する、請求項１の組成物。
12. 前記組成物中の前記ポリオールの濃度が３．０〜３．９％である、請求項１１に記載の組成物。
13. 更に二糖類を含有する、請求項１の組成物。
14. 前記二糖類がスクロース及びフルクトースからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. ２７ゲージの針又はカニューレを通じて注射が可能である、請求項１に記載の組成物。
16. 組織に暴露されてから１０〜１２０秒以内に重合してゲル塊を形成する、請求項１に記載の組成物。
17. 組織に暴露されてから１０〜６０秒以内に重合してゲル塊を形成する、請求項１６に記載の組成物。
18. 組織に暴露されてから１０分以内にコラーゲン原線維を形成する、請求項１に記載の組成物。
19. 組織に暴露されてから５分以内にコラーゲン原線維を形成する、請求項１８に記載の組成物。
20. オスモル濃度が２８０〜３６０ｍｍｏｌ／ｋｇである、請求項１に記載の組成物。
21. 軟組織を増補するための酸可溶性コラーゲン組成物であって、
    酸可溶性コラーゲン及びＥＤＴＡを含有する中性溶液を含有し、
    当該増補が、軟組織の欠損部に当該組成物を注射することを含み、
    当該組成物が中性のｐＨで注射可能であって、かつ
    組織に暴露されると当該酸可溶性コラーゲンが原線維形成を開始して、不透明なコラーゲン原線維マトリックスが形成される、
    当該組成物。
22. 前記軟組織の欠損部が、皺（ｗｒｉｎｋｌｅｓ）、皮膚の襞（ｄｅｒｍａｌ ｆｏｌｄ）、皮膚の弛緩、皮膚の輪郭の欠陥（ｓｋｉｎ ｃｏｎｔｏｕｒ ｄｅｆｅｃｔ）、皮膚の小皺（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｎｅ ｌｉｎｅ）、皮膚の深い皺（ｄｅｒｍａｌ ｆｕｒｒｏｗ）及び皮膚のむら（ｄｅｒｍａｌ ｕｎｅｖｅｎｎｅｓｓ）から成る群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記注射が、唇又は顔の皮膚の中の軟組織の欠損部に対してなされる、請求項２１に記載の組成物。
24. 前記酸可溶性コラーゲンが組織に暴露されるとコラーゲン原線維マトリックスを形成し、当該マトリックスが前記注射後４週間以上にわたり維持される、請求項２１に記載の組成物。
25. 前記マトリックスが前記注射後１２週間以上耐久する、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記マトリックスが前記注射後６ヶ月以上耐久する、請求項２５に記載の組成物。
27. 前記注射された組成物が組織の再生を引き起こす、請求項２１に記載の組成物。
28. 前記注射された組成物が組織のマトリックスと一体化する、請求項２１に記載の組成物。
29. 前記酸可溶性コラーゲンが前記軟組織の欠損部を埋めるコラーゲン原線維マトリックスを形成する、請求項２１に記載の組成物。
30. 生体適合性医療用移植材であって、
    ポリマー又は金属製移植材、及び
    当該移植材の少なくとも一部を被覆する請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物のコーティング
    を含み、当該組成物が、当該移植材の表面上で固形化している、当該生体適合性医療用移植材。
31. 前記コーティングが前記移植材の上で３０日以上維持される、請求項３０に記載の移植材。
32. 前記組成物が請求項１の組成物である、請求項３０に記載の移植材。

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