CN104399118B - 一种神经生长因子可注射原位水凝胶、制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及神经生长因子原位可注射水凝胶、制备及其应用。它是在透明质酸和壳聚糖盐酸盐的水溶液体系中加入EDC和NHS，在酸性条件下使透明质酸在EDC/NHS作用下生成HA‑NHS‑活性酯中间体后，再加入神经生长因子得到的。该水凝胶具有pH敏感特性，能在人体生理条件下完成溶液‑凝胶的转变过程，其注射到神经组织后，会在神经受损部位受体内pH的作用下原位固化，避免外科手术的创伤性。之后利用该水凝胶的环境敏感特性，可以实现NGF在体内缓慢释放，有效解决NGF因半衰期短、扩散或降解过快所造成的活性降低、突释等问题，保持NGF较好的生物活性，促进神经轴突延伸和髓鞘化，从而达到修复神经的目的。
Description
技术领域
本发明属于神经组织工程和再生医学领域，具体涉及一种神经生长因子可注射原位水凝胶、制备及其在神经修复方面的应用。
背景技术
周围神经损伤是临床上的一种常见病症。目前，临床上一般采用神经吻合、自体神经移植、同种异体神经移植、自体非神经组织移植、生物材料替代等方法来进行神经修复。其中，将生物材料加工成管状结构的神经导管是目前研究的重点。但是当遇到长距离，粗大神经的缺损时，这类单纯由生物材料制成的导管由于缺乏生物活性物质等微环境物质的支持，取得的修复效果非常有限。
神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是具有神经元营养和促突触生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。然而，NGF生物半衰期短，不能长期有效促进神经再生；并且NGF易遭受化学结构破坏或被其他化学物质修饰而失去生物活性，使其使用受到限制。所以，设计一种NGF缓控释体系以实现NGF在修复神经的过程中稳定持续释放，在促进神经轴突延伸和髓鞘化的同时，持续发挥神经细胞营养效应，促进受损神经的修复，已成为周围神经修复的研究热点。
近年来，随着智能水凝胶的发展，可注射原位水凝胶作为一种新型水凝胶成为水凝胶研究中的热点之一。所谓可注射原位水凝胶是指注射前为流动的液体，通过注射器注入皮下组织或肌肉组织后，在注射部位原位凝胶化，形成具有一定空间结构和强度的水凝胶。由于其形成机制是利用高分子材料对外界剌激(比如pH值、温度、离子浓度等)的响应，使聚合物在生理条件下发生状态或构象的变化，完成溶液向凝胶的转化过程。因此，这类水凝胶在生理条件下较强的实用性受到了研究者的广泛关注。在组织工程领域，可注射原位凝胶类材料也适应了微创伤技术发展的要求，具有微创伤修复组织缺损或畸形、组织损伤小、不破坏修复区血供、操作简便易行等优点，具有良好的应用前景。
一种理想的可注射性原位水凝胶材料，常需具备以下几个条件：(1)注射前能保持低粘度溶胶状，易于注射：(2)注射后凝胶化立即发生，并在短时间内完成；(3)凝胶可生物降解或可逐渐溶解，降解产物是可生物吸收的；(4)凝胶自身(包括促使原位凝胶化的添加剂)及其降解产物都具有良好的生物相容性；(5)对于药物缓释体系需满足所载药物呈现一定的缓释规律，而作为组织工程支架要求有良好的细胞粘附能力等。
壳聚糖(chitosan,CS)是一种天然的碱性多糖，具有低毒性、良好的生物相容性和生物降解性的特点。此外，壳聚糖还具有抗血栓、促进伤口愈合及软、硬组织的重建等生物活性，广泛应用于生物医药领域。壳聚糖作为NGF的载体或直接用于周围神经缺损的修复，均取得了一定的成功。透明质酸(hyaluronic acid,HA)是一种天然聚阴离子聚合物，同时也是细胞外基质的重要成分之一，广泛存在于人体的大部分器官和组织中，对细胞增殖、分化以及稳定细胞与组织的表型等，均有重要作用。目前已有大量研究证明HA凝胶对神经轴突的生长有促进作用。同时，高浓度、高分子量的HA还具有抑制淋巴细胞、单核细胞和成纤维细胞的迁移，减轻炎症反应，形成免疫屏障的作用，具有很高的利用价值。
虽然将CS和HA用于组织工程有很多优势，但将它们单独制成的水凝胶存在力学强度较低，在体内易出现坍塌，也易出现炎症反应等缺点。所以，CS或HA水凝胶单独作为神经修复用支架材料存在很大的不足。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种神经生长因子原位可注射水凝胶、制备及其应用。该水凝胶具有pH敏感特性，能在人体生理条件下完成溶液-凝胶的转变过程，其注射到神经组织后，会在神经受损部位受体内pH的作用下原位固化，避免外科手术的创伤性。之后利用该水凝胶的环境敏感特性，可以实现NGF在体内的缓慢释放，有效解决NGF因半衰期短、扩散或降解过快所造成的活性降低、突释等问题，保持NGF较好的生物活性，促进神经轴突延伸和髓鞘化，从而达到修复神经的目的。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种神经生长因子原位可注射水凝胶，其特征在于：它是在透明质酸(HA)和壳聚糖盐酸盐的水溶液体系中加入EDC和NHS，在酸性条件下使透明质酸在EDC/NHS作用下生成HA-NHS-活性酯中间体后，再加入NGF(神经生长因子)而得到的。
按上述方案，所述的酸性条件为调节体系pH为4.7-6.0。
按上述方案，所述壳聚糖盐酸盐和透明质酸的质量比为0.5-2.5：1。
按上述方案，所述神经生长因子原位可注射水凝胶在人体生理环境下通过HA-NHS-活性酯中间体与壳聚糖盐酸盐中的NH2基团进行酰胺反应完全转变为凝胶。
按上述方案，所述神经生长因子原位可注射水凝胶转变得到的凝胶的孔径范围为0.5-10微米。
一种神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)在透明质酸(HA)的水溶液中逐渐加入壳聚糖盐酸盐，磁力搅拌使其混合均匀后将pH调至4.7-6.0，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使体系中EDC和NHS的摩尔质量分别为10～70mM和10～70mM，反应1～6小时后即得HA-CS溶胶体系；
(2)在步骤(1)中制得的HA-CS溶胶体系中加入NGF(神经生长因子)，搅拌使其混合均匀即得。
按上述方案，所述步骤(1)的搅拌温度为0-4℃。
按上述方案，所述步骤(2)的搅拌温度为0-4℃。
按上述方案，所述步骤(2)中每毫升HA-CS溶胶体系所需的NGF的用量为25-75ng。
上述神经生长因子原位可注射水凝胶在神经修复方面的应用。
本发明通过选择类细胞外基质成分壳聚糖(CS)盐酸盐和细胞外基质成分透明质酸(HA)，利用HA上的修饰基团-COOH以及CS上的修饰基团-NH2，选择无细胞毒性且组织相容性好的酰胺交联剂1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)完成原位水凝胶的制备过程。首先，在酸性条件下，EDC/NHS与HA上的修饰基团-COOH合成HA-NHS-活性酯中间体，之后当pH值逐渐升高并到达人体生理pH时(7.4左右)，随着HA-NHS-活性酯中间体与CS盐酸盐上的修饰基团氨基酰胺反应的完成，即可响应生理pH实现溶液-凝胶转变。具体机理见图1。
本发明的有益效果：
1.本发明根据“仿生”的原理，制备出的能在人体生理环境(pH7.4左右)的条件下完成溶液-凝胶的转变过程可注射的HA-CS原位水凝胶，改善了单独运用HA水凝胶或者CS水凝胶所具有的力学强度较低，稳定性较差等缺点，形成优势互补。同时实现对细胞外基质功能的模拟，为神经再生提供良好“微环境”。将该水凝胶应用于周围神经组织，一方面可以充分发挥其具有的原位凝胶化并缓慢释放NGF的优势，另一方面也可以充分填充于复杂形状缺损的神经组织，避免手术的创伤性，减少患者的痛苦、加速愈合。为周围神经修复用材料提供新思路。目前，将可注射原位水凝胶作为生物载体携带神经生长因子NGF治疗周围神经修复的研究至今尚未见到报道。具体地，本发明提供的神经生长因子原位可注射水凝胶具有以下特性：
1)凝胶材料组成的“仿生”性
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶充分发挥了HA和CS材料本身的优点、形成了优势互补，有望改善单独运用HA水凝胶或者CS水凝胶所具有的力学强度较低，稳定性较差等缺点。此外，该缓控释体系在结构组成上实现了对细胞外基质功能的模拟，以期具有良好的生物相容性。
2)凝胶系统形成的智能性
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶是在人体生理pH的诱导下完成的溶液-凝胶转变过程，具有较强的实用性。在合成过程中用到的EDC和NHS也是无细胞毒性且组织相容性好的交联剂，减少了体系的毒副作用，有效避免了NGF易遭受化学结构破坏或被其他化学物质修饰而失去生物活性的缺点。
3)NGF释放的控释性
利用水凝胶响应于体内pH值发生交联、溶胀、降解的特点，通过调节凝胶的结构参数、孔隙大小，实现了NGF在体内的缓慢释放。可以有效的解决NGF半衰期短，避免因扩散过快和降解过快造成的活性降低、突释等问题，提高NGF在体内的利用率和安全性。
4)给药途径的便捷性
通过将溶液注射到体内，原位形成凝胶，这就为NGF提供了一种很便捷的给药途径。从移植的观点看，目前临床上常用的神经导管必须填满受损部位，这就需知道受损部位的几何尺寸，然后按照该几何尺寸在体外进行支架的制作，且需进行外科操作。相比之下，通过注射器直接把流动态的水凝胶送入体内，使其通过体内pH值的感应形成凝胶，给药途径非常方便。
5)神经修复的微创性
和利用生物材料制成神经导管来修复神经相比，将HA-CS-NGF可注射凝胶应用于周围神经组织，是通过注射的方法将具有一定流动性的生物材料注射到体内原位形成水凝胶，不需要手术的方法植入，避免了手术的创伤性，满足了微创伤技术发展的要求，有利于减少患者的痛苦，加速愈合。
6)支架形状的可塑性
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶可以很容易充满整个具有不规则形状的神经缺损部位，以达到支架和周围受损神经组织密切接触的目的。避免了预塑型支架材料难以与修复部位吻合的缺陷，有助于更好的修复不规则和复杂的神经缺损，为周围神经修复用材料提供新思路。
7)系统制备的简易性
本发明提供的制备方法，方法简便，实施条件温和，成本较低，环境污染少，对组织工程化治疗神经修复的临床开展具有重要意义。
8)系统适用的广泛性
2.本发明提供神经生长因子原位可注射水凝胶还可用于其它不同生长因子、蛋白质药物以及基因等，从而进一步扩大其运用范围，具有广泛适用性。
3.本发明提供的神经生长因子原位可注射水凝胶制备方法简单，易于实施。
附图说明
图1：HA-CS可注射原位水凝胶的形成原理示意图。
图中，(a)HA与EDC/NHS在酸性条件下生成HA-NHS活性酯中间体；(b)HA-NHS活性酯中间体与CS在人体生理条件下生成水凝胶；照片分别为HA-CS溶胶和HA-CS水凝胶。
图2：实施例1的HA-CS水凝胶的红外光谱图。
图3：实施例1的HA-CS水凝胶的SEM图。
图4：HA-CS-NGF原位水凝胶的体外失重率曲线图。
图5：NGF的体外累计释放率曲线图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。
实施例1
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的制备
(1)在4℃冰浴的条件下，将0.1g的HA加入到10ml去离子水中，磁力搅拌50min使其充分溶解，再逐渐加入0.1gCS盐酸盐，磁力搅拌1h使其混合均匀后将pH调至4.7，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使EDC和NHS的摩尔质量分别为30mM和30mM，反应2小时后即得HA-CS溶胶。
(2)将(1)中制得的HA-CS溶胶与0.5μg/ml的NGF溶液0.5ml在4℃下混合，并搅拌30min使其混合均匀即得。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌表征
调整上述制备的体系的pH至7.4并置于37℃恒温水浴中(模拟人体生理环境)，直至瓶中溶胶不能完全流动时，真空冷冻干燥12～48h后备用。
采用压片法对上述冷冻干燥后的水凝胶样品进行红外检测。取2-3mg干燥后的水凝胶样品与200-300mg干燥的KBr粉末在玛瑙研钵中混匀，充分研磨后在压模下压片。取出压好的薄片夹在样品架上，在红外光谱仪上检测。波数范围：400-4000cm-1。红外图谱见图2。红外图谱表明：HA-CS水凝胶的红外图谱出现了酰胺基团的特征峰，其中1646cm-1 处的吸收峰为酰胺(-CONH-)中羰基C＝O的伸缩振动峰(酰胺I峰)，1566cm-1 处出现的吸收峰为N-H的面内弯曲振动峰(酰胺II峰)。这说明：HA-CS原位凝胶在形成的过程中，HA中的-COOH与CS中的-NH2成功发生了交联反应形成酰胺。用扫描电镜(SEM)对样品横截面微观形态进行检测，SEM图见图3。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为1微米，较大的为10微米。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
取1mL上述1制备的体系置于10mL玻璃试管内，调整pH为7.4后于37℃水浴中(模拟人体生理环境)，直至瓶中溶胶不能完全流动时，形成凝胶。然后将凝胶放入37℃的PBS溶液中，并于水浴摇床中恒温振荡(37±1℃，50±5rpm)降解。降解时间分别为1、2、3、7、9、11天等。降解到相应的时间后，取出样品，用去离子水洗涤，检测失重率。经检测：本发明的水凝胶在15天之内失重率达到65％。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
在超净工作台下，将上述2制得的冷冻干燥后的水凝胶样品置入灭菌过的5mL离心管，加入3mL磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)，之后将离心管置于37℃恒温振荡培养箱(60r/min)，在预设时间点(6h、12h、1d、3d、5d、7d等)将缓释液取出，于-70℃保存，并加入等量的磷酸缓冲溶液，继续均匀摇动，浸提液的制备过程均应保证无菌。然后利用NGF-ELISA试剂盒的方法测定特定时间缓释液中NGF的精确含量。20天之内累计释放量达到60％。
实施例2
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的制备
(1)在4℃冰浴的条件下，将0.2g的HA加入到10ml去离子水中，磁力搅拌50min使其充分溶解，再逐渐加入0.1gCS盐酸盐，磁力搅拌1h使其混合均匀后将pH调至5.4，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使EDC和NHS的摩尔质量分别为70mM和30mM，反应1小时后即得HA-CS溶胶。
(2)将(1)中制得的HA-CS溶胶与0.75μg/ml的NGF溶液0.5ml在4℃下以一定的比例混合，并搅拌30min使其混合均匀，即得。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌表征
调整上述制备的体系的pH至7.4并置于37℃恒温水浴中(模拟人体生理环境)，直至瓶中溶胶不能完全流动时，真空冷冻干燥12～48h后备用。
参考实施例1的表征方法对.HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌、进行表征。红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜(SEM)对样品横截面微观形态进行检测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为0.5微米，较大的为5微米。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
经检测：本发明的水凝胶15天之内失重率达到90％。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
经检测：本发明的水凝胶20天之内累计释放量达到50％。
实施例3
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的制备
(1)在4℃冰浴的条件下，将0.2g的HA加入到10ml去离子水中，磁力搅拌50min使其充分溶解，再逐渐加入0.3gCS盐酸盐，磁力搅拌1h使其混合均匀后将pH调至6，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使EDC和NHS的摩尔质量分别为10mM和10mM，反应2小时后即得HA-CS溶胶。
(2)将(1)中制得的HA-CS溶胶与1μg/ml的NGF溶液0.5ml在4℃下以一定的比例混合，并搅拌30min使其混合均匀，即得。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌表征
调整上述制备的体系的pH至7.4并置于37℃恒温水浴中(模拟人体生理环境)，直至瓶中溶胶不能完全流动时，真空冷冻干燥12～48h后备用。
参考实施例1的表征方法对.HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌、进行表征。红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜(SEM)对样品横截面微观形态进行检测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为1微米，较大的为7微米。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
经检测：本发明的水凝胶15天之内失重率达到80％。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
经检测：本发明的水凝胶20天之内累计释放量达到30％。
实施例4
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的制备
(1)在4℃冰浴的条件下，将0.1g的HA加入到10ml去离子水中，磁力搅拌50min使其充分溶解，再逐渐加入0.2gCS盐酸盐，磁力搅拌1h使其混合均匀后将pH调至5.4，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使EDC和NHS的摩尔质量分别为10mM和40mM，反应0.5小时后即得HA-CS溶胶。
(2)将(1)中制得的HA-CS溶胶与1.25μg/ml的NGF溶液0.5ml在4℃下以一定的比例混合，并搅拌30min使其混合均匀，即得。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌表征
调整上述制备的体系的pH至7.4并置于37℃恒温水浴中(模拟人体生理环境)，直至瓶中溶胶不能完全流动时，真空冷冻干燥12～48h后备用。
参考实施例1的表征方法对.HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌、进行表征。
红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜(SEM)对样品横截面微观形态进行检测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为1微米，较大的为5微米。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
经检测：本发明的水凝胶20天之内失重率达到30％。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
经检测：本发明的水凝胶15天之内累计释放量达到30％。
实施例5
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的制备
(1)在4℃冰浴的条件下，将0.1g的HA加入到10ml去离子水中，磁力搅拌50min使其充分溶解，再逐渐加入0.25gCS盐酸盐，磁力搅拌1h使其混合均匀后将pH调至4.7，然后称取一定质量的EDC和NHS于上述反应液，使EDC和NHS的摩尔质量分别为10mM和70mM，反应6小时后即得HA-CS溶胶。
(2)将(1)中制得的HA-CS溶胶与1.5μg/ml的NGF溶液0.5ml在4℃下以一定的比例混合，并搅拌30min使其混合均匀，即得。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌表征
参考实施例1的表征方法对.HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的结构、形貌、进行表征。
红外结果表明成功生成酰胺。用扫描电镜(SEM)对样品横截面微观形态进行检测。扫描电镜观察到水凝胶孔径较小的为2微米，较大的为10微米。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的降解性表征
经检测：本发明的水凝胶18天之内失重率达到60％。
HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
参考实施例1的表征方法对HA-CS-NGF可注射原位水凝胶的累计释放量表征
经检测：本发明的水凝胶13天之内累计释放量达到50％。
Claims (3)
1.一种神经生长因子原位可注射水凝胶，其特征在于：它是在透明质酸和壳聚糖盐酸盐的水溶液体系中加入EDC和NHS，在酸性条件下使透明质酸在EDC/NHS作用下反应1~6小时后生成HA-NHS-活性酯中间体后，即得HA-CS溶胶体系，然后再在0-4℃加入NGF而得到的，其中：透明质酸和壳聚糖盐酸盐的水溶液体系中EDC和NHS的摩尔质量分别为10~70mM和10~70mM，每毫升HA-CS溶胶体系所需的NGF的用量为25-75ng；所述的酸性条件为调节体系pH为4.7-6.0，所述壳聚糖盐酸盐和透明质酸的质量比为0.5-2.5：1；
所述的神经生长因子原位可注射水凝胶在人体生理环境下通过HA-NHS-活性酯中间体与壳聚糖盐酸盐中的NH2基团进行酰胺反应完全转变为凝胶，所述神经生长因子原位可注射水凝胶转变得到的凝胶的孔径范围为0.5-10微米。
2.权利要求1所述的神经生长因子原位可注射水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)在透明质酸的水溶液中逐渐加入壳聚糖盐酸盐，磁力搅拌使其混合均匀后将pH调至4.7-6.0，得到反应液，然后称取一定质量的EDC和NHS加于上述反应液，使反应液体系中EDC和NHS的摩尔质量分别为10~70mM和10~70mM，反应1~6小时后即得HA-CS溶胶体系；所述壳聚糖盐酸盐和透明质酸的质量比为0.5-2.5：1；
(2)在步骤(1)中制得的HA-CS溶胶体系中加入NGF，每毫升HA-CS溶胶体系所需的NGF的用量为25-75ng；搅拌使其混合均匀即得，所述步骤(2)的搅拌温度为0-4℃。
3.权利要求1所述的神经生长因子原位可注射水凝胶在制备用于神经修复的药物方面的应用。
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