CN105209005A - 可注射的可原位聚合的胶原组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可注射的酸溶性胶原组合物，所述组合物包含中性溶液，该中性溶液为酸溶性胶原、EDTA和优选的多元醇的中性溶液，其中该组合物在生理pH下是可注射的，且酸溶性胶原在暴露于组织后即聚合。本发明适用于软组织填充、促进软组织再生和涂布医学植入物和装置。

Description

可注射的可原位聚合的胶原组合物

相关申请的交叉参考

本申请基于并要求于2013年3月4日提交的美国临时申请61/851,119的优先权权益，其全部并入本文作为参考。

背景技术

1.技术领域

本发明涉及胶原组合物及其使用方法的领域。

2.相关领域的描述

已使用胶原组合物超过30年，用以填充或平滑软组织缺陷(例如皮肤皱纹(wrinkle)和皮肤褶皱(fold))、饱满纹理(furrow)或矫正皮肤轮廓不均和松弛。

用于软组织填充的胶原组合物已经包含由提取自动物皮的可溶性胶原制成的重组胶原原纤维、由可溶的重组人胶原制成的重组胶原原纤维或由人皮肤加工而成的完整胶原原纤维(fibril)或纤维(fiber)。在所有的情况下，该胶原组合物均是由胶原原纤维/纤维或交联的胶原原纤维/纤维构成。

由于软组织主要由胶原基(collagen-based)基质组成，因此用胶原或胶原基组合物来矫正软组织缺陷是有道理的。自1981年以来，在美国已有至少12种FDA批准的胶原产品可用于软组织填充。这些产品通常被称为皮肤填充剂。但是目前，绝大多数胶原基填充剂不再适用于美国市场。它们已被如下替代：提供更长耐久性的组合物，包括透明质酸产品和含有氢氧磷灰石微珠、聚-L-乳酸颗粒和聚甲基甲丙烯酸盐微球的产品。

仍对研制出可用于软组织填充的改进的胶原基组合物抱有兴趣。但是，该组合物必须表现出增加的耐久性。

发明内容

在一些实施方案中，本发明涉及可注射的酸溶性胶原组合物，其包含含有酸溶性胶原、EDTA和多元醇的中性溶液，其中所述组合物在中性pH为可注射的，且所述酸溶性胶原在暴露于含离子的流体后即聚合。

在一些实施方案中，本发明涉及填充软组织的方法，包括将酸溶性胶原组合物注入到软组织缺陷中，所述组合物包含含有酸溶性胶原和EDTA的中性溶液，其中所述组合物在中性pH为可注射的且其中所述酸溶性胶原在暴露于该组织后即聚合。在本发明的一些实施方案中，所注射的组合物产生组织再生。

在一些实施方案中，本发明涉及生物相容性医学植入物，其中所述植入物包含聚合物或金属，以及覆盖该植入物的至少一部分的中性酸溶性胶原组合物涂层，其中将该胶原组合物在该植入物的表面进行固化。

本发明的其他方面以及优点和从属于此的新型特征将在随后的说明书部分中进行阐述，并且经下列测试后，部分将变得对本领域技术人员显而易见，或可从本发明实践中习得。本发明的目的和优点可通过在所附权利要求中具体指出的手段和组合实现和达成。

附图说明

图1a和1b描绘了本发明的一个实施方案的组合物在盐水中的聚合。

图2描绘了在第6个月，大鼠真皮中的本发明一个实施方案的组合物的植入物。

图3描绘了在第6个月，大鼠真皮中的本发明一个实施方案的组合物的植入物。

图4描绘了在第6个月，大鼠真皮中的本发明一个实施方案的组合物的植入物。

图5描绘了本发明一个实施方案的胶原原纤维的TEM显微照片。

优选实施方案的详述

本发明涉及用于软组织填充和组织再生以及其他用途的独特胶原组合物。本发明涉及可注射的酸溶性胶原组合物，其包含酸溶性胶原、EDTA和多元醇的中性溶液，其中所述组合物在生理pH是可注射的且所述酸溶性胶原在暴露于组织后即聚合。在一些实施方案中，所述可注射的可原位聚合的可溶性胶原组合物在中性pH是澄清、可注射、粘稠溶液的形式。当该组合物与生理流体或其他含离子的流体接触或混合时，其迅速发生聚合(包括最初的凝胶化和随后的纤维化)，从而形成纤维性胶原基质。

将该胶原组合物用EDTA进行化学处理，从而产生在中性pH温度稳定的粘稠溶液，其呈现出抗胶原酶和抗微生物的特性。此外，优选地，将多元醇(例如D-甘露醇或其它多元醇渗透压增强剂)加入，以将渗透压调节至生理水平并在储存过程中帮助稳定可溶的胶原组合物。所述D-甘露醇还改善了生物相容性。还可将蔗糖、果糖和其他二糖加入，用以在储存过程中帮助稳定该组合物。

该组合物适用于软组织填充并促进组织再生。抗胶原酶性质减少或预防被组织酶消化，且抗微生物性质为无菌和预防生物膜形成提供额外的保障。该组合物还用于涂覆医学植入物。

本发明还包括使用本发明的原位聚合胶原组合物来填充软组织和组织再生的方法。优选地，该组合物在中性pH是澄清、粘稠、可溶性、生物相容性胶原的形式，其很容易地通过小号针头(例如27或30号)进行注射且一旦注射入组织会迅速进行凝胶化和随后的原纤维形成。一旦与组织液相互作用，那么该组合物几乎立即形成含胶原分子单元的粘合澄清凝胶，其迅速进行原纤维形成，从而形成不透明的胶原基质。此外，已将该组合物处理，使其包含足够水平的EDTA二钠以赋予抗胶原酶和杀菌活性。已发现，该原位形成的胶原基质意外地呈现出独特的性质，即比已知的可注射的胶原填充剂更长的耐久性。该EDTA通过抑制消化间质胶原和胶原基质的组织金属蛋白酶来赋予抗胶原酶活性。它还赋予杀菌活性，从而提供额外的组合物无菌度并潜在地抑制生物膜的形成。

本发明组合物已显示出耐久性和固定的注射体积，即最初的注射体积减少的很少或没有减少，保持4周、12周和超过6个月的时间段。这一性质不同于绝大多数透明质酸凝胶，该凝胶在注射后体积增加，且然后经数月的时间体积逐渐减少。在一些实施方案中，一旦将该原位聚合的胶原组合物注射到组织(例如表皮组织)，其便形成纤维块(fibrousmass)，该物质与周围的组织基质整合。

本文所用的一些术语具有以下含义：

“胶原”是指所有类型的胶原，包括已被加工或改性的那些。该胶原可为人或动物来源的或可使用重组技术生产。如本文所用，胶原包括经纯化的胶原以及各种胶原衍生物。

“组织”是指在生物体中(优选哺乳动物，且更优选人)类似分化的细胞的集合，其中该细胞暴露于该生物体的细胞外液。

“原位聚合”是指一旦在将可溶性胶原注射入组织后且不是在注射前，即形成粘合的胶原凝胶以及随后形成胶原原纤维块。

“凝胶块”是指，在将粘性胶原溶液注入到生理溶液中或注射入组织或暴露于引发聚合作用的离子后立即形成的澄清凝胶。该澄清凝胶块随着其在与生理液接触后的几分钟内转化成粘合的原纤维胶原块而变得较不透明。

用于制备原位聚合胶原的胶原可提取自动物皮，例如牛皮或猪皮，或可为细胞衍生的人胶原，或重组的人胶原。优选地，该基础胶原在酸溶液中可用。可使用任何酸溶性的原纤维形成胶原类型。但是，I和III型胶原优选地用于制备所述原位聚合的胶原组合物。

在本发明的一个实施方案中，将在生理温度保持在溶液中的中性、酸溶性胶原用于本发明的原位聚合的胶原。用于初始处理该胶原以形成该溶液的一种方法公开在美国专利号5,492,135中，将其引入本文作为从参考。在一个实施方案中，该可溶性胶原可从动物来源(包括牛和猪的组织)分离并纯化或可以是重组的人胶原。将所得酸性胶原溶液优选地用EDTA二钠溶液进行全面透析以防止过早的胶原原纤维生成。在逐步透析过程中，通过用1N氢氧化钠调节EDTA二钠透析液的pH，将该胶原溶液的pH从酸性水平提高至中性pH。所得的中性pH优选约6.8至约7.5。在中性pH，该胶原制剂不发生通常的原纤维生成且保持澄清和透明直至与生理液或其他含离子的液体接触。

该胶原以足够量存在于本发明的组合物中，其通过27-31号针头和插管进行注射以提供有效的组织增容，但是其不能过浓以至于无法通过至少一个27号针头或插管进行注射或形成对宿主细胞不透的紧凑基体(compactmatrix)。在一些实施方案中，该组合物包含浓度为5至70mg/ml(0.5-7.0％w/v)、25至65mg/ml(2.5-6.5％w/v)或20至40mg/ml(2-5％w/v)的酸溶性胶原。

存在于该组合物中的EDTA优选为EDTA二钠。透析后残留在可注射组合物中的EDTA优选地以足够浓度存在，以提供足以抑制组织金属蛋白酶活性的抗胶原酶活性并提供杀菌活性，确保无菌且潜在地抑制生物膜形成。在一些实施方案中，EDTA在可注射组合物中的浓度为10至50mM、25mM至40mM或30mM至35mM。

在一些实施方案中，本发明组合物含有多元醇，为该组合物提供生理渗透压并在储存过程中帮助稳定该可溶性胶原组合物。该多元醇还可产生改善的生物相容性。渗透压优选为280至360mmol/kg。在一些实施方案中，所述多元醇为糖醇或其他渗透压增强剂，且优选为D-甘露醇。在一些实施方案中，所述组合物包含浓度为2.5％至4％，或3.0％至3.9％，或3.5％的多元醇。

二糖，例如蔗糖或果糖，可包含在该组合物中，用以帮助稳定该粘性胶原溶液。在一些实施方案中，加入二糖，使最终浓度为50mM至500mM，或100mM至400mM。

该组合物为中性pH的溶液，其可用于注射给药。在一些实施方案中，该组合物的粘度适用于通过细规格的针头或插管(例如27、30或31号针头或插管)进行注射。低粘度也实现了低挤压力。该组合物可经27、30或31号针头进行注射，在挤压力上无显著差异。除了应用方便，该胶原溶液的可注射递送能够在进入注射位点的同时使对周围组织的侵入性损伤最小。

胶原溶液一旦暴露于生理液、组织或其他含离子的流体，该胶原溶液便聚合。优选地，该组合物进行快速，几乎是立即的凝胶化，随后是快速的原纤维生成，形成胶原原纤维基质。在一些实施方案中，该组合物在暴露于组织后的180秒内，或在暴露于该组织后的10至120秒或10至60秒内开始聚合成凝胶块。

该组合物在凝胶化之后迅速形成胶原原纤维基质。在一些实施方案中，该胶原基质为含有完整胶原原纤维的白色不透明块。在一些实施方案中，该组合物在暴露于组织后的10分钟内，或暴露于该组织后的5分钟内形成胶原原纤维基质。

胶原溶液的粘度足以填充软组织缺陷或其它具体递送位点、并留在所需的组织部位直至发生凝胶化和原纤维的形成。此外，由于迅速的凝胶化和基质形成，所形成的胶原基质的体积相当于注入的体积，使得从业者便于更精确地确定用来治疗皮肤缺陷的适当的量。这是超越大多数可注射的透明质烷的产品的优势，该可注射的透明质烷产品在注射后体积增加。

本发明还涉及填充软组织或使软组织再生的方法，该方法包括向软组织缺陷中注入中性的酸溶性胶原组合物，其中所述酸溶性胶原在暴露于该组织后即聚合。当被注入组织中并与组织液接触后，该组合物经历迅速、几乎是瞬时的凝胶化，随后迅速形成原纤维以形成胶原原纤维基质。该胶原原纤维基质填充软组织缺陷。如本文所用，填充并不要求该缺陷被完全填充。但是，完全填充缺陷也在考虑范围之内。在一些实施方案中，组合物以上述浓度包含EDTA。组合物可包含上述浓度的多元醇。在一些实施方案中，该组合物在上述时间段期间聚合并形成胶原原纤维基质。

软组织填充的方法可用于各种软组织缺陷。可用本发明的方法处理的软组织缺陷包括皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、皮肤轮廓缺陷、皮肤细纹、皮肤纹理和皮肤不均。该组合物可被注射到各种皮肤区域。该方法尤其适用于将组合物注射到唇部或面部皮肤的软组织缺陷中。本领域技术人员可根据所处理的软组织缺陷来确定所注射的该组合物的量。在很多应用中，可使用0.1至0.5mL的体积。

本发明的方法提供了具有出人意料的耐久性的原位胶原基质。如本文所用，如果胶原基质不降解至肉眼可见水平，则认为该基质是耐久的。在该上下文中，耐久是指基质保持完整并充分保持其注射体积以提供长期临床效果。本发明的方法可产生在所述注射后保持至少4周、至少12周和甚至6个月以上的耐久性的胶原原纤维基质。在一些实施方案中，通过本发明的注射方法产生的胶原基质与周围组织整合，优选地与周围组织的基质整合。

本发明还涉及通过注射本文所述的胶原组合物来促进或增强软组织再生的方法。通过本发明的组合物形成的胶原基质提供了支撑和/或刺激血管再形成和细胞群的生物框架或基质。这帮助重塑受试者本身的组织。

本发明还涉及中性的酸溶性胶原溶液作为用于医学植入物和装置的生物相容性涂层的用途，以及涂布所述植入物或装置的方法。某些实施方案涉及生物相容性聚合物或金属的医学植入物或装置，其中所述植入物或装置包含由本文所述的胶原组合物形成的涂层。在一些实施方案中，所述装置或植入物由不锈钢组成。该涂层可覆盖所述植入物或装置的一部分或全部。涂层包含中性溶液，该溶液包含酸溶性胶原，其中所述胶原在植入物或装置的表面上固化。尽管不希望束缚于任何理论，但认为通过二价离子在植入物或装置表面的直接交换或通过在植入物或装置表面上干燥而使胶原被原纤维化。该组合物还可包含本文所述的EDTA和多元醇中的一种或两种。在一些实施方案中，该涂层在植入物上至少保持稳定30天。

本发明还涉及将本文所述的原位聚合胶原溶液涂布到医学植入物或装置的方法。该溶液可通过本领域已知的任何方式涂布，包括浸涂或喷涂。在约30分钟后，在材料上形成薄的透明涂层。该涂层坚固且耐久，而且很难从植入物或装置上被擦掉。预期的是，施用该涂层能够增加生物相容性、改善对生物降解的耐受性、减少脱层的问题、促进组织附着、减少排异并潜在地增加聚合物或金属植入物和装置的抗微生物性质。该涂层还可填充聚合物或装置中的小沟槽，并产生均匀且平滑的涂层。

本发明提供了超越用于软组织填充的其它胶原基组合物的一系列优点。例如，本文所述的胶原组合物是生物相容的、可生物降解的、并且在中性pH的溶液中是稳定的。该组合物特征为原位形成胶原基质，而不像其它胶原基组合物那样在植入前聚合。本发明不需要使用交联剂、额外的原纤维组分或合成聚合物。能够化学处理该胶原以形成中性pH的稳定溶液，该能力允许通过细规格针头进行注射给药。除了易于应用以外，该胶原溶液的可注射递送还允许在对周围组织的侵入性伤害最小的同时到达给药位点。该胶原溶液的粘度足以填充软组织缺陷或其它具体的递送位点，并直至发生凝胶化和原纤维形成时都保留在希望的组织位点内。所形成的胶原基质的体积等于所注射的体积，这使得从业者能够更方便地对处理皮肤缺陷的合适体积做出更精确的确定。这是超越大多数可注射透明质烷产品的优点，其中所述透明质烷产品在注射后体积增加。加入EDTA二钠以提供抗胶原酶活性，从而抑制组织胶原酶和其它金属蛋白酶，进而延长胶原植入物的耐久性；EDTA二钠还提供杀菌活性，从而使组合物无菌并防止形成潜在的生物膜。加入D-甘露醇或类似的糖醇使组合物达到生理渗透压，并在组合物在被注射到组织中之前或作为涂层被涂布之前帮助稳定该组合物。动物模型中的体内研究表明，软组织填充保持至少6个月。通过EDTA二钠无菌制备的组合物通常显示为无菌的。EDTA二钠可帮助提供无菌组合物。此外，该组合物呈现出无需使用治疗剂、干细胞或其它所加入的生长促进剂就能够促进组织再生的能力。

通过以下非限制性实施例说明本发明的一些方面。

实施例1

通过由单一EDTA溶液进行透析随后调节pH制备原位聚合胶原组合物

使用基于DeVore和Eiferman(美国专利5,492,135)所述的方法制备原位聚合胶原组合物。由AdvancedBioMatrix，Inc购买纯的可溶性的牛I型胶原。向可溶的、胃蛋白酶消化的胶原溶液(3mg/mL)中加入氯化纳至0.8M的浓度以沉淀胶原。通过以3500RPM离心30分钟回收白色不透明沉淀物，并通过放置于滤纸上以吸收多余的液体而将其浓缩至约40mg/mL。将浓缩的胶原沉淀物置于分子量截止值为100,000道尔顿的透析管中，并使用0.5M乙酸透析至少16至18小时，然后用0.1M乙酸透析至少16至18小时。然后用0.035M(35mM)的EDTA(乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物，SigmaUltra，～99％)透析所得的澄清、粘性、再溶解的胶原浓缩物。用至少25mM浓度的EDTA二钠透析是很重要的，该浓度优选高达35mM。继续透析5天，每天调节pH，由起始的pH4.5调节至最终pH7.5。收集最终的澄清粘性胶原浓缩物，并对其离心以除去气泡。最终的澄清粘性胶原呈现7.4的pH，并且在室温下不形成原纤维。在胶原被暴露于生理液或含有引发凝胶化和聚合反应的离子的液体之前，不会引发胶原原纤维形成。

评估凝胶化和原纤维形成

将在如上实施例1中制备的原位聚合胶原等分液在37℃下注入0.8M的氯化纳中，如图1a所示。观察所测试的样品是否出现凝胶和纤维状胶原。如图1b所示，澄清的粘性胶原溶液在小于60秒内形成白色不透明的胶原基质。

实施例2

评价人皮肤活检样品

将约0.2cc的如实施例1中所述制备的原位聚合胶原注入手部皮肤中。在4周后将活检样品除去，并用H&E染色处理。组织学评价显示出人意料的生物相容性，以及可忽略的炎症反应性和与宿主成纤维细胞的明显整合。

实施例3

评价在大鼠组织中的注射原位聚合胶原

从AdvancedBiomatrix购得可溶性、胃蛋白酶消化的牛胶原。如实施例1所述制备原位聚合胶原，将盐析的、浓缩的并经酸处理的胶原用35mMEDTA进行全面透析，其中将pH逐步增加至7.5。通过羟脯氨酸测试，胶原浓度为37mg/mL。在大鼠的4个皮肤位点各自注射0.4cc的原位聚合胶原。在一周内每天检查注射位点是否出现红斑和水肿，之后在6个月内每周检查一次。在2周、1个月、3个月和6个月时杀死动物。除去大鼠皮肤，用肉眼检查植入位点并照相，随后将其解剖并准备用于组织学评价。用H&E染色各部分，并拍摄显微相片以用于评价。在各时间段对大鼠皮下的检查清楚地显示不透明的胶原植入物位点(图2)。在各时间段在H&E染色的部分清楚地观察到胶原植入物，该植入物体积几乎不变。炎性细胞活性小到可忽略不计，且植入物自身是由具有成纤维细胞浸润物的有规则的胶原结构组成(图3和图4)。

实施例4

通过用多种pH调节的EDTA溶液透析来制备原位聚合胶原组合物

纯的可溶性猪I型胶原购自SunMaxBiotechnology，LTD。向胃蛋白酶消化的可溶性胶原溶液(3mg/mL)中加入饱和氯化钠溶液，直至达到0.8M的浓度，以使胶原沉淀。通过在5000RPM下离心15分钟来回收白色不透明的沉淀物。将浓缩的胶原沉淀物置于分子量截止值为10,000道尔顿的透析管中，或置于分子量截止值为20,000道尔顿的透析盒中，并用0.5M的乙酸透析至少16至18小时，然后用0.1M的乙酸透析至少16至18小时。然后将所得的澄清、粘性、再溶解的胶原浓缩物用0.035M(35mM)的EDTA(乙二胺四乙酸，二钠盐二水合物，SigmaUltra～99％)透析。用至少25mM(优选高达35mM)的EDTA二钠浓度透析是很重要的。起始pH为5.0±0.2。继续透析至少12小时。然后将透析管或透析盒转移至含有pH5.5±0.2的35mMEDTA的透析室中，并透析至少12小时。然后将透析管或透析盒转移至含有pH6.0的35mMEDTA的透析室中，并透析至少12小时。用pH6.5和7.2的35mMEDTA顺序进行透析步骤，以使最终胶原pH达到约7.0。最终的澄清、粘性胶原呈现约7.1的pH，并在室温下不发生原纤维形成。在胶原被暴露于生理液或含有引发凝胶化和聚合反应的离子的液体之前，不引发胶原原纤维生成。

实施例5。

D-甘露醇对可原位可聚合的胶原的稳定性的影响

使根据实施例4中所述制备的胶原溶液用含有3.8％的D-甘露醇(346mmol/kg)的35mMEDTA进行最后的透析步骤。通过在36℃培养溶液，将含有D-甘露醇的胶原溶液的稳定性(保持澄清和透明)与不含D-甘露醇的胶原溶液相比较。通过在225分钟内观察胶原溶液的视觉外观来评价稳定性。结果表明，相比于对照(75分钟)，D-甘露醇显著地延长了胶原溶液的稳定性(至少225分钟)。

实施例6。

用含D-甘露醇的可原位聚合胶原得到的皮内刺激评分的改善

在NASMA根据ISO10993-10进行兔子的皮内刺激测试。测试样品包括根据实施例4和5中所述制备的可原位聚合胶原，除了实施例5的方法中包括用3.5％D-甘露醇进行的最后透析步骤。对于每种组合物，在3只动物背部的5个单独位点皮内注射0.1ml剂量的测试样品。也测试了额外的阳性对照样品和阴性对照样品。在刚刚注射后以及在注射后24小时、48小时和72小时，检查注射位点是否有红斑和水肿。在注射后7天内以24小时的间隔继续该观察。不含D-甘露醇的可原位聚合胶原溶液的测试评分与阳性对照样品相似。但是含有D-甘露醇的可原位聚合胶原的测试评分低于不含D-甘露醇的测试评分；基于NASMA研究方案中的等级量表，含有甘露醇的组合物为0.7，而不含有甘露醇的组合物为1.4。该结果是意料不到的，并表明加入D-甘露醇增加了可原位聚合组合物的生物相容性。

实施例7。

蔗糖对原位聚合胶原溶液的稳定性的影响

使如实施例4中所述制备的胶原溶液用含有3.5％D-甘露醇的35mMEDTA和100mM蔗糖进行最终透析步骤。将该组合物与实施例5中用D-甘露醇进行最后透析步骤的胶原溶液相比较。通过观察胶原溶液的视觉外观来评估在37℃的溶液稳定性(溶液保持澄清和透明的时间)。相比于仅用D-甘露醇透析的溶液，用3.5％D-甘露醇和100mM蔗糖透析的溶液在稳定性方面呈现出显著的增加。在一个稳定性试验中，相比于用D-甘露醇透析的溶液，用3.5％D-甘露醇和100mM蔗糖透析的溶液在稳定性方面呈现出4倍的增加。该观察表明，通过加入蔗糖，可显著增加可原位聚合的胶原的长期室温(20至25℃)稳定性。

实施例8。

评价兔子皮内组织中的原位聚合胶原

在全身麻醉下，将根据实施例4所述的方法制备的单体牛胶原(RPC牛，RPCbovine)样品通过深层皮下注射植入三只斯普拉-道来大鼠中，和将一种对照制品(Restylane)植入一只大鼠中。在沿脊椎轴每隔～2cm距离注射，每只动物每侧有三个位点(总共6个，包括其它测试样品)。以每个位点0.15至0.25mL的体积将测试和对照制品注射到指定的给药位置中。

在注射后以及被杀死前立即进行临床观察和皮肤评分(红斑和水肿)，之后分别在2周、5周和8周时对一只指定的动物进行安乐死。在研究期间进行每天的观察。在处死后，收集植入位点和引流淋巴结(如果可识别)，粗略地对刺激进行评价，并交由组织学研究。

总的来说，向兔子耳朵模型中注射原位聚合胶原带来极小至温和程度的刺激和炎症。组织响应与对照样品的组织响应相当。

实施例9。

评价兔子中原位聚合胶原的局部组织应答

将根据实施例4制备的原位聚合猪胶原溶液注入兔子的皮下组织，并根据ISO10993.6，Biologicalevaluationofmedicaldevices-Part6:Testsforlocaleffectsafterimplantation评价局部组织应答。

皮下植入原位聚合猪胶原溶液、赞助者提供的对照制品和阴性对照制品以及位置标记物，并在4周和12周时(每间隔)处死三只动物。切除皮下组织，并肉眼检查植入位点。对每只动物的代表性植入位点用显微镜进行评价，以进一步确定任何组织应答。

在4周和12周时，相对于赞助者提供的对照和阴性对照制品，肉眼可见的反应并不明显。在4周和12周时，在显微镜下，所测试的制品保持完整，且与赞助者提供的对照和阴性对照制品相比，被归类为是无刺激的。对所测试样品的其它显微镜分析表明，从4周至12周时体积保持不变，并且样品与周围组织整合。

实施例2、3、6、8和9中所示的临床观察和组织学结果表明了该新型原位聚合胶原原位聚合胶原组合物优异的生物相容性和体内耐久性。实施例3中所示的在6个月时的耐久性超过了针对大多数用于软组织填充的可注射的胶原基组合物所临床报道的耐久性。

实施例10。

聚合的原位聚合胶原的透射电镜分析

聚合方案：在35℃，将如实施例4中所制备的约0.1mL的原位聚合胶原加入微量离心管中的1mL2X磷酸盐缓冲盐水(pH7.2)中。8至10分钟后，将聚合的胶原样品滴加(一滴)到TEM制备室的小格中(直径为～2mm)。然后弃掉多余样品，形成薄膜。加入造影剂以用于TEM分析。TEM显微照片显示具有清晰条带的胶原原纤维(图5)。

实施例11。

证实抗胶原酶活性

进行该研究以确定可原位聚合的胶原组合物的胶原酶抑制。在测试前，使作为对照制品的纯胶原原纤维和如实施例4中所述制备的测试用胶原溶液聚合，以模拟体内的类似条件。在胶原酶降解之前进行羟脯氨酸试验，以确保在该研究中使用相同量的胶原。在胶原酶降解后进行羟脯氨酸试验以测量在反应后的残留胶原。

结果显示，相比于标准胶原样品，含有35mMEDTA的测试用胶原对胶原酶降解的耐受性增加约35％。

实施例12

证实杀菌活性

进行该研究以评价可原位聚合胶原组合物的杀菌活性。将如实施例4中所述制备的可原位聚合胶原的两个测试样品Lot0022暴露于金色葡萄球菌。在测试前使测试样品聚合形成支架(scaffold)，从而模拟体内类似条件。通过SEM成像来评价抗微生物效果。将样品暴露于细菌溶液(～100CFU/mL)，保持两天。从细菌溶液中取出胶原支架，用1X的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并用定影溶液(0.1M二甲砷酸盐缓冲液中的2％多聚甲醛和2％戊二醛)处理，并在显影前用纯净水洗涤。SEM显微镜照片清楚地表明不存在细菌菌落。

实施例13。

原位聚合胶原溶液作为涂层的用途

用原位聚合胶原溶液涂布五种不同材料。

1.不锈钢盘(光滑的以及用50号粒度和220号粒度的砂纸磨粗的表面)

2.钛骨螺钉

3.聚丙烯缝线(Prolene)

4.聚丙烯网(轻型，Bard)

5.PEEK(聚醚醚酮)骨螺钉(Smith和Nephew)

粘性可溶性胶原在所有材料上形成厚涂层。将样品置于培养皿中以聚合并干燥。干燥后，涂层非常薄且透明，并且在一些材料样品上很难被发现。

使用以下方法中的至少一种对该膜进行表征：

1.亮视野显微镜–使用Nikon倒置显微镜来捕捉RPC的透明涂层。该显微镜图像提供了对涂层厚度的测量。

2.扫描电镜(SEM)–使用SEM(次级电子)成像来研究涂层的整体性和品质。

3.FTIR光谱–需要在之前和之后扫描聚合物材料以确定胶原涂层的存在。

4.滴形分析器–在涂布前和涂布后确定金属盘的表面能，以确定接触角/表面能的变化。

5.稳定性测试–在涂层聚合后，将经涂布的材料置于PBS中，并在37℃下培养30天，以确定涂层的稳定性。30天后，取出该材料，并进行亮视野显微镜分析，以确定涂层稳定性和厚度。

结果显示，在聚合物缝线和聚合物网上存在光滑且一致的胶原涂层。类似地，抛光的不锈钢盘被原位聚合胶原溶液有效涂布。总的来说，所述原位聚合胶原组合物聚合并粘附于金属和聚合物材料上，且在37℃被暴露于磷酸盐缓冲盐水30天后稳定。

由上述可见，本发明较好地适用于实现上述所有目的和目标，同时还带来其它本发明显而易见且固有的优点。

由于可在不背离本发明范围的前提下由本发明获得多种可能的实施方案，应理解此处所述或附图中所示的所有情况都应被理解为是说明性的，而并非限制性的。

尽管已显示并讨论了具体的实施方案，但当然可做出各种改变，且本发明不限于此处所述的部分和步骤的具体形式和排列，除非这些限制被包括在以下权利要求中。此外，应理解具体的特征和亚组合具有实用性，并可使用，而无须参照其它特征和亚组合。这被权利要求所考虑，并落入权利要求的范围内。

Claims (32)

1.可注射的酸溶性胶原组合物，其包含：

中性溶液，该中性溶液包含酸溶性胶原、EDTA和多元醇，

其中所述组合物在中性pH下为可注射的，且

其中所述酸溶性胶原在暴露于含离子的流体后即聚合。

2.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含浓度为5至70mg/ml的所述酸溶性胶原。

3.权利要求2的组合物，其中所述酸溶性胶原在所述组合物中的浓度为25至65mg/ml。

4.权利要求3的组合物，其中所述酸溶性胶原在所述组合物中的浓度为20至40mg/ml。

5.权利要求1的组合物，其中所述EDTA为EDTA二钠。

6.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含浓度为10至50mM的所述EDTA。

7.权利要求6的组合物，其中EDTA在所述组合物中的浓度为25至40mM。

8.权利要求7的组合物，其中EDTA在所述组合物中的浓度为30至35mM。

9.权利要求1的组合物，其中所述多元醇为糖醇。

10.权利要求9的组合物，其中所述多元醇为D-甘露醇。

11.权利要求1的组合物，其中该组合物包含浓度为2.5％至4％的所述多元醇。

12.权利要求11的组合物，其中所述多元醇在组合物中的浓度为3.0％至3.9％。

13.权利要求1的组合物，进一步包含二糖。

14.权利要求13的组合物，其中所述二糖选自蔗糖和果糖。

15.权利要求1的组合物，其中所述组合物通过27号针头或插管是可注射的。

16.权利要求1的组合物，其中所述组合物在暴露于所述组织后的10至120秒内聚合成凝胶块。

17.权利要求16的组合物，其中所述组合物在暴露于所述组织后的10至60秒内聚合成凝胶块。

18.权利要求1的组合物，其中所述组合物在暴露于所述组织后的10分钟内形成胶原原纤维基质。

19.权利要求18的组合物，其中所述组合物在暴露于所述组织后的5分钟内形成胶原原纤维基质。

20.权利要求1的组合物，其中所述组合物具有280–360mmol/kg的渗透压。

21.用于填充软组织的方法，包括：

向软组织缺陷中注射酸溶性胶原组合物，所述组合物包含：

包含酸溶性胶原和EDTA的中性溶液，

其中所述组合物在中性pH下是可注射的，且

其中所述酸溶性胶原在暴露于组织后即聚合。

22.权利要求21的方法，其中所述软组织缺陷选自皱纹、皮肤褶皱、皮肤松弛、皮肤轮廓缺陷、皮肤细纹、皮肤纹理和皮肤不均。

23.权利要求21的方法，其中所述注射是注入唇部或面部皮肤的软组织缺陷中。

24.权利要求21的方法，其中所述酸溶性胶原在暴露于所述组织后形成胶原原纤维基质，且所述基质在所述注射后保持至少4周的耐久性。

25.权利要求24的方法，其中所述基质在所述注射后保持至少12周的耐久性。

26.权利要求25的方法，其中所述基质保持至少6个月的耐久性。

27.权利要求21的方法，其中所注射的所述组合物产生组织再生。

28.权利要求21的方法，其中所注射的所述组合物与组织的基质整合。

29.权利要求21的方法，其中所述酸溶性组合物形成填充软组织缺陷的胶原原纤维基质。

30.生物相容性医学植入物，其中所述植入物包含：

由聚合物或金属组成的植入物，和

覆盖所述植入物的至少一部分的中性酸溶性胶原组合物涂层，

其中该胶原组合物在所述植入物的表面上固化。

31.权利要求30的植入物，其中所述涂层在所述植入物上保持稳定至少30天。

32.权利要求30的植入物，其中所述胶原组合物为权利要求1的组合物。