CN104144714A - 交联透明质酸线及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明整体涉及性质改善的包含交联透明质酸的线、制备此类线的优化方法及其例如在美学应用(例如，面部外形修复、软组织填充产品)、手术(例如，缝合)、药物递送、负压伤口治疗、湿性伤口敷料等中的用途。

Description

交联透明质酸线及其使用方法

相关申请案的交叉引用

本申请根据美国法典第35条第119款要求2011年10月11日提交的临时申请第61/545,962号、2011年12月7日提交的临时申请第61/568,077号和2012年5月9日提交的临时申请第61/644,945号的利益，这些临时申请各自整体并入本文。

技术领域

本发明整体涉及透明质酸线、制备此类线的优化方法及其例如在美学应用(例如，面部外形修复、真皮填充)、手术(例如，缝合)、药物递送、负压伤口治疗、湿性伤口敷料等中的用途。

发明背景

透明质酸(HA)是由交替键合的β-D-N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸的重复二糖单元组成的线性多糖(即，非硫酸化糖胺聚糖)，其可用下式表示：

其中n是重复单元的数量。透明质酸有时以(-4GlcUAβ1-3GlcNAcβ1-)_n)命名并且是(例如)在结缔组织、上皮组织和神经组织中发现的细胞外基质的主要组分。天然透明质酸由于其缺乏种属和器官特异性而高度生物相容并且常常在组织工程学中用作生物材料而在软组织填充产品中用作常见成分。

由于迅速的酶促降解和水解，天然透明质酸的体内稳定性弱，并且相应地，已经合成了各种经化学修饰形式的透明质酸(例如，交联形式、离子修饰形式、酯化形式等)来解决这个问题。目前，呈各种凝胶形式使用透明质酸或其交联形式，例如作为软组织填充产品、粘连屏障物等。

然而，组织借助于透明质酸或其交联形式的凝胶作为软组织填充产品而存在。第一，分配透明质酸或其交联形式的凝胶所需的力非线性，可引起许多医师报告的在使用可注射透明质酸凝胶时，最初喷出凝胶“团”。第二，将透明质酸凝胶精确分配到特定位置会很难，因为此类凝胶的机械强度很小。此外，凝胶将占据阻力最小的空间，这使其在许多应用(例如，细小皱纹的治疗)中的使用成问题，因为凝胶往往会移到意想不到的空间区域，致使整容过程很困难并且甚至可能很危险。第三，作为液体或凝胶注入治疗部位的许多常用软组织填充产品，例如(透明质酸)、(透明质酸)、(羟磷灰石钙)、(聚-L-乳酸)和(透明质酸)能够迁移和/或引起治疗很痛苦的难看“肿块”。第四，不推荐将这些软组织填充产品用于眼周，因为从注射部位迁移可引起失明、组织坏死并且在罕见情况下甚至引起中风。最后，临床医师还发现使用这些填料进行丰唇耗费时间并且患者发现对该区域的治疗如此痛苦以致通常进行神经阻滞。

相应地，已经开发了不管组织阻力如何，可均匀分配到特定位置，并且在移植时没有迁移风险的线状形式的透明质酸及其交联形式。因为这些线状形式的抗拉强度增强且更易递送，所以它们有利。

由于线状形式的透明质酸的显著治疗潜力，仍然需要开发将产生具有优异物理性质的具有改善的线和软组织填充产品的反应条件和制备方案。

发明概述

已开发出包含交联透明质酸的线。已经意外地发现，对组分的相对量、反应条件、透明质酸的共价修饰和制备方法的改变(正如全篇所述)将对包含交联透明质酸的线的某些性质有显著影响。

一方面，提供了一种包含交联透明质酸的组合物，由所述组合物制成如本文所述的线。例如，在一个实施方案中，提供了包含至少5％透明质酸的凝胶组合物，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物大体上交联。还涵盖包含交联透明质酸，其进一步包含粘合剂，例如非交联透明质酸的组合物。

本文所述的线可使用包含大体上交联的透明质酸的组合物制备，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物大体上交联。已经发现，使用用于制备大体上交联的透明质酸的交联剂(即BDDE)浓度调节和/或改善线的某些物理性质。另外，在某些实施方案中，所述组合物在交联之前包含至少5％透明质酸，例如8％、10％或12％透明质酸。

此外，如本文所述的线包含交联和非交联透明质酸。意外地，发现这两种组分的相对浓度影响了线的某些物理性质，这最终导致作为软组织填充产品的体内有效性增加。

另外，如本文所详述，线制备方法的各个方面(例如，冲洗、除气、挤出和干燥前体凝胶以及干线的最终灭菌)可改变以制备物理特性改善的线。具体而言，已经通过相对于透明质酸的重复二糖单元的显著交联(例如，至少约15％BDDE衍生物)制备了包含交联透明质酸的线。考虑到在交联透明质酸中这种增强的交联会产生具有更长体内半衰期的线。

与本领域中先前描述的透明质酸线相比，本文所述的透明质酸线具有增加的体内半衰期。当植入兔子背部时，本领域中描述的灭菌线在30天内被完全再吸收，而本文描述的线在3个月或在一些情况下更长时间时仍存在。

另一方面，提供了具有可通过改变本文所述的制备方法削弱的物理特性的线。例如，在一个实施方案中，提供了一种包含大体上交联的透明质酸的干线，其通过以下步骤来制备：a)通过使透明质酸与BDDE接触来形成大体上交联的透明质酸组合物；b)向所述组合物中添加非交联透明质酸；c)挤出大体上交联的组合物以形成湿线；和d)干燥所述湿线以形成干线。

在其方法实施方案的一个中，提供了一种治疗有需要的受试者的皱纹的方法。在这样的一个方面，将线插入患者的邻近皱纹或在皱纹下面的皮肤。然后在皱纹下面施加线，从而治疗皱纹。在一个实施方案中，在暴露于体液或通过手动水合时，线会在水合时膨胀并且这种膨胀通常足以填充皱纹。因为要使插入外形的侵入性最小化，所以有利的是在水合时存在线膨胀，然而设计为不膨胀的线也可用于治疗皱纹。

在另一实施方案中，提供了一种在有需要的受试者中提供面部外形修复的方法。在这个实施方案中，将线插入患者的邻近治疗部位或在治疗部位，例如唇部、鼻唇褶和泪沟下面的皮肤中。然后施加线，从而提供面部外形修复。在一个实施方案中，将线施加到真皮组织的各个平面。在一个实施方案中，若干根线可彼此大致平行地放置而另外的线可以相对于第一组平行线大致垂直的方向放置，从而形成网状结构，其集合效应是对较大缺陷或更广泛的缺陷例如眼部的泪沟或眶下区进行外形修复。

还涵盖了包含所述线的部件的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含递送所述线的装置。递送装置可为注射器或针。

又一方面，提供了使用透明质酸线作为软组织填充产品、面部外形修复、粘连屏障物、伤口敷料(包括负压伤口敷料)、缝合线等的方法。还提供了例如在手术、眼科学、伤口闭合、药物递送等中使用透明质酸线的方法。下面更加详细地讨论了这些以及其它实施方案。

附图简述

当结合附图阅读时，通过下列详细描述可最充分地理解某些方面。要强调的是，根据惯例，附图的各个特征未按比例。相反，各个特征的尺寸为清楚起见可任意扩大或缩小。附图中包括下列各图：

图1示出与丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联的透明质酸的示意图。

图2示出整体附着于针的近端的线(N＝针；T＝线)。

图3A和3B示出附着于线的针(N＝针；T＝线)。图3A示出插入针内径的线的近视图；图3B示出具有与针搭接的线的实心针的近端的近视图。

图4A-4F示出皱纹的治疗。图4A示出人眶周区中的细小、面部皱纹；图4B示出插入内侧缘的皱纹皮肤的针和线；图4C示出经调整穿过皱纹下方的针；图4D示出在皱纹侧缘退出的针；图4E示出已经将线拉入其先前在皱纹下方占据的位置的针；并且图4F示出植入皱纹下方的线，多余的线已经被截去。

图5A-5C示出皱纹的治疗。图5A示出褶皱或皱纹的横截面视图；图5B示出植入皱纹下方尚未水合的线；并且图5C示出植入皱纹下方完全水合并且已经使皱纹的表面外观变平的线。

图6示出可如何使用针和线将线放置在特定线性位置以促进特定线上的神经或血管再生。

图7A示出用于泪沟中的面部外形修复的线(线1、2、3、4、5和6)以相对平行取向的放置。此图还示出用于鼻唇褶的面部外形修复的线的放置(线7和8)。图7B示出用于泪沟中的面部外形修复的线的替代性放置(线1、2、3、4、5、6、7和8)。

图8A和8B以皮肤的横截面和三维横截面示出植入患者的线的预期显微解剖学的示意图。

图9A、9B、9C、9D和9E示出用由8/4015/20线组合物(磷酸盐缓冲液洗剂；15％HA固体，水中20％的HA是非交联粘合剂)制备的线治疗1个月(9A)、2个月(9B)、3个月(9C)、6个月(9D)和9个月(9E)后，兔子的组织横截面(放大倍数14×)。图9A、9B、9C、9D和9E中示出的组织学研究的详情可在实施例9中找到。

图10示出用由8/4015/20线组合物(磷酸盐缓冲液洗剂；15％HA固体，20％的HA是非交联HA粘合剂)制备的线治疗1个月后兔子的大体解剖。图10中示出的解剖详情可在实施例10中找到。

图11示出用由8/4015/20线组合物(磷酸盐缓冲液洗剂；15％HA固体，20％的HA是非交联HA粘合剂)制备的线治疗2个月后兔子的大体解剖。图11中示出的解剖详情可在实施例10中找到。

在图12和13中使用下列线命名法来描述凝胶组合物：AA/BBXX/YY，其中(AA)是透明质酸相对于交联溶液重量的重量％；(BB)是BDDE相对于透明质酸重量的重量％；(XX)是交联和非交联透明质酸“固体”相对于组合物重量的重量％；并且(YY)是非交联透明质酸相对于交联和非交联透明质酸“固体”总重量的重量％。

图12示出用透明质酸酶(1mg/mL)进行的线降解研究的结果。图12中示出的这些酶促降解的详情可在实施例7中找到。对于线A-F：A＝10/4015/20CaCl₂；B＝10/4015/40；C＝10/4015/20；D＝10/4010/50；E＝8/4015/20H₂O洗剂；F＝8/4015/20；G＝10/4015/20CaCl₂的对照；H＝10/4015/40的对照；I＝10/4015/20的对照；J＝8/4015/20的对照。垂直箭头对应添加1mg/mL的新鲜透明质酸酶。

图13示出如本文所述的示例性线的平均触诊得分。图13中示出的这些触诊研究的详情可在实施例8中找到。对于线A-F：A＝8/4015/20；B＝8/4015/20；C＝10/4010/50；D＝10/4015/20；E＝10/4015/20；F＝10/4015/40；针＝预定尺寸(20G)；最终灭菌(20kGy)；线尺寸～0.01英寸。

图14示出经一个定径步骤和多个定径步骤，凝胶直径达0.3mm²的颗粒的粒度分布。

发明详述

本文描述了大体上交联的透明质酸的线、制成所述线的组合物、其制备方法及其用途和由其形成的特定形式。然而，将首先定义下列术语。

应理解，本发明不限于描述的特定实施方案，因此当然会有所变化。还应理解，由于本发明的范围将仅受所附权利要求的限制，因此本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的而非旨在限制。

必须指出的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“一种线”的提及包括多种线。

1.定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。如本文所使用，下列术语具有下列含义。

如本文所使用，术语“包含”旨在指组合物和方法包括叙述的元素，但是不排除其它元素。当用于定义组合物和方法时“基本上由…组成”应指出于规定的目的，把对组合有任何重要意义的其它元素排除在外。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除不会实质性影响要求保护的基本和新颖特性的其它材料。“由…组成”应指将超过微量的其它成分和大体方法步骤排除在外。这些过渡性术语的每一个定义的实施方案在本发明范围之内。

用于数字名称，例如温度、时间、量和浓度，包括范围前面时，术语“约”指可变化(+)或(-)10％、5％或1％的近似值。

术语“透明质酸”或“HA”指具有下式的聚合物：

其中n是重复单元的数量。透明质酸的所有来源均可用，包括细菌和禽类来源。可用透明质酸的分子量为约0.5MDa(兆道尔顿)至约3.0MDa。在一些实施方案中，分子量为约0.6MDa至约2.6MDa并且在其它实施方案中，分子量为约1.4MDa至约1.7MDa。在一些实施方案中，分子量为约0.7MDa并且在其它实施方案中，分子量为约1.7MDa。在一些实施方案中，分子量为约2.7MDa。

如本文所述的线的至少一部分交联。术语“交联”旨在指已经通过交联剂共价连接的两条或更多条透明质酸聚合物链。此类交联区别于在单条聚合物链中或在两条或更多条链之间导致内酯、酸酐或酯形成的分子间或分子内脱水。尽管如此，预计在本文所述的线中也可能发生分子内交联。术语“交联”还旨在指与BDDE衍生物共价连接的透明质酸。在一些实施方案中，术语“交联”还指经共价修饰的透明质酸。

“交联剂”含有在两个或更多个分子之间产生共价键的至少两个活性官能团。交联剂可为同双官能(即，具有两个相同的活性末端)或异双官能(即，具有两个不同的活性末端)。在本发明中使用的交联剂应包含透明质酸官能团的互补官能团，以便可进行交联反应。在一个实施方案中，交联并未形成酯化透明质酸。仅举例而言，适合的交联剂包括丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二乙烯砜(DVS)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或其组合。在一个实施方案中，交联剂为BDDE。在一个实施方案中，交联剂不是可光固化的交联剂。

如本文所使用，术语“BDDE衍生物”指其中一个或两个BDDE环氧化物已经与透明质酸反应的BDDE形式。BDDE具有下列化学结构：

下面示出了透明质酸的BDDE衍生物的一个实例。

如上所示，透明质酸的BDDE衍生物可在具有已经反应的两个环氧化物的末端与透明质酸共价结合。本文考虑了透明质酸另外的BDDE衍生物。例如，透明质酸的某些BDDE衍生物可在两端共价结合(即，交联)在两个单独透明质酸聚合物之间，而其它BDDE衍生物可两端共价结合在单个透明质酸聚合物内。还考虑到了一端或两端与来自一种或多种本身与透明质酸共价结合的另外的BDDE衍生物的羟基共价结合的BDDE衍生物。

还考虑到了仅一端与透明质酸共价结合的BDDE衍生物。例如，其中一个环氧化物环可通过与一段透明质酸聚合物的共价连接打开，而另一个环氧化物仍然闭合(即，未反应)。还预计，在交联透明质酸组合物中，具有未反应的环氧化物的BDDE衍生物的浓度足够低，以便不影响由此类组合物制备的线的生物相容性。进一步考虑了其中一个环氧化物环已经通过与单独拉伸的透明质酸聚合物的共价连接打开，而另一个环氧化物环已经通过水解打开的BDDE衍生物。然而，预计交联透明质酸包含至少约2摩尔％(相对于二糖单体)两端共价连接在两个单独透明质酸聚合物之间的BDDE。

如本文所使用，术语“粘合剂”指在包含交联透明质酸，在挤出时形成线的组合物中，提供均匀稠度和/或粘聚力的天然存在或合成的物质。在一个实施方案中，粘合剂为非交联透明质酸。在另一实施方案中，粘合剂选自糖和多糖，例如蔗糖、麦芽糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、壳聚糖、纤维素、明胶、胶原、阿拉伯胶、淀粉、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、HPC(羟丙基纤维素)、HPMC(羟丙基甲基纤维素)、PEG、PLGA((乳酸-羟基乙酸)共聚物)、羧甲基纤维素、乙基纤维素、明胶聚氧化乙烯、糊精、硅酸镁铝、聚甲基丙烯酸酯等。

如本文所使用，术语“皮肤”指3层：表皮、真皮和下皮或深层皮下组织。

如本文所使用，术语“更光滑”、“光滑”和“光滑度”指线在被拉过组织时提供更小阻力的性质。线越光滑，在拉过皮肤时阻力越小。

如本文所使用，术语“线”指细长、柔性形式的材料。如本文所述的线在横截面中可具有在下面讨论的多种形状。

术语“极限抗拉强度”旨在指已经关于横截面积规格化的线的抗拉强度。术语“抗拉强度”旨在指受到张力时，线不破坏可承受的最大应力。在一个实施方案中，预计极限抗拉强度足以将线拉过皮肤并且一旦进入皮肤就对其进行操纵，使得线的完整性基本上不受(例如)断裂或分割的损害。预计如本文所述的线的极限抗拉强度优选为约3kpsi(“千磅每平方英寸”)或更高，或5kpsi或更高，或10kpsi或更高，或15kpsi或更高或20kpsi或更高或50kpsi或更高或75kpsi或更高。在一些实施方案中，线的抗拉强度为约0.4lbf(磅力)或更高，或0.6lbf或更高，或0.8lbf或更高，或1.0lbf或更高，或1.1lbf或更高。在一些实施方案中，线的抗拉强度为约0.7lbf。

在一些实施方案中，可通过使用测力计并且测量使线断裂所需的峰值力测量抗拉强度。在测试的约9批线中，使用20规格挤出喷嘴的平均抗拉强度为约0.71磅力。

术语“含水百分比”旨在指按重量计的总水百分比。在一个实施方案中，线的含水百分比为约30％或更低，或可选地，约15％或更低，或可选地，约10％或更低。这通常可通过卡尔-费歇尔滴定法(KarlFisher titration)测量。

如本文所述的线可制成多种形状。术语“大体上呈圆柱形”指其中线的横截面为圆形的线。用于指线的形状的术语“大体上”意指至少50％的线具有所述近似形状。术语大体上也用于涵盖沿着线的长度，具有多种形状的线。例如，线可大体上呈圆柱形，但是线的末端可为锥形。当凝胶组合物与将其挤在上面的基底的接触角具有大于约90度的平衡接触角时，可提供大体上呈圆柱形的线。

术语“大体上呈D形”指其中横截面呈D形或大体上呈半圆形的线。大体上呈D形的线具有一个扁平侧面和一个大体上呈圆形的侧面。当凝胶组合物与将其挤在上面的基底的接触角具有大于约90度的平衡接触角时，可提供大体上呈D形的线。

术语“大体上呈带状”指其中线的厚度小于线宽度的约50％的线。在一些实施方案中，横截面大体上呈矩形。当凝胶组合物与将其挤在上面的基底的接触角具有大于约90度的平衡接触角时，可提供带状线。可选地，可通过切割湿凝胶以获得所需横截面形状，形成带状线。“带状”也可包括大体上呈椭圆形的形状。术语“大体上呈椭圆形”指其中横截面大体上呈长方形或椭圆形的线。

术语“治疗剂”可包括一种或多种治疗剂。在以上实施方案的其它方面，治疗剂为麻醉剂，包括但不限于利多卡因(lidocaine)、赛罗卡因(xylocaine)、奴佛卡因(novocaine)、苯坐卡因(benzocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、罗哌卡因(ripivacaine)、普鲁泊福(propofol)或其组合。在以上实施方案的其它方面，治疗剂包括但不限于肾上腺素、麻黄碱、氨苯碱、茶碱或其组合。在以上实施方案的其它方面，治疗剂为肉毒毒素。在以上实施方案的其它方面，治疗剂为层粘连蛋白-511。在以上实施方案的其它方面，治疗剂是(例如)可用于再生关节疾病的治疗的葡萄糖胺。在以上实施方案的其它方面，治疗剂为抗氧化剂，包括但不限于维生素E或全反式视黄酸例如视黄醇。在以上实施方案的其它方面，治疗剂包括干细胞。在以上实施方案的其它方面，治疗剂为胰岛素、生长因子例如NGF(神经生长因子)、BDNF(脑源性神经营养因子)、PDGF(血小板源生长因子)或嘌吗啡胺去铁胺(PurmorphamineDeferoxamine)NGF(神经生长因子)、地塞米松(dexamethasone)、抗坏血酸、5-氮杂胞苷、4,6-二取代吡咯嘧啶、cardiogenol、cDNA、DNA、RNAi、BMP-4(骨形成蛋白-4)、BMP-2(骨形成蛋白-2)；抗生素试剂例如β内酰胺、喹诺酮(quinolone)(包括氟喹诺酮(fluoroquinolone))、氨基糖苷或大环内酯；抗纤维剂，包括但不限于肝细胞生长因子或吡非尼酮(Pirfenidone)；抗瘢疤形成剂，例如抗TGF-b2单克隆抗体(rhAnti-TGF-b2mAb)；肽例如GHK铜结合肽；组织再生剂、类固醇、纤连蛋白、细胞因子、止痛剂例如盐酸他喷他多(Tapentadol HCl)；鸦片剂(例如吗啡、考酮(codone)、羟考酮(oxycodone)等)、防腐剂、α-、β或γ-干扰素、EPO、胰高血糖素、降钙素、肝素、白细胞间素-1、白细胞间素-2、非拉司汀(filgrastim)、蛋白质、HGH、黄体化激素、心房利钠因子、因子VIII、因子IX或促卵泡激素。

术语“诊断剂”指用作诊断试验的一部分的试剂(例如，用于查看体内的线的荧光染料)。在一个实施方案中，诊断剂是可溶性TB(肺结核)蛋白。

术语“润滑增强剂”旨在指与干线接触时，起润滑干线的作用的物质或溶液。润滑增强剂可包含(例如)水和/或醇、含水缓冲液并且可进一步包含附加试剂，例如聚乙二醇、透明质酸和/或胶原。

术语“生物降解阻碍剂”旨在指减缓或防止线体内降解的生物相容性物质。例如，生物降解阻碍剂可包括疏水性试剂(例如，脂质)或牺牲性生物降解剂(例如，糖)。

术语“破坏荷载”旨在指施加给线时，引起线破坏的最大力。用“损坏”意指线可断裂或分割或另外失去结构完整性。在一些实施方案中，破坏荷载为约0.1磅或0.22kg或更高。

术语“牢固”旨在指粘聚性材料在无约束的环境中维持其形状(即与易流动/无定形材料相反)并且在压缩下展现出一定程度的结构完整性。明胶立方体是牢固凝胶的一个实例。

术语“水性凝胶组合物”或“凝胶组合物”或“凝胶混合物”旨在指包含水、透明质酸和交联剂和/或交联透明质酸的水性组合物。在一些实施方案中，组合物可进一步包含缓冲液，使得随组合物组分的添加，溶液的pH变化很小。在这些实施方案中，组合物称为含水缓冲凝胶组合物。缓冲凝胶组合物的pH通常为约7至约13。在某些实施方案中pH为约7。在某些实施方案中，pH较高为约9或约10。在一些实施方案中，可通过添加适量的适合碱，例如Na₂CO₃或NaOH调节pH。在一些实施方案中，含水缓冲凝胶组合物包含磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，含水缓冲凝胶组合物包含具有式(HOCH₂)₃CNH₂的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。在一些实施方案中，添加另外的溶质以调节摩尔渗透压浓度和离子浓度，例如氯化钠、氯化钙和/或氯化钾。

术语“缓冲液”旨在指稳定pH的溶液，其中所述溶液包含弱酸及其共轭碱或弱碱及其共轭酸的混合物。缓冲溶液包括但不限于2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、L-(+)-酒石酸、D-(-)-酒石酸、ACES、ADA、醋酸、醋酸铵、碳酸氢铵、柠檬酸铵、甲酸铵、草酸铵、磷酸铵、磷酸氢铵钠、硫酸铵、酒石酸铵、BES、BICINE、BIS-TRIS、碳酸氢盐、硼酸、CAPS、CHES、醋酸钙、碳酸钙、柠檬酸钙、柠檬酸盐、柠檬酸、二乙醇胺、EPP、乙二胺四乙酸二钠盐、甲酸溶液、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly、甘氨酸、HEPES、咪唑、醋酸锂、柠檬酸锂、MES、MOPS、醋酸镁、柠檬酸镁、甲酸镁、磷酸镁、草酸、PIPES、磷酸盐缓冲盐水、哌嗪D-酒石酸钾、醋酸钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、甲酸钾、草酸钾、磷酸氢二钾、酞酸钾、酒石酸钠钾、四硼酸钾、四草酸钾脱水物、丙酸溶液、STE缓冲溶液、5,5-二乙基巴比妥酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠、酒石酸氢钠一水合物、碳酸钠、柠檬酸钠、氯化钠、甲酸钠、草酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠、酒石酸钠、四硼酸钠、TAPS、TES、TNT、TRIS-甘氨酸、TRIS-醋酸盐、TRIS缓冲盐水、TRIS-HCl、TRIS磷酸–EDTA、三甲基甘氨酸(tricine)、三乙醇胺、三乙胺、三乙铵乙酸酯、磷酸三乙铵、三甲基铵醋酸盐、磷酸三甲铵、醋酸盐、碱、碳酸盐、盐酸盐或马来酸盐。

术语“水性溶剂”旨在指无毒、非免疫原性的水性组合物。水性溶剂可为水和/或醇，并且可进一步包含缓冲液、盐(例如CaCl₂)和其它此类非反应性溶质。

术语“接触角”或“平衡接触角”指液体对固体的亲和力的度量并且量化了放在固体上时液滴分布的程度。在本文所述的情况下，液体为水性凝胶组合物并且刚性或固体表面是将组合物挤在上面的基底。接触角是对理想液滴的边缘与扁平表面产生的角度的度量。接触角越小，表面和液体之间的吸引力越大。例如，水几乎完全分布在玻璃上并且具有接近0度的极小接触角。相反，水银结成珠并且分布很小；其接触角非常大。

2.线和制备线的方法

正如上面提到的，已经意外地发现对组分的相对量、反应条件、透明质酸的共价修饰和/或制备方法的改变会对包含交联透明质酸的线的某些性质有显著影响。相应地，已经开发了此类特性改善的线并且本文描述了其制备方法。预计此类线更光滑。下面描述的一些线更结实。它们的抗拉强度更强并且吸水的能力提高。因此预计本文所述的线更易于为临床医师操作和植入患者体内。

交联透明质酸的制备

已经根据本文描述的方法制备了包含交联透明质酸的线，交联剂(例如，BDDE衍生物)相对于透明质酸的重复二糖单元的比例增大。

通常，本文使用的透明质酸(HA)的分子量为约0.5MDa(兆道尔顿)至约3.0MDa。在一些实施方案中，分子量为约0.6MDa至约2.6MDa并且在其它实施方案中，分子量为约1.4MDa至约1.7MDa。在一些实施方案中，分子量为约0.7MDa并且在其它实施方案中，分子量为约1.7MDa。在一些实施方案中，分子量为约2.7MDa。

一方面，提供了包含在含水条件下形成的交联透明质酸的组合物。在某些实施方案中，此类水性组合物形成凝胶。在某些实施方案中，透明质酸在交联之前水合约1分钟至约60分钟。在其它实施方案中，透明质酸在交联之前水合约1小时至约12小时。在某些实施方案中，透明质酸水合约1小时，在又一实施方案中，在交联之前使透明质酸水合约2小时。在某些实施方案中，透明质酸水合约3小时，在又一实施方案中，在交联之前使透明质酸水合4小时。

添加HA之前，将水溶液调节到所需pH。在一个实施方案中，水溶液的pH>约7。在某些实施方案中，溶液的pH为约9或约10或约11或约12或约13或大于13。通常，溶液包含水并且可任选包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。可根据组合物的所需pH选择缓冲液。例如，PBS可用于pH约7的组合物，而Tris可用于具有约9或约10的更高pH的组合物。在一些实施方案中，pH介于约9和约13之间。在一些实施方案中，pH为至少约13。在一些实施方案中，用适量的适合碱例如Na₂CO₃或NaOH调节pH以达到所需pH。在一些实施方案中，碱的浓度为约0.00001M至约0.5M。在一些实施方案中，碱的浓度为约0.1M至约0.25M。在一些实施方案中，碱的浓度为约0.2M。

已经意外地发现，交联期间使用的透明质酸的浓度有助于包含透明质酸的组合物的质量，并且最终改善由此类组合物制备的线的某些性质。例如，当交联期间使用的透明质酸的浓度为至少约5％时，凝胶变得越来越牢固。此外，已经发现可通过降低交联期间使用的透明质酸的浓度增大水中的凝胶溶胀比。在一个实施方案中，交联期间的组合物包含约1重量％至约25重量％透明质酸(交联前)。在另一实施方案中，交联期间的组合物包含约14重量％透明质酸(交联前)。在另一实施方案中，交联期间的组合物包含约12重量％透明质酸(交联前)。在另一实施方案中，交联期间的组合物包含约8重量％透明质酸(交联前)。在另一实施方案中，交联期间的组合物包含约5重量％透明质酸(交联前)。

在一个替代实施方案中，纯地，即没有溶剂，进行交联。因此，在某些实施方案中，使纯BDDE与干燥透明质酸接触以提供交联透明质酸。然后用所需量的含水介质使组合物水合以提供凝胶组合物。

当透明质酸与交联剂接触时，形成包含交联透明质酸的组合物。在本发明中使用的交联剂应包含透明质酸官能团的互补官能团，以便可进行交联反应。交联剂可为同双官能或异双官能。预计线的水合百分比可至少部分受采用的交联剂的类型控制。例如，如果交联留下透明质酸的羧基未官能化，线的水合百分比可高于酯化透明质酸。适合的交联剂包括但不限于丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)、二乙烯砜(DVS)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或其组合。在一些方面，提供了包含大体上交联的透明质酸的组合物，其中透明质酸经BDDE衍生物交联或共价修饰。

还已发现，交联期间使用的交联剂(例如，BDDE)的浓度有助于包含交联透明质酸的组合物的质量并且最终改善由此类组合物制备的线的某些性质。使用的BDDE的量足以生成包含相对于透明质酸的重复二糖单元，至少15摩尔％的BDDE衍生物的组合物。在一个实施方案中，组合物包含约15摩尔％至约25％摩尔百分比或约17摩尔％至约20摩尔％的BDDE衍生物，或约18摩尔％至约19摩尔％。在一个实施方案中，组合物包含18.75％的BDDE衍生物。

选择的BDDE的量将足以提供牢固组合物。例如，当交联期间使用的BDDE的浓度相对于透明质酸的重量为至少约10重量％时，凝胶变得越来越牢固。包含交联透明质酸的组合物形成后，交联期间使用的BDDE的量也可表示为相对于交联期间使用的透明质酸的重量的重量％。在一个实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用介于25重量％和100重量％之间的BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用至少30％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用约30％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用至少40％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用约40％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用至少50％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用约50％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用约50％BDDE至约75％BDDE。在另一实施方案中，相对于透明质酸的重量，使用约75％BDDE至约100％BDDE。

在某些方面，透明质酸经交联或共价修饰以形成包含大体交联的透明质酸的组合物。在某些实施方案中，并入其中的交联剂的量或交联密度应足够高，以致由此形成的线为弹性体，然而不得如此高以致所得线变得太硬，以致当用作软组织填充产品时，在递送期间线在皮肤内不能移动。由线的预期用途决定适当硬度或弹性模量。

洗涤、干燥和调配交联透明质酸

制备交联透明质酸后，可洗掉任何过量交联剂。单独水洗通常不足以去除所有过量交联剂。可在水洗后用缓冲液和/或醇溶剂，例如乙醇冲洗或代替水洗以去除未反应的BDDE。预计要去除所有或大体上所有过量交联剂，多次洗涤可能有必要。还预计，可将凝胶切成小块或从注射器中挤出以提高洗涤步骤的效率。

在一些实施方案中，已经定径了经水合或洗涤的凝胶块。通过将凝胶装入注射器并挤压通过针(通常20规格(G)钝针)或筛子(例如，355μm筛子)完成定径。可使用相同或不同，通常比前一定径步骤口径更小的针或筛子执行一个以上或甚至一系列的定径步骤。例如，首先可挤压凝胶通过20G针一次或两次，然后任选挤压通过23G或25G针一次或多次。进行的定径步骤越多，所得的线越光滑。这样的结果将是有利的，因为越光滑的线将表现出越小的阻力，越光滑的线将使得通过皮肤递送更容易。另外，预计附加定径步骤可增加线的抗拉强度。例如，已经使用20G针定径一次的某些线的抗拉强度为约0.381磅至约0.476磅，或为约0.436磅。已经使用20G针定径两次的某些线的抗拉强度为约0.416磅至约0.579磅，或为约0.479磅。已经使用20G针定径两次，然后使用25G针定径一次的某些线的抗拉强度为约0.462磅至约0.605磅，或为约0.529磅。

虽然通过执行一个以上定径步骤增强了线的光滑度，但是凝胶的粒度基本上不变(图14)。虽然线的直径随定径增加而稍微减小，但是线溶胀比基本上不随定径增加而变化(对于1、2和3个定径步骤而言，介于1.66和1.70之间)。

在一个实施方案中，如上所述，包含交联透明质酸的组合物在与粘合剂进一步结合之前经大体上干燥(例如，脱水)。在一个实施方案中，如上所述，包含交联透明质酸的水性凝胶组合物在与非交联透明质酸进一步结合之前经大体上干燥(例如，脱水)。在一些实施方案中，通过风干或在风干之前在环境或更高温度下先轻轻倒出溶剂实现干燥。在一个实施方案中，通过冻干实现干燥。在一个实施方案中，干燥是部分的。

在一个实施方案中，如上所述，包含交联透明质酸的组合物在与粘合剂进一步结合之前，通过从适合溶剂中沉淀而分离。沉淀可执行多次，即一次以上。在一些实施方案中，经沉淀分离的凝胶的粒度是与冻干凝胶颗粒大体上相同或更小的尺寸。在某些实施方案中，由经沉淀分离的凝胶制成的线具有小的干线直径(例如，约0.014”-0.015”)，但表现出更快的溶胀速率、增强的柔软度和更大的溶胀直径。

在一个实施方案中，包含交联透明质酸的水性凝胶组合物脱水去除按重量计约25％的水分。在一个实施方案中，包含交联透明质酸的水性凝胶组合物脱水去除按重量计约50％的水分。在一个实施方案中，包含交联透明质酸的水性凝胶组合物脱水去除按重量计约75％的水分。在一个实施方案中，包含交联透明质酸的水性凝胶组合物脱水去除按重量计约90％的水分。

已经意外地发现，挤出之前，水性凝胶组合物中包括交联透明质酸和非交联粘合剂在内的总HA固体的浓度改善了本文所述线的某些性质，例如挤出之前或之后的光滑度和操作简易性。

如上所述，经干燥的交联透明质酸组合物可与水结合形成大体上交联的透明质酸，然后可用粘合剂(例如，非交联透明质酸)和/或添加剂(例如，盐、赋形剂、利多卡因等)调配。然后可将包含交联透明质酸和任选粘合剂(例如非交联透明质酸)的所得调配凝胶组合物挤成湿线，然后进行干燥。

在一个实施方案中，在线干燥和任选与粘合剂(例如，非交联透明质酸)结合之前，组合物中存在的交联透明质酸的量按组合物的总重量计为约5重量％至约20重量％。在又一实施方案中，在线干燥和任选与粘合剂(例如，非交联透明质酸)结合之前，组合物中存在的交联透明质酸的量按组合物除水分之外的总重量计为约5重量％至约12重量％或约8重量％至约10重量％。

在一个实施方案中，提供了一种包含以上任何实施方案的大体上交联的透明质酸的组合物，其已经干燥和再水合并且进一步包含粘合剂。在一个实施方案中，粘合剂为非交联透明质酸。在一个实施方案中，粘合剂例如非交联透明质酸作为水溶液提供。在一个实施方案中，粘合剂例如非交联透明质酸作为进一步包含盐例如CaCl₂的水溶液提供。在一个实施方案中，粘合剂例如非交联透明质酸作为进一步包含1mM CaCl₂、2.5mM CaCl₂、10mM CaCl₂或大于10mM CaCl₂的水溶液提供。

又一意外发现是本文所述干线的质量至少部分取决于用于制备如上所述湿线组合物的总透明质酸固体的量。“透明质酸固体”包括大体上交联的透明质酸和/或非交联透明质酸(即，粘合剂)的任何组合。在一些实施方案中，最少量的透明质酸固体有助于干线的质量，例如通过支撑用于制备干线的湿线的横截面形状(例如，相对圆的直径)。最少量的透明质酸固体可进一步有助于干线的质量，例如通过增大干线的抗拉强度和/或干线吸水的溶胀比。最少量的透明质酸固体可通过增加干线的光滑度进一步有助于干线的质量。下面描述了透明质酸固体的示例性最少量。

在一个实施方案中，湿线包含约2％至约50％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含约2％至约40％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含约2％至约20％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少7％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少10％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少12％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少15％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少18％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少20％透明质酸固体。在一个实施方案中，湿线包含至少25％透明质酸固体。

如上所述，用于制备本文所述湿线和干线的透明质酸固体可包括交联透明质酸和/或非交联透明质酸(即，粘合剂)的任何组合。对交联透明质酸和/或非交联透明质酸的量和/或比例的调节可改善线的某些性质(例如，湿线的横截面形状、干线的抗拉强度、干线吸水的溶胀比、干线的光滑度、干线对透明质酸酶的体内酶促降解的抵抗力和/或增加体内半衰期)。

在一个实施方案中，在用于制备线的组合物中交联透明质酸的存在量按组合物的总重量计为约1重量％至约25重量％。在另一实施方案中，交联透明质酸的存在量按组合物的总重量计为约2重量％至约15重量％。在另一实施方案中，交联透明质酸的存在量为约14重量％。在另一实施方案中，交联透明质酸的存在量为约12重量％。在另一实施方案中，交联透明质酸的存在量为约8重量％。在另一实施方案中，交联透明质酸的存在量为约5重量％。

在一个实施方案中，在用于制备线的组合物中非交联透明质酸的存在量按组合物的总重量计为约1重量％至约20重量％。在另一实施方案中，非交联透明质酸的存在量按组合物的总重量计为约1重量％至约8重量％。在另一实施方案中，非交联透明质酸的存在量为约5重量％。在另一实施方案中，非交联透明质酸的存在量为约3重量％。在另一实施方案中，非交联透明质酸的存在量为约2重量％。

在一个实施方案中，用于制备线的组合物包含约5重量％至约15重量％交联透明质酸和约2重量％至约8重量％非交联透明质酸。在一个实施方案中，组合物包含约12重量％交联透明质酸和约3重量％非交联透明质酸。在一个实施方案中，组合物包含约8重量％交联透明质酸和约2重量％非交联透明质酸。在一个实施方案中，组合物包含约5重量％交联透明质酸和约5重量％非交联透明质酸。可用更高或更低浓度的HA和交联HA制备用于制备线的组合物；以上3种组合物仅作为实例给出。

将凝胶除气、挤出并干燥成线

在一些实施方案中，在挤出之前为包含交联和非交联透明质酸的水性凝胶组合物除气以将挤出后的气泡减到最少。也可使用注射器进行排气。已经发现，在用于制备线的组合物除气后，线的抗拉强度通常提高。

在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气至少一次。在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气一次以上。在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气2-10次。在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气两次。在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气3、4、5、6、7、8、9或10次。在一些实施方案中，为用于制备线的组合物除气至少10次。

为形成线，通常将包含交联和非交联透明质酸的水性凝胶组合物挤到如下所述的基底上，以形成湿线。使用固定到喷嘴的加压注射器挤出组合物。喷嘴可具有各种几何形状，例如各种长度、内径和形状。

通常，已经发现，可通过在湿线挤出期间，增大喷嘴尺寸(例如，宽度)改善干线组合物的许多性质。线中此类经改善的性质可包括(例如)线的横截面形状、线的抗拉强度、线吸水的溶胀比、线的光滑度、干线对透明质酸酶的体内酶促降解的抵抗力和/或干线的体内半衰期增加。

喷嘴在形状上可为圆形或非圆形，例如扁平形状或“D”形。注射器喷嘴可为约15规格至25规格注射器喷嘴的任一个。在一些实施方案中，注射器喷嘴为15规格喷嘴，而在其它实施方案中，注射器喷嘴为16规格喷嘴。在一些实施方案中，注射器喷嘴为17规格喷嘴，而在其它实施方案中，注射器喷嘴为18规格喷嘴。在一些实施方案中，注射器喷嘴为19规格喷嘴，而在其它实施方案中，注射器喷嘴为20规格喷嘴。在一些实施方案中，注射器喷嘴为21规格喷嘴，而在其它实施方案中，注射器喷嘴为22规格喷嘴。通常，采用的压力为约10至约2000psi或为约20至约240psi。压力要求由喷嘴几何形状和其它属性规定，例如组合物的稠度和所需流量。可气动，例如使用环境空气或氮气，液压或机械施加压力。挤出凝胶的速度考虑到了线长度上气泡的最少化和一致均匀形状的最大化。气泡可通过产生疵点而降低线的结构完整性。

气动压力和板速不固定但是相反在过程中调节和监测，以便以连续、线性方式挤出凝胶。对于指定批次的线，首先将气动压力增加到一致但是可控的凝胶流量点。然后不断地微调板速，以便线以均匀线性方式挤出。如果板速过低，可能产生呈之字形的线；而太快，线可能拉伸，导致颈缩和/或断裂。

考虑到各种基底供本文所述的方法使用。基底包括亲水和疏水性基底并且可选自但不限于聚四氟乙烯(PTFE)、膨体PTFE、尼龙、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、硅、聚氨酯和活化纤维素。

随着凝胶组合物的粘度采用的基底规定线的大致形状。例如，如果凝胶和基底的平衡接触角小于90度，则预计形成的线可大体上呈带状。此外，如果凝胶和基底的平衡接触角小于90度，则形成的线可大体上呈D形。再此外，如果凝胶和基底的平衡接触角小于90度，则形成的线可大体上呈圆形。例如，挤在PTFE上时10％1.5MDa凝胶将具有大体上呈圆形的横截面(例如，约80％的圆形)，而挤在PTFE上时5％1.5MDa凝胶将形成扁平带。

作为对加压挤出的替代，可在干燥之前将凝胶组合物滚成细长圆柱体和/或切成细长条带。

然后干燥湿线以形成干线。干燥可在静态条件下进行，或可选地，借助于动态气流(即，在层流净化罩中)进行。在一些实施方案中，线的产量随静态干燥提高。正如下面所讨论的，形成具有足够抗拉强度的线需要干燥步骤。因为线在暴露于超过水沸腾温度的热时可能失去其某些性质，所以优选在环境条件下进行干燥步骤。这个干燥过程提供了具有较高抗拉强度的线，例如约5kpsi至100kpsi或20kpsi至80kpsi的极限抗拉强度。换言之，如本文所述的线的破坏荷载为至少约0.1磅或0.22kg。

使线干燥约30分钟至约72小时以形成直径从0.05mm至约1.0mm并且按重量计有10％-30％水合的线。在一些实施方案中，线可干燥约12小时或约24小时。预计采用的HA分子量越高或组合物中的HA越浓，需要的干燥时间越长。此外，干燥过程中，可采用非热刺激，例如紫外光、辐射或化学引发剂或催化剂帮助交联反应。

在一些实施方案中，干燥后，用含水或非水性溶剂、气体或超临界流体洗线。在一些情况下，这样洗涤去除了过量的交联剂。洗涤可通过多种方法完成，例如浸入水性溶剂中或通过使用并流系统，将线倾斜放入槽中并使水性溶剂溢过线。也可使线(例如)垂直悬浮，并且通过使水沿线的长度滴下或流下进行洗涤。

在一个实施方案中，用水洗线。在这个实施方案中，水不但洗线以去除过量交联剂，还使线水合成水合弹体状态。在一个实施方案中，用抗氧化剂溶液洗线。例如，在一个实施方案中，用包含抗坏血酸、维生素E和/或磷酸钠的缓冲溶液洗线。在一个实施方案中，用包含约1mM或约10mM或约100mM或约1M抗坏血酸的缓冲溶液洗线。

按总重量计，透明质酸的水合百分比范围可为约1％至大于约1000％。可通过调节凝胶中的透明质酸百分比和/或控制添加的交联剂的量和类型控制本发明线的水合百分比。预计水合线百分比越低将产生抗拉强度越高的线。在一些实施方案中，基于总重量，线按重量计的水合不大于约30％或不大于15％或不大于10％。将由干燥过程期间或之后，线所经受的环境决定水合百分比。

应该注意的是，可通过控制线的厚度、密度、交联程度、透明质酸的分子量和水合程度控制透明质酸线在体内的半衰期，然后可通过单独和分别调节透明质酸和交联剂的量进一步调节。预计与对于天然透明质酸而言小于1天相比，本文公开的线的体内半衰期可增加，为约1个月至最多约12个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少1个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少2个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少3个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少4个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少6个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少8个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少10个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少12个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少14个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少16个月。在某些实施方案中，预计本文所述的线的体内半衰期为至少18个月。

预计本文所述的线可使用本领域已知的典型灭菌方法灭菌，例如高压釜、环氧乙烷、电子束(e-beam)、超临界CO₂(具有过氧化物)等。例如，本文所述的线可使用电子束(e-beam)灭菌方法灭菌。在一些实施方案中，首先在高pH(即，pH9或pH10)下在缓冲溶液中洗线。在一些实施方案中，洗涤液进一步包含乙醇、抗坏血酸、维生素E和/或磷酸钠。

任选地且必要时，虽然经水合，但是水合不久后或在首次干燥之前或再水合之后线逐渐机械拉伸。拉伸或不拉伸可提供所需长度和/或再水合溶胀体积的线。在一些实施方案中，线的长度可为约0.5cm到约15cm。在另一实施方案中，线的长度可为约2cm到约12cm。在另一实施方案中，线的长度可为约5cm到约10cm。

线再水合后，使其在环境条件下再干燥约30分钟到约72小时。在一些实施方案中，干燥后，线固化以提供更均匀的线表面。

这个洗涤水合/再水合步骤可进行多次以使过量的未反应试剂从线上洗掉或继续提高交联或共价修饰程度。这是对于方法，例如使用有机溶剂去除过量BDDE的改进。

3.线命名

由包含大体上交联的透明质酸的组合物制备如本文所述的线。在某些实施方案中，由包含大体上交联的透明质酸并且进一步包含粘合剂例如非交联透明质酸的组合物制备线。可根据下列命名AA/BBXX/YY描述线，其中AA/BB描述最初形成的包含大体上交联的透明质酸的组合物并且XX/YY描述具有粘合剂，例如非交联透明质酸的组合物。

例如，称为“10/4015/20”的线指大体上交联的透明质酸的组合物，其中用相对于溶液(例如，水溶液)重量为10重量％的透明质酸，使用相对于透明质酸重量为40重量％的交联剂(例如，BDDE)进行交联反应。

如本文所提到那样，AA/BBXX/YY的AA为至少2％。在一些实施方案中，AA为至少5％。在一些实施方案中，AA为约8％。在一些实施方案中，AA为约10％。在一些实施方案中，AA为至少10％。在一些实施方案中，AA为约12％。在一些实施方案中，AA为至少15％。

在一些实施方案中，AA/BBXX/YY的BB为至少10％。在一些实施方案中，BB为至少20％。在一些实施方案中，BB为至少30％。在一些实施方案中，BB为约30％。在一些实施方案中，BB为至少40％。在一些实施方案中，BB为约40％。在一些实施方案中，BB为至少50％。在一些实施方案中，BB为约50％。

在一些实施方案中，AA/BBXX/YY的AA/BB为约8/10。在一些实施方案中，AA/BB为至少或约或精确为8/20。在一些实施方案中，AA/BB为约8/30。在一些实施方案中，AA/BB为约8/40。在一些实施方案中，AA/BB为约8/50。在一些实施方案中，AA/BB为约10/10。在一些实施方案中，AA/BB为约10/20。在一些实施方案中，AA/BB为约10/30。在一些实施方案中，AA/BB为约10/40。在一些实施方案中，AA/BB为约10/50。

在一些实施方案中，向包含交联透明质酸的组合物添加一种或多种粘合剂，例如非交联透明质酸，并且通过本文所述的附加方法转化所得组合物以提供新颖线。在一些实施方案中，包含交联透明质酸的组合物进一步包含非交联透明质酸。添加的非交联透明质酸在本文中任选称为“粘合剂”。组合物中交联透明质酸和非交联透明质酸的组合在本文中任选称为“透明质酸固体”。如本文所提到那样，AA/BBXX/YY的XX指总透明质酸固体相对于组合物重量的重量％，其中透明质酸固体包括大体上交联的透明质酸和任何非交联透明质酸。如本文所提到那样，AA/BBXX/YY的YY指非交联透明质酸相对于总透明质酸固体重量的重量％。

在一些实施方案中，AA/BBXX/YY的XX为至少2％。在一些实施方案中，XX为至少5％。在一些实施方案中，XX为至少10％。在一些实施方案中，XX为约10％。在一些实施方案中，XX为至少15％。在一些实施方案中，XX为约15％。在一些实施方案中，XX为至少20％。在一些实施方案中，XX为约20％。在一些实施方案中，XX为至少25％。在一些实施方案中，XX为约25％。

在一些实施方案中，AA/BBXX/YY的YY为至少5％。在一些实施方案中，YY为至少10％。在一些实施方案中，YY为至少20％。在一些实施方案中，YY为约20％。在一些实施方案中，YY为至少30％。在一些实施方案中，YY为约30％。在一些实施方案中，YY为至少40％。在一些实施方案中，YY为约40％。在一些实施方案中，YY为至少50％。在一些实施方案中，YY为约50％。

在一些实施方案中，AA/BBXX/YY为8/102/5、8/205/10、8/3010/20、8/4015/20、8/5020/30、10/1020/40、10/2025/50、10/3020/40、10/4010/50、10/5020/40等。

已经证实，使用本文公开的AA/BBXX/YY组合物提供的线展现出增强的体内持久性以及其它有益特性。

在某些实施方案中，本文公开了线，其包含大体上交联的透明质酸，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物大体上交联，并且包含相对于总透明质酸固体的重量，至少约5％的非交联透明质酸，其中按线除水分外的总重量计，交联透明质酸的存在量为约60重量％至约90重量％，并且按线除水分外的总重量计，非交联透明质酸的存在量为约10重量％至约40重量％。

4.线的修饰

除洗线外，也可通过吸附足够量的选自治疗剂、诊断剂、纤维化增强剂、生物降解阻碍剂、润滑增强剂及其组合的膜，任选接着再次干燥线进一步使线功能化。此类治疗剂包括抗菌剂、麻醉剂、用于查看体内放置的染料等。在一些实施方案中，用生物可吸收的生物聚合物，例如胶原、PEG、PLGA或可作为液体引入并且在体内凝固的相转移Pluronic^TM涂覆干燥或对线进行水合以改变性质。

在一个实施方案中，线也可经涂覆以调整线再水合的速率。例如，线可涂覆有疏水层，例如脂质。然后可调节脂质层的厚度以达到所需再水合速率。在另一实施方案中，线可涂覆有非交联透明质酸的水性组合物。这可就在线植入之前进行以起到润滑剂的作用。还预计，这样用非交联透明质酸涂覆可减缓线再水合的速率。在一些实施方案中，用凝胶组合物完全或部分涂覆所述线以形成分层材料。单层或3D织造构造可经整体涂覆以产生与免织造网不同的物理性质的织物或网。

如本文所述的线可经编织、盘绕、分层或织造。在一些实施方案中，可由上述线形成编织物。可通过缠结两条或更多条线形成编织物，其中在通过其它线的搭接质量呈之字形前进时，每条线在功能上等效。编织物可为扁平、三链结构，或可由任意(一般为奇数)数量的线构造更复杂的编织物以产生更广泛的结构，例如更宽的带样条带、空心或实心圆柱形绳索或类似基本垂直织造物的宽垫。

在一个实施方案中，添加增塑剂以调节线的硬度。可选地，或另外，不同硬度的线可织在一起以制备具有所需硬度的编织线或材料。

在一些实施方案中，可通过织造或缠绕或盘绕或分层上述线构造三维结构。在其它实施方案中，可通过织造或缠绕或盘绕或分层上述编织物构造三维结构。还有其它实施方案中，可通过织造或缠绕或盘绕或分层上述绳索构造三维结构。还有其它实施方案中，可通过织造或缠绕或盘绕或分层上述网构造三维结构。

在一些实施方案中，圆柱形植入物由提供的任何线制成。此类植入物的示例性用途是乳头再造。在一些实施方案中，用于制备圆柱形植入物的线径交联并且包括软骨细胞粘附化合物。在其它实施方案中，圆柱形由多个同心线圈提供。

线实施方案

一方面，提供了包含透明质酸的干线，其中至少一部分的透明质酸与相对于透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的BDDE衍生物大体上交联。在另一实施方案中，大体上交联的透明质酸与约15摩尔％至约20摩尔％的BDDE衍生物交联。在一个实施方案中，大体上交联的透明质酸与约16摩尔％至约19摩尔％的BDDE衍生物交联。

在一个实施方案中，按干线的总重量计，交联透明质酸的存在量为约50重量％至约90重量％。在另一实施方案中，按干线的总重量计，交联透明质酸的存在量为约60重量％至约80重量％。

在一个实施方案中，干线进一步包含粘合剂，例如非交联透明质酸。按干线的总重量计，非交联透明质酸可能的存在量为约1重量％至约50重量％。在一个实施方案中，按干线的总重量计，非交联透明质酸的存在量为约15重量％至约20重量％。

在另一实施方案中，干线的极限抗拉强度为约2kpsi至约20kpsi。在一个实施方案中，线的极限抗拉强度为约4kpsi至约10kpsi。

在另一实施方案中，干线的直径为至少约0.004英寸。在一个实施方案中，干线的直径为约0.008英寸至约0.018英寸。

在另一实施方案中，干线的重量/长度比为约1.5至约3.5毫克/英寸。

在一个实施方案中，干线的破坏荷载为约0.3磅或更高。在另一实施方案中，干线的破坏荷载为约0.3至约1.3磅。

在一个实施方案中，干线进一步包含针。

又一方面，提供了包含大体上交联的透明质酸的干线，其通过以下步骤制备：a)通过使透明质酸与BDDE接触来形成大体上交联的透明质酸组合物；b)向大体上交联的透明质酸组合物中添加非交联透明质酸；c)挤出大体上交联的透明质酸组合物以形成湿线；和d)干燥所述湿线以形成干线。

在一个实施方案中，相对于透明质酸的重量，约5至约15重量％透明质酸与约2至约8重量％的BDDE接触。在另一实施方案中，透明质酸与相对于所述透明质酸的重量约40重量％的BDDE接触。在一个实施方案中，交联透明质酸与相对于透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的BDDE衍生物交联。在另一实施方案中，交联透明质酸与相对于透明质酸的重复二糖单元为约15至约25摩尔％的BDDE衍生物交联。在一个实施方案中，交联透明质酸与相对于透明质酸的重复二糖单元为约17至约20摩尔％的BDDE衍生物交联。在另一实施方案中，交联透明质酸与相对于透明质酸的重量为至少约12重量％的BDDE衍生物交联。

在一个实施方案中，至少5％透明质酸与相对于透明质酸组合物的重量为约2至约8重量％的BDDE接触。在另一实施方案中，约8％透明质酸与相对于透明质酸组合物的重量为约2至约8重量％BDDE接触。在一个实施方案中，约10％透明质酸与相对于透明质酸组合物的重量为约2至约8重量％的BDDE接触。

在一个实施方案中，通过使透明质酸与BDDE接触形成的组合物包含交联透明质酸，按组合物的总重量计量为约1重量％至约50重量％的透明质酸。在一个实施方案中，通过使透明质酸与BDDE接触形成的组合物包含交联透明质酸，按组合物的总重量计量为约5重量％至约20重量％的透明质酸。在另一实施方案中，干线进一步包括干燥通过使透明质酸与BDDE接触形成的组合物。

在一个实施方案中，按组合物的总重量计，添加约1重量％至约50重量％的非交联透明质酸。在另一实施方案中，按组合物的总重量计，添加约2重量％至约15重量％的非交联透明质酸。在另一实施方案中，按组合物的总重量计，添加约3重量％的非交联透明质酸。

在一个实施方案中，干线的极限抗拉强度为约2kpsi至约20kpsi。在一个实施方案中，线的极限抗拉强度为约20kpsi或更高。

在一个实施方案中，干线的破坏荷载为约0.3磅或更高。在一个实施方案中，干线的破坏荷载为约0.3至约1.3磅。

在一个实施方案中，提供了根据以上任何实施方案所述的线，其中所述线经最终灭菌。

5.使用交联透明质酸线的方法

例如，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构可用于填充皱纹、填充动脉瘤、堵塞到肿瘤的血流(即，肿瘤堵塞)、眼睑手术、阴茎增粗(例如，用于增大或敏感性降低，即早泄治疗)、诊断和/或治疗剂的鼻内(血脑屏障)递送装置、用于药物递送的角膜植入物、隆鼻或再造、丰唇或再造、面部增大或再造、耳垂增大或再造、脊柱植入物(例如，支撑膨出椎间盘)、根管填料(含有治疗剂)、声门机能不全、激光屈光性疗法(例如，用作软垫的透明质酸线/织造物)、用于器官再生的脚手架、脊髓治疗(BDNF和NGF)、帕金森病(Parkinson’sdisease)(立体定向递送)、治疗或诊断分子的准确递送、髓移植、髓置换根管治疗、成形根管系统、负压伤口治疗、粘连屏障物(例如，腹部、骨盆、心脏、脊髓和肌腱粘连)、伤口敷料、无细胞真皮基质、非液压药物递送(例如，前列腺增大、克罗恩氏病(crohn’s diease)、血管狭窄等)和持续、局部药物递送。

治疗皱纹的方法

组织修复可延长用于治疗或填充体内皱纹时线的“填料”作用，远远超过本文所述的基于透明质酸的线的半衰期。这在实施例11中有描述。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的患者的皱纹的方法，通过：1)将本文所述的线插入患者的邻近皱纹或在皱纹下面的皮肤或皮下间隙；并且2)邻近皱纹或在皱纹下面施加所述线，从而治疗皱纹。这些步骤可进行至少一次和多达6次以治疗每条皱纹。在一些实施方案中，如图2、3A和3B所示，线附着于针的近端。用针插入线，然后将针移除。任选和必要时，用水或盐水或通过通常灌注周围组织的流体使线水合。此外，可用生物相容性材料例如可作为液体引入并且在体内凝固的相转移Pluronic^TM填充其余皱纹。可选地，可引入常规透明质酸凝胶填充皱纹。在任一情况下，形成的网起到将生物相容性填料维持在皱纹部位的作用。

在一些实施方案中，提供了治疗受试者皱纹的方法。在一些实施方案中，主治临床医师可根据本领域已知的工序，使用各种麻醉剂，包括但不限于局部利多卡因、冰或经利多卡因注射阻滞使治疗区麻木。例如，如图4A所示，皱纹可能在眶周区。例如，如图2、3A和3B所示，线附着于针上。例如，如图4B所示，针的远端可通过受试者的皮肤表面插入邻近皱纹或皱纹内的真皮中。在一些实施方案中，针插入皮下间隙，而不是真皮中。例如，如图4C所示，然后针可穿过受试者皱纹下方的真皮或皮下间隙。例如，如图4D所示，然后针可在皱纹的相对边缘退出受试者的皮肤。例如，如图4E所示，然后可在远端拉针，直至针从受试者体内移除，使得将线拉入皱纹下方先前被针占据的位置。最后，例如，如图4F所示，从受试者皮肤表面的针上截去多余的线，留下植入的线。

如图5A、5B和5C所示，以上方法可成功治疗皱纹。图5A中示出典型的皱纹。图5B示出皱纹下方植入的尚未水合的线。因为皱纹下方植入的线变得完全水合，如图5C所示，皱纹的表面外观同时变平。

在一些实施方案中，以这样一种方式操纵线，使得线的一端足够硬，以便用线穿透皮肤。这可通过为线涂覆硬化材料，例如糖衣实现。在另一实施方案中，为线整体涂覆(例如)糖衣，以提供柱形强度增加的线。

面部外形修复

如本文所述的线用于面部外形修复。面部外形修复的意思是，可向患者希望增大的面部、颈部或胸部任何区域施加线，仅举例而言，包括唇部、鼻唇褶和泪沟。

丰唇是通常所需的美容手术。通常，美容目标是唇部更丰满、更圆润。丰唇的可用治疗选择包括临时填料(例如和)、永久性填料(例如和植入物)以及手术。增强区域可包括唇部抹消和外形修复的朱红色唇缘(或白卷)和增加丰满度的湿-干粘膜接合处。其它技术包括口轮匝肌的更加扩散的浸润。

由于手术的微创和临时性，用软组织填充产品进行唇部外形修复和丰唇是流行的低风险选择。目前在唇部手术中使用的软组织填充产品的主要缺点是(a)疼痛，(b)难以一致均匀地将凝胶注入所需位置，并且(c)凝胶可在植入物使用期内迁移，引起美容效果改变。

本发明解决了上述缺点。除解决以上列出的上述现有临时软组织填充产品的缺点外，已经发现基于HA线增强唇部外观的方法非常快。典型患者可在仅3分钟内在其唇部中有3根线。当前的软组织填充产品唇部手术可花15-20分钟。

在涉及面部外形修复的实施方案中，主治临床医师可根据本领域已知的工序，使用各种麻醉剂，包括但不限于局部利多卡因、冰或经利多卡因注射阻滞使治疗区麻木。HA(透明质酸)制成的线可附着于针的近端并被拉入唇部中。针可用作精确导向器，并且也可在将线拉入所需位置之前用于预测和修正植入位置。这种精确递送机制可用于沿着朱红色唇缘表浅(若需要)递送线进行外形修复，以及在湿-干接合处，(若需要)向唇部更深处递送进行丰满化。

预计当线用于面部外形修复时，根据所需效果和线的尺寸可使用任何数量的线。例如，在下面实施例11中讨论了为丰唇和外形修复进行的手术的描述。

已经惊人且出乎意料地发现，线可植入患者的不同组织平面以在进行面部外形修复时提供更加自然的面容。例如，线可按在所需位置形成小丘的方式植入。鉴于如本文所述的线的独特性质，主治临床医师可在表皮、真皮和/或皮下层中沉积或植入线。

通过线可放置的精确性及其相对于真皮和底层结构的尺寸使这种技术成为可能。线可根据其植入位置赋予面部特征不同效果，例如皱纹、轮廓、褶皱和沟槽。

例如，最近临床经验表明，沿着前额皱纹的轴，例如在皮下间隙中深深放置线(在这种情况下，线的直径为约008”)可通过固定通常将使皱纹外观恶化的前额，帮助之后使患者活跃时形成的皱纹的外观变柔和。目前仅用具有妨碍患者表达所有面部表情的不良效果的很好地治疗这些类型的动态皱纹。此外，最近临床经验显示，可通过在表浅，例如在真皮中放置线(直径为.004-.008”)有效治疗在休息时可见的静态皱纹。

使线植入组织平面分层的技术也成功用于改善鼻唇褶(达4x.008”线)、眉间纹、嘴角纹和唇部的外观。

这是通过HA线及其植入方法使其成为可能的另一种技术。为使凹陷或沟(例如泪沟)的外观光滑或为面部区域例如颧骨、下颚等塑造轮廓，例如可将线以阴影线图案(见，图7A)和/或交叉阴影线图案(见，图7B)植入以达到大于单根线宽度的区域。如图7A和7B所见，两个患者的泪沟通过在一种情况下(图7A)平行和在另一种情况下(图7B)以交叉阴影线放置线有效光滑。可与图7B中的情况一样，向起始方向倾斜地或垂直地划交叉阴影线。此外，阴影线也可在不同组织平面上。

在这种技术的另一实施方案中，可向治疗区域的方向倾斜地划阴影线。例如，在图7A中线与泪沟的轴对齐放置。相反，线可向泪沟的轴倾斜地放置以有差别地支撑区域中的组织。

预计在如上所述皱纹的治疗中，也可进行在不同平面上植入所述线。

伤口治疗

在一些实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用于伤口敷料，包括负压伤口敷料中。

在一些实施方案中，伤口敷料保持与伤口接触至少72小时。在其它实施方案中，负压伤口敷料保持与伤口接触至少1周。还有其它实施方案中，伤口敷料保持与伤口接触至少2周。还有其它实施方案中，伤口敷料保持与伤口接触至少3周。还有其它实施方案中，伤口敷料保持与伤口接触至少4周。在以上实施方案中，应理解，肉芽组织不保留本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构，因为这些组分完全可吸收。在这些实施方案的一些中，伤口敷料介于约1cm和约5cm厚之间。相应地，在这些实施方案的一些中，无需更换敷料就可实现伤口床闭合。

在一些实施方案中，本文所述的织造网用于伤口敷料，包括负压伤口敷料中。在其它实施方案中，敷料包括介于2和约10层的织造网。

还有其它实施方案中，织造网包含相同的线。还有其它实施方案中，织造网包含不同的线。

在一些实施方案中，干燥时织造网介于约1mm和约2mm厚。在其它实施方案中，干燥时织造网介于约2mm和约4mm厚。

在一些实施方案中，织造网的孔径在宽度上介于约1mm和约10mm之间。在其它实施方案中，织造网的孔径在宽度上介于约0.3mm和约0.6mm之间。还有其它实施方案中，织造网的孔对齐。还有其它实施方案中，织造网的孔交错。还有其它实施方案中，使织造网经准直以产生所需尺寸的孔。

在一些实施方案中，织造网在约75mm Hg的最低真空度下机械稳定。在其它实施方案中，织造网在高达约150mm Hg的真空下机械稳定。

在一些实施方案中，织造网包括胶原。在其它实施方案中，敷料附着于聚氨酯泡沫。还有其它实施方案中，敷料附着于薄膜上。还有其它实施方案中，薄膜为硅酮或聚氨酯。还有其它实施方案中，敷料附着于具有水溶性胶粘剂的薄膜上。

在一些实施方案中，敷料中使用的线包括治疗剂或诊断剂。

在一些实施方案中，提供了负压伤口敷料(Johnson等，美国专利No.7,070,584；Kemp等，美国专利No.5,256,418；Chatelier等，美国专利No.5,449383；Bennet等，美国专利No.5,578,662；Yasukawa等，美国专利No.5,629,186、5,780,281和7,611,500)，用于真空诱导的伤口，特别是开放性表面伤口的愈合(Zamierski美国专利No.4,969,880、5,100,396、5,261,893、5,527,293和6,071,267及Argenta等，美国专利No.5,636,643和5,645,081)。敷料包括符合伤口位置的衬垫、可拆装式粘附到衬垫上的气密封条、与衬垫流体连通的负压源和附着于衬垫的伤口接触表面的本文所述的线、编织物、织造网或三维结构。如现有技术中所述，应用所述衬垫、封条和真空源。

在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构在约75mm Hg的最低真空度下机械稳定。还有其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构在约150mm Hg的最低真空度下机械稳定。还有其它实施方案中，敷料包括至少一层织造网。还有其它实施方案中，敷料包括介于2和约10层的织造网。

在一些实施方案中，管将衬垫连接到负压源。还有其它实施方案中，可拆卸罐插入衬垫和负压源之间并且与衬垫和负压源流体连通。

在一些实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构未水合。相应地，在这些实施方案中，当与伤口接触放置时，敷料可吸收伤口渗出物。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构经水合。相应地，在这些实施方案中，当与伤口接触放置时，敷料可保持伤口湿润。

在一些实施方案中，连接到流体的输入口与衬垫连接。相应地，在这些实施方案中，流体可分配在伤口中。在一些实施方案中，流体为盐水。在其它实施方案中，流体含有诊断或治疗剂。

在一些实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用作粘连屏障物。在一些实施方案中，本文所述的织造网用于粘连屏障物中。在一些实施方案中，粘连屏障物可连同其它类型的粘连屏障物一起应用，例如液体、凝胶、喷雾、其它薄膜或固体、药物和/或细胞疗法。

脱发治疗

在一些实施方案中，提供了治疗受试者脱发的方法。例如，图2、3A和3B所示，可用任选附着于针的线治疗受试者，例如有典型男性型秃发的男性。针的远端可插入其中一条发际线。然后针可穿过受试者发际线下方的区域，然后可退出受试者的皮肤。然后可在远端拉针，直至将其从受试者中移除，使得将线拉入针先前占据的位置。最后，从受试者皮肤表面的针上截去多余的线，留下植入的线。在一些实施方案中，线进一步包含促进毛发生长的一种或多种化合物。

附加医药和手术治疗

在一些实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构在上述各种美容应用中用作软组织填充产品。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构在各种医药和/或手术应用中用作缝合线。还有其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用于眼科手术、药物递送和关节腔内注射。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用作粘连屏障物，例如以治疗腹部、骨盆、心脏、脊髓和/或肌腱粘连。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构并入无细胞真皮基质中。预计，与本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构整合的无细胞真皮基质提供了改进的血管再生和/或生物整合。本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构可进一步包含其它再生性生物材料、生物制剂和/或药理学制剂。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用作持续、局部药物递送装置。在一些实施方案中，药物包括利血平(reserpine)、胍乙啶(guanethidine)、苯氧苄胺和酚妥拉明(phentolamine)、六甲双铵(hexamethonium)、6-羟多巴胺、河豚毒素(tetrodotoxin)、谷氨酸盐等。在其它实施方案中，本文所述的线、编织物、绳索、织造网或三维结构用作被动药物洗脱支架。

在一些实施方案中，提供了治疗有需要的受试者的肿瘤的方法。例如，图2、3A和3B所示，线可附着于针上。针的远端可插入受试者的肿瘤中。然后针可穿过肿瘤并且然后可退出肿瘤。然后可在远端拉针，直至将其从受试者的肿瘤中移除，使得将线拉入针先前占据的位置。最后，从针上截去多余的线，留下植入受试者肿瘤中的线。在以上一些实施方案中，线包括抗癌剂。在一些实施方案中，线经交联并且包括Bcl-2抑制剂。

在一个示例性实施方案中，可使用本发明的方法治疗胰腺肿瘤。可通过手术或微创方法例如腹腔镜检查进入胰腺。针的远端可插入胰腺肿瘤中。然后针可穿过胰腺肿瘤并且然后可退出肿瘤。然后可在远端拉针，直至将其从胰腺肿瘤中移除，使得将线拉入针先前占据的位置。最后，从针上截去多余的线，留下植入胰腺肿瘤中的线。所述过程可重复任意次数以提供植入了许多线的胰腺肿瘤。在一些实施方案中，所述线包括抗癌剂。

在一些实施方案中，提供了治疗受试者的静脉曲张的方法。例如，图2、3A和3B所示，线可附着于针上。针的远端可插入受试者的曲张静脉中。然后针可穿过曲张静脉并且然后可退出肿瘤。然后可在远端拉针，直至将其从受试者的曲张静脉中移除，使得将线拉入针先前占据的位置。最后，从针上截去多余的线，留下植入受试者曲张静脉中的线。在一些实施方案中，线为柔性。在其它实施方案中，水合时线圈可易于堵塞血管。

在一些实施方案中，提供了乳头再造的方法，其中在皮肤下面植入由交联线组成的三维、圆柱形植入物。所述植入物可包括治疗剂，例如软骨细胞粘附化合物。

在一些实施方案中，提供了神经或血管再生的方法。如图6所示，可使用针将线放置在可促进神经或血管再生的特定线上。

6.试剂盒

本文还提供了包含如本文所述线的部件的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含线和向患者递送或植入所述线的装置。在一个实施方案中，向患者递送的装置为注射器或针。在另一实施方案中，向患者递送的装置为气枪。针的尺寸(或直径)可取决于线的用途，因此也基于所用线的横截面积。针或注射器的外径可大于或等于用于减小向真皮施加线时线的拉力需求的线横截面积。还预计，线的外径可大于针的外径。皮肤十分柔软，所以甚至用较大直径的线，有较小直径的针也使穿刺尺寸很小。此外，与可能是使用更细的线治疗细纹和皱纹相比，在线为缝合线的情况下线的厚度不同。也可将一根以上的线附着于单根针。

此外，递送装置(针)的尺寸将取决于线的预期用途和尺寸。预计，用于面部外形修复或皱纹填充，约0.006”(英寸)至约0.008”直径的线或甚至约0.003”至约0.004”直径的线将足够。然而，在一些实施方案中，线为约0.003”至约0.050”，或为约0.005”至约0.030”，或为约0.005”至约0.025”。在一些实施方案中，线的尺寸在直径上为约0.010”至约0.020”或为约0.011”至约0.016”。

线与针附着可为机械附着和/或借助于胶粘剂，例如氰基丙烯酸酯。在一个实施方案中，针为不锈钢。在一个实施方案中，线通过针的近端织造或结成环，或可选地，线环绕在针的近端，或可选地，线穿过针眼并且打结或用胶粘剂粘合形成环，或可选地，线固定(机械地或用胶粘剂粘合)在针近端的孔内。在另一实施方案中，因为线由凝胶形成，可将线制成为在干燥过程中与针形成物理附着。例如，如果使用在近端有孔的针，挤出过程中孔可填充有凝胶并且因此线在干燥后固定。针可为刚性或柔性以使得用户能够追踪皮肤中皱纹下的针。此外，针可装备有接线夹以将针引导到皮肤内的所需深度，并且在针插入后，使针通过皮肤表面时解开导向器。在一些实施方案中，线附着于针。

还预计，试剂盒包含针和附着其上的线，无菌包装并且预期一次性使用。可选地，试剂盒可包含几根针，每根具有附着的线。在另一实施方案中，试剂盒包括不同尺寸的线以使得对于医师而言治疗选择成为可能，同时将所需针刺数减到最少。又一实施方案中，试剂盒包括线和不同长度和弯曲形状的针以简化难以用直针进入或治疗的区域中的植入，例如鼻子附近、眼睛周围和上唇中间部分。

实施例

参考下列实施例进一步定义本发明。对本领域的技术人员将显而易见的是，在不背离本发明范围的前提下，可对线和方法的进行许多修改。透明质酸和交联剂可从商业来源获得。

实施例1：交联线的合成

可根据下列工序制成交联透明质酸线。

交联：交联透明质酸凝胶的制备

在适当容器中，在约50℃下在所需总体积约75％的NaOH中使透明质酸(HA)水合约30分钟。然后将水合HA添加到注射器中并且充分混合(例如，注射器中往复约20次)。继续加热约30分钟。

然后将交联剂(例如，BDDE)溶于所需总体积剩余部分的NaOH中(即，所需总体积的约25％)，添加到水合透明质酸溶液(逐滴或一次性)，充分混合(例如，注射器中往复约20次)，加热约30分钟，再次混合(例如，注射器中往复约20次)，并且转移到适当容器中。然后在约50℃下再继续加热3-5小时。

可用不同浓度的组分，使用上文所述工序制备各种交联凝胶。

●HA分子量(MDa)：例如0.7、1.7、2.7。

●HA水合时间：例如，0分钟、30分钟、1小时、2小时、过夜。

●反应pH：9-13.4，使用例如0.00001-0.25M NaOH。

●交联反应时间：例如，3-4.5小时。

●HA浓度(％w/w HA:NaOH水溶液)：例如，5、6、7、8、9、10、11、12。

●BDDE浓度(％w/w BDDE:HA)：例如，0.5、2、2.5、5、7.5、8、10、20、30、40、100。

冲洗/任选定径

冲洗交联透明质酸凝胶以去除氢氧化钠和任何未反应的BDDE。也可去除水，并且可将凝胶分段以利于挤出步骤和/或冲洗效率。在这种情况下，通过将凝胶切成约0.5cm立方体实现定径。然后通过在pH6.0下，用约40体积的10mM磷酸钠冲洗3次，每次约30分钟，用100％乙醇冲洗6次约30分钟，然后用水冲洗4次约30分钟完成冲洗。

然后可将溶胀凝胶块进一步定径为约0.25cm立方体，装入注射器中，并且挤压通过20规格(G)钝针。可使用相同或不同，通常更小口径的针进行一个以上的定径步骤(例如，20G，然后两个25G定径步骤)。

干燥

然后用水约2:1稀释交联透明质酸凝胶，装入干燥的平底锅中。通过在环境条件下风干或冻干实现干燥。可选地，通过从乙醇中沉淀分离凝胶。凝胶可部分干燥至所需最终浓度或完全干燥。

调配

将完全干燥的交联透明质酸凝胶调配成所需最终HA浓度(例如，2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、20％)的水性组合物。部分干燥的交联透明质酸凝胶可用作制剂中的水性组合物，无需进一步处理。

然后交联透明质酸凝胶的水性组合物可进一步用粘合剂例如非交联透明质酸调配。在这种情况下，非交联透明质酸水合(例如，在4℃下过夜)为所需最终HA浓度(例如，2.5％、5％、7.5％、10％、12.5％、15％、20％)。粘合剂与交联透明质酸凝胶混合。典型粘合剂包括非交联透明质酸、盐(例如，CaCl₂)、赋形剂、利多卡因等。

水性组合物可包含任何含水介质，例如酸、碱、缓冲液或盐。可使用缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(例如，pH7.4的10mM PBS)。也可使用氯化钙溶液(例如，1mM、2.5mM或5mM)。可使用氢氧化钠(NaOH)溶液(例如，0.1M、0.2M、0.3M或0.5M)。

制成具有更高或更低浓度的透明质酸和交联HA的组合物；仅作为实例给出了下面3种组合物。

在一种组合物中，例如，最终挤出组合物含有12％(w/w)交联透明质酸和3％(w/w)非交联HA，其中交联透明质酸源自与10％透明质酸和4％BDDE或8％透明质酸和3.2％BDDE的交联反应。

在另一种组合物中，最终挤出组合物含有8％(w/w)交联透明质酸和2％(w/w)非交联HA，交联透明质酸源自与10％透明质酸和4％BDDE或8％透明质酸和3.2％BDDE的交联反应。

在又一种组合物中，最终挤出组合物含有5％(w/w)交联透明质酸和5％(w/w)非交联HA，交联透明质酸源自与10％透明质酸和4％BDDE的交联反应。

挤出

然后将最终凝胶制剂挤到适合表面上以产生湿线。根据最终所需的线厚度使用各种喷嘴尺寸(例如，20G、19G、18G、17G、16G)。

将最终凝胶制剂转移到加压挤出机(例如，EFD Model XL1500气动分配机)。挤出机的喷嘴可具有范围从15规格至约25规格的尖端。根据最终凝胶制剂的粘度，注射器压力可介于约10psi和约2000psi之间。对于非常粘的凝胶制剂，可使用压力倍增器。

然后通过用挤出机将最终凝胶组合物挤到基底上形成湿线，以获得所需湿线厚度。例如，为获得类似干燥直径，对于15％透明质酸组合物可使用20规格针，或对于10％透明质酸组合物可使用19规格针。

线干燥

然后可在环境条件下将湿线干燥到小于约30％或小于约15％或小于约10％的水合百分比，从而提供干线。任选地，可使线在约20％至约80％的相对湿度下，在约20℃至约37℃下干燥。例如，线可在环境条件下风干2天。

任选地，在线干燥之前，可将湿线拉伸到所需长度并且在干燥之前减小直径。拉伸可通过悬挂所述线的一端并且向对端施加重力，或通过在表面(与挤出表面相同或不同)上水平拉伸湿线并且将末端粘附到表面上。

附着于针上

可使用已知技术使干线附着于针上(见，例如，图2、3A和3B)。

灭菌

可使用电子束(e-beam)灭菌法为本文所述的线灭菌。在pH10的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲溶液中洗涤如实施例1中所制备的与BDDE交联的线。一些溶液进一步含有1mM抗坏血酸、10mM抗坏血酸、100mM抗坏血酸、1M抗坏血酸、10mM维生素E和50mM Na₃PO₄。然后在4kGy或20kGy下使用标准电子束技术为线灭菌。在一些实施方案中，在灭菌之前改变线的温度。在一些实施方案中，线的温度降低到约-20℃。在一些实施方案中，灭菌后线刚好低于5℃。

使用以上公开的步骤，线可使用下面公开的任一方法制备。

实施例1A：方法1

可使用下列步骤制备线：

1.交联；

2.冲洗；

3.定径；

4.干燥；

5.用粘合剂调配交联HA；

6.除气；

7.挤出；

8.线干燥；

9.附着于针上；和

10.灭菌。

实施例1B：方法2

也可使用下列步骤制备线：

1.交联；

2.冲洗；

3.定径；

4.干燥；

5.用粘合剂调配交联HA；

6.除气和高压灭菌；

7.挤出；

8.线干燥；

9.附着于针上；和

10.灭菌(任选)。

实施例1C：方法3

也可使用下列步骤制备线：

1.交联；

2.挤出；

3.线干燥；

4.冲洗；

5.线干燥；

6.附着于针上；和

7.高压灭菌。

实施例1D：方法4

也可使用下列步骤制备线：

1.交联；

2.冲洗；

3.定径并用粘合剂调配交联HA；

4.干燥；

5.除气；

6.挤出；

7.线干燥；

8.附着于针上；和

9.灭菌。

实施例1E：方法5

也可使用下列步骤制备线：

1.交联；

2.冲洗；

3.定径；

4.从乙醇中沉淀并干燥；

5.用粘合剂调配交联HA；

6.除气；

7.挤出；

8.线干燥；

9.附着于针上；和

10.灭菌(任选)。

实施例2：洗涤(再水合)和再次干燥所述线

用水性溶剂洗涤干线以去除所有污染物，例如未反应的交联剂。所述洗涤可通过各种方法进行，例如浸入水性溶剂中或通过使用并流系统，将线倾斜放入槽中并使水性溶剂溢过线。另外，一旦再水合，就可在再次干燥之前拉伸所述线。所述拉伸可通过以上实施例1中描述的方式进行。然后再次干燥经再水合和洗涤的线以提供干线。所述再次干燥通常在环境条件(即，环境温度和/或压力)下进行约8小时至约24小时，或直至干线的水合百分比小于约30％。可洗涤所述线几次(例如，10次或更多次)，不会失去其结构完整性。在多个洗涤循环过程中，线的总长度可增加约25％至约100％。

实施例3：样品线

下面表1中提供了由实施例1的方法制备的样品线。

表1

％HA固体＝交联和非交联HA；NXL＝非交联HA

实施例4：线的物理特性

评价如上所述制备的各种线的线密度、干线圆度和直径。通过测量测定长度的线的重量并且计算重量与长度的比例测定线密度。通过轴向分割线并且测量指定横截面的最短(W)和最长直径(T)测定干线圆度(W:T)和直径(D)。圆度或纵横比为W:T的比例。线直径(D)是短径(W)和长径(T)的平均值。用20G、19G和18G针制成的线的平均线密度分别为1.78mg/in(n＝7)、2.61mg/in(n＝8)和2.07mg/in(n＝3)。

实施例5：不同线的极限抗拉强度比较

使用测力计(例如，Precision Instruments或Chatillon的数字式测力计)测试如上所述制备的各种线的抗拉强度。由线断裂时的重量决定破坏。通过拉力/破坏荷载除以线的横截面积计算极限抗拉强度。用20G和19G针制成的未灭菌的线的平均破坏荷载(按磅计)为约0.420lb至约1.172lb。用20G、19G和18G针制成的经电子束灭菌的线的平均破坏荷载(按磅计)为约0.330lb至约0.997lb。用20G和19G针制成的未灭菌的线的平均伸长率(按英寸计)为约0.028英寸至约0.192英寸。用20G、19G和18G针制成的经电子束灭菌的线的平均伸长率(按英寸计)为约0.021英寸至约0.078英寸。用20G和19G针制成的未灭菌的线的平均抗拉强度(按psi计)为约3236psi至约19922psi。用20G和19G针制成的经电子束灭菌的线的平均抗拉强度(按psi计)为约1943psi至约12859psi。

实施例6：溶胀数据

V2/V0表示的质量溶胀比是溶胀凝胶重量相对于完全干燥的凝胶重量之比(表2和3)。

计算从20G挤出喷嘴挤出的平均干线直径为0.0132英寸的线的直径溶胀比(水合线与干线之比)。测试的每根线的直径溶胀比为1.5或更高，平均直径溶胀比为1.55。

表2

表3

实施例7：用透明质酸酶酶促降解所述线

在37℃下，在1mL缓冲液(100mM醋酸钠，pH4.5，150mM NaCl)中用1mg/mL透明质酸酶温育线；对照线不存在透明质酸酶。在不同时间，抽取40μL等分试样的上清液并通过咔唑测定法(CarbazoleAssay)(Cesaretti,M等，Carbohydrate Polymers54:59-61(2003)测定透明质酸。垂直箭头对应添加1mg/mL的新鲜透明质酸酶。在缓冲液中用1mg/mL的新鲜酶更换上清液。对于线A-F：A＝10/4015/20CaCl₂；B＝10/4015/40；C＝10/4015/20；D＝10/4010/50；E＝8/4015/20H₂O洗剂；F＝8/4015/20；G＝10/4015/20CaCl₂的对照；H＝10/4015/40的对照；I＝10/4015/20的对照；J＝8/4015/20的对照。在图12和表4中示出了这些酶促降解的详情。这表明，不存在透明质酸酶的对照线不会在随监测时间推移而降解，而存在透明质酸酶的线确实降解。

表4：降解速率(前5个数据点线性拟合的斜率)

	A	B	C	D	E	F	G	H	I	J
											降解速率*	0.014	0.011	0.010	0.007	0.041	0.023	0.00	0.00	0.00	0.00

*mg HA/天

实施例8：触诊数据

盲法评价者为每只动物的所有样品位点触诊和评分并且将值记录在预先印好的数据表上。基于样品位点汇编数据并且求平均值。评价者的评分为0＝没有植入物的触觉体征，1＝有轻微的植入物触觉体征，并且2＝高度的植入物触觉体征。在整个研究持续期间，以预先指定的间隔按方案对试验受试者进行植入物触觉评分(定性触诊)，测量植入后的表面真皮反应。测量的反应是植入物的长度连续性。例如，如果从两个点触诊并且感觉植入物连续，没有断裂，则将评级为“2”，如果感觉植入物在纵向上断断续续，则将评级为“1”，并且如果没有检测到植入物，则评分将评级为“0”。图13中示出了天数对比平均触诊评分的图。

实施例9：组织学研究

含有线植入物的组织样品在酸-福尔马林乙醇固定剂中固定，之后包埋在甲基丙烯酸甲酯中。用苏木精和伊红(H&E)以及阿辛蓝(Alcian blue)和中性红为组织学切片染色以分别使细胞反应和植入物存在可见。图9A、9B、9C、9D、9E和9E中示出了8/4015/20制剂的1月、2月、3月、6月和9月组织学图像。样品在外观上相似，表明线在体内是持久的。

实施例10：兔子中透明质酸线的研究

在长期性兔子研究中评价了线制剂的体内性能，包括持续性和生物反应。本文所述的线制剂植入新西兰白兔的背侧真皮中并且在1周、1月、2月、3月、6月和9月时间点进行评价。生命期间，通过触诊和触觉评分系统评价植入部位的植入物存在性(见实施例8)。按预定时间间隔，使动物安乐死并且收获植入部位进行总体和组织学评价。用解剖刀轴向横截一组植入部位并且在显微镜下评价真皮组织中植入材料的视觉存在性。对植入部位施加压力以评估植入物是否在组织内良好整合或是否可从植入部位挤出。固定其余植入部位并且加工以进行组织学评价(见实施例9)。图10和11分别示出了8/4015/20制剂的1月和2月组织学图像，表明线仍然存在。

实施例11：用透明质酸线治疗皱纹

皮下注射针(22至25Ga)固定有单股或双股透明质酸线(与BDDE交联)，厚度范围从0.004in至0.008in。样品在29kGy下通过NuTekCorp.经电子束灭菌。针将附着的线拉入皮肤。治疗的皱纹是鼻唇褶、口周、眶周、额(前额)和眉间的皱纹。然后针将线拉过皮肤，使得线位于针先前插入之处。可使用一根以上的线治疗皱纹，以便达到所需填充效果(2-4根或更多根线)。线水合后皱纹明显减轻。

实施例12：丰唇

可为患者植入HA线进行丰唇，外形修复和/或丰满化。患者可在面部接受局部麻醉剂，但是根据下列工序并不特别适用于唇部：

●剥开囊腔并且移除容纳HA(透明质酸)线的无菌托盘。

●使用无菌手套或无菌装置，例如镊子，从托盘中移除所需HA线。

●将针的尖端插入预期治疗区域的一个边缘。

●转移预期治疗区域下或附近的皮肤内的针。如果在任何时刻，针不在所需位置，使针轻轻缩回并重新插入以修正位置。

●使用针的尖端在预期治疗区域的反向边缘退出皮肤。如果针不在所需位置，使针轻轻缩回并重新插入以修正位置。

●确认针的理想的位置后，在远端迅速拉针，将线拉入皮肤中的位置。

●使用无菌手术剪或解剖刀，截去从治疗区域两个边缘上的皮肤伸出的多余线。这样有效地将针分开，针应适当丢弃。

增强区域可包括唇部抹消和外形修复的朱红色唇缘(或白卷)和增加丰满度的湿-干粘膜接合处。其它技术包括口轮匝肌的更加扩散的浸润。主治临床医师能够根据所需效果选择线放置的位置、线的数量和线的尺寸。预计每个区域用1-2根线治疗，其中当线干燥时，每根线的直径从200μm至约500μm。水合后，预计线的直径从0.5mm至约5mm。

实施例13：测定交联水凝胶中BDDE衍生物与HA之比的NMR研究

进行NMR研究以测定交联HA水凝胶中1,4-丁二醇二缩水甘油醚衍生物(BDDE)与透明质酸二糖亚基的比例。在8和10％的HA浓度下，分别与3.2和4％BDDE交联，制成水凝胶。充分冲洗所述凝胶以去除残留的BDDE，用透明质酸酶消化并且干燥。将所得粉末溶于D₂O中并且通过质子NMR分析。通过比较来自1,4-丁二醇的内亚甲基氢在1.6ppm下的峰值和N-乙酰葡糖胺的乙酰甲基在2.0ppm下的峰值测定BDDE与HA二糖亚基的比例。在等摩尔量的BDDE和二糖亚基下，这些峰面积应分别积分为4和3。8％HA水凝胶的结果产生分别积分为0.75和3的峰面积，与每摩尔二糖亚基约0.19摩尔BDDE相对应。10％HA水凝胶的结果产生分别积分为0.72和3的峰面积，与每摩尔二糖亚基约0.18摩尔BDDE相对应。

用第二批凝胶重复对8/40制剂的实验并且产生每摩尔二糖亚基0.217摩尔BDDE的结果。因此8/40凝胶中的平均BDDE百分比为20％±2％S.D.。下面表5示出了另外的制剂。

表5

*摩尔％

实施例14：交联对线的体内持久性的影响-动物数据比较

将通过下列方法制备的灭菌透明质酸线置于动物体内并评价体内持久性。

部分14A

由在10mM碳酸氢钠缓冲液(pH10)调配并且与10％(相对于HA质量)1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)交联的10％w/w透明质酸(MW＝1.47MDa)凝胶制备HA线。在最后干燥(风干)之前，在含有100mM抗坏血酸的Tris缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl)中冲洗试验样品1和2中的线，在含有100mM维生素E的Tris缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl)中冲洗试验样品3和4中的线，在水中冲洗试验样品5和6中的线。在10mM Tris缓冲液(pH7)而非10mM碳酸氢钠缓冲液(pH10)中制备试验样品7和8中的线并且在最后干燥之前在水中冲洗。干燥的线形状呈圆柱形，直径为0.006-0.008"并且长度为1.0-1.5"。皮下注射用不锈钢27规格薄壁Keith针用于所有试验样品。针长度为2¹/₂”并且具有单斜式尖端。通过机械卷曲将交联HA线附着于针上。通过电子束照射为试验样品最终灭菌。试验样品1和3接受4kGy的照射剂量。试验样品2和4接受20kGy的照射剂量。试验样品6和8接受20kGy冷冻照射剂量。在无菌样环境中加工试验样品5和7并未经最终灭菌。

体内持久性研究(利用10只斯普拉-道来氏大鼠(Sprague Dawleyrat))的结果表明，到一周时不可检测到试验样品2中的所有线。植入的试验样品1、3、4和6的线到一周时消失，在一周时在小细胞浸润物中仅发现少量细胞内颗粒。在一周时，在经试验样品3和4治疗的部位中看到比经试验样品1治疗的部位更多的残留材料，这表明对那些线的吸收率更慢。在第3周时没有看到植入的试验样品1、2、3或4的材料。另外，到第30天不可检测到来自试验样品5、6、7和8的所有线。

部分14B

通过将HA溶于10mM TRIS缓冲液(pH7)中制备0.75％w/w透明质酸(1.7MDa)溶液。向HA溶液中添加丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)并且搅拌溶液过夜。BDDE与HA之比为2:1。然后使用截留分子量为约12至约14KDa的透析膜，用过量去离子水透析大体上交联的HA溶液。然后冻干透析溶液以获得干燥的大体上交联的透明质酸。将干燥交联透明质酸(2.0g)暴露于25KGy电子束(照射温度1-3℃)，在10mM TRIS缓冲液(pH7.00)中调配成16％固体(w/w)，挤出并且在环境温度下干燥约48小时。

交联后在25kGy、0.020"直径下照射试验样品9，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。交联后在25kGy、0.010"直径下照射试验样品10，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。试验样品11直径为0.020"，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。交联后在25kGy、0.020"直径下照射试验样品12，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。交联后在25kGy、0.010"直径下照射试验样品13，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。试验样品14直径为0.020"，在无菌样环境中加工并未经最终灭菌。

在兔子体内植入试验样品9-14的线。从每只动物中移除含总共20个治疗部位的皮肤段。加工并分析选择样本(从经试验样品9-14治疗的部位的每根线取4个/组/个时间点)。试验样品9、10和13的线的完全吸收到7天时出现。试验样品12的线的完全吸收在7和30天之间出现。到30天时出现试验样品14的线的几乎完全或完全吸收并且出现试验样品11的线的部分吸收。

部分14C

根据实施例1制备6根交联的线。试验样品15-20的线制备如下。通过用按相对于总组合物的重量计，用浓度10％的透明质酸和4％BDDE，剩余部分由0.1N氢氧化钠组成，形成凝胶制成直径介于0.008英寸和0.010英寸之间的交联线。交联凝胶中BDDE与HA之比为每摩尔二糖亚基0.18摩尔的BDDE。冲洗、预先定径、冻干和与非交联粘合剂结合后，再使用20G针将凝胶挤成线形。然后干燥湿线约48小时以提供干线。

表6.试验样品组成/加工

PB＝10mM磷酸钠缓冲液，pH6

通过宏观观察和组织学分析成功评估了试验样品。所有试验样品均可通过90天宏观观察鉴定，但是试验样品20除外，在135和180天时鉴定不一致。在组织学上，在早期时间点所有试验样品均可定性鉴定。定性地，试验样品15、16、17和18展示出比试验样品19和20更多的降解证据。定量分析试验样品20的降解并且横截面积持久，在270天时没有显著变化。

因此，正如从以上数据可见，本发明交联更多的线比交联更少的线在体内更持久。

Claims (76)

1.一种包含至少5％透明质酸的组合物，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物大体上交联。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述大体上交联的透明质酸与约15至约25摩尔％的所述BDDE衍生物交联。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述大体上交联的透明质酸与约17至约20摩尔％的所述BDDE衍生物交联。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述大体上交联的透明质酸与相对于所述透明质酸的重量为至少约12重量％的所述BDDE衍生物交联。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含约8％透明质酸。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含约10％透明质酸。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含约12％透明质酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述透明质酸的分子量为约0.5至约3.0MDa。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述交联透明质酸的存在量按所述组合物的总重量计为约1重量％至约50重量％。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述交联透明质酸的存在量按所述组合物的总重量计为约5重量％至约20重量％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其进一步包含粘合剂。

12.根据权利要求11的任一项所述的组合物，其中所述粘合剂为非交联透明质酸。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述非交联透明质酸的存在量按所述组合物的总重量计为约1重量％至约15重量％。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述非交联透明质酸的存在量按所述组合物的总重量计为约2重量％至约8重量％。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物包含约5重量％至约15重量％交联透明质酸和约2重量％至约8重量％非交联透明质酸。

16.一种线，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的组合物。

17.一种线，其通过干燥根据权利要求16所述的线的方法制备。

18.一种包含大体上交联的透明质酸的线，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物大体上交联，并且包含相对于总透明质酸固体的重量为至少约5％的非交联透明质酸。

19.根据权利要求18所述的线，其中所述大体上交联的透明质酸与约15摩尔％至约25摩尔％的所述BDDE衍生物交联。

20.根据权利要求19所述的线，其中所述大体上交联的透明质酸与约17摩尔％至约20摩尔％的所述BDDE衍生物交联。

21.根据权利要求20所述的线，其中所述大体上交联的透明质酸与相对于所述交联透明质酸的重量为至少约18重量％的所述BDDE衍生物交联。

22.根据权利要求18-21中任一项所述的线，其中所述交联透明质酸的存在量按所述线除水分外的总重量计为约60重量％至约90重量％。

23.根据权利要求22所述的线，其中所述交联透明质酸的存在量按所述线除水分外的总重量计为约70重量％至约80重量％。

24.根据权利要求18所述的线，其中所述非交联透明质酸的存在量按所述线除水分外的总重量计为约10重量％至约40重量％。

25.根据权利要求24所述的线，其中所述非交联透明质酸的存在量按所述线除水分外的总重量计为约15重量％至约25重量％。

26.根据权利要求16-25中任一项所述的线，其中所述线的极限抗拉强度为约2kpsi至约20kpsi。

27.根据权利要求26所述的线，其中所述线的极限抗拉强度为约4kpsi至约10kpsi。

28.根据权利要求16-27中任一项所述的线，其中所述线的直径为至少约0.004英寸。

29.根据权利要求28所述的线，其中所述线的直径为约0.011至约0.016英寸。

30.根据权利要求16-29中任一项所述的线，其中所述线的重量/长度比为约1.5至约3.5毫克/英寸。

31.根据权利要求16-30中任一项所述的线，其中所述线的破坏荷载为约0.3磅或更高。

32.根据权利要求31所述的线，其中所述线的破坏荷载为约0.3至约1.3磅。

33.根据权利要求16-32中任一项所述的线，其进一步包含附着于所述线的针。

34.一种包含大体上交联的透明质酸的干线，其通过以下步骤制备：

a)通过使包含至少5％透明质酸的组合物与丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)接触来形成大体上交联的透明质酸，使得所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重复二糖单元为至少约15摩尔％的丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)衍生物交联；

b)向所述组合物中添加非交联透明质酸；

c)挤出所述大体上交联的组合物以形成湿线；和

d)干燥所述湿线以形成干线。

35.根据权利要求34所述的干线，相对于所述组合物的重量，约5至约15重量％透明质酸与约2至约8重量％的BDDE接触。

36.根据权利要求34或35中任一项所述的干线，其中所述透明质酸与相对于所述透明质酸的重量为约40重量％的BDDE接触。

37.根据权利要求36所述的干线，其中所述交联透明质酸与约15至约25摩尔％的所述BDDE衍生物交联。

38.根据权利要求37所述的干线，其中所述交联透明质酸与约17至约20摩尔％的BDDE衍生物交联。

39.根据权利要求34所述的干线，其中所述交联透明质酸与相对于所述交联透明质酸的重量为至少约12重量％的所述BDDE衍生物交联。

40.根据权利要求34-39中任一项所述的干线，其中相对于所述组合物的重量，至少8％透明质酸与BDDE接触。

41.根据权利要求40所述的干线，其中相对于所述组合物的重量，约10％透明质酸与BDDE接触。

42.根据权利要求40所述的干线，其中相对于所述组合物的重量，约12％透明质酸与BDDE接触。

43.根据权利要求34-42中任一项所述的干线，其中所述透明质酸为水溶液。

44.根据权利要求43所述的干线，其中所述溶液的pH>7.0。

45.根据权利要求44所述的干线，其中所述溶液包含氢氧化钠。

46.根据权利要求34所述的干线，其中洗涤步骤a)的所述交联透明质酸组合物。

47.根据权利要求34所述的干线，其中步骤a)的所述组合物包含按所述组合物的总重量计量为约1重量％至约50重量％的交联透明质酸。

48.根据权利要求47所述的干线，其中步骤a)的所述组合物包含按所述组合物的总重量计量为约5重量％至约20重量％的交联透明质酸。

49.根据权利要求43-48中任一项所述的干线，其进一步包含干燥步骤a)的所述组合物。

50.根据权利要求34-49中任一项所述的干线，其中按所述组合物的总重量计，添加约1重量％至约15重量％的非交联透明质酸。

51.根据权利要求50所述的干线，其中按所述组合物的总重量计，添加约2重量％至约8重量％的非交联透明质酸。

52.根据权利要求34-51中任一项所述的干线，其中所述干线的极限抗拉强度为约2kpsi至约20kpsi。

53.根据权利要求52所述的干线，其中所述干线的极限抗拉强度为约20kpsi或更高。

54.根据权利要求34-53中任一项所述的干线，其中所述干线的破坏荷载为约0.3磅或更高。

55.根据权利要求54所述的干线，其中所述线的破坏荷载为约0.3至约1.3磅。

56.根据权利要求16-55中任一项所述的干线，其中所述线经最终灭菌。

57.一种治疗有需要的患者的皱纹的方法，所述方法包括：

a)将根据权利要求16-56中任一项所述的线插入所述患者的邻近所述皱纹或在所述皱纹下面的皮肤或皮下间隙；和

b)邻近所述皱纹或在所述皱纹下面施加所述线，从而治疗所述皱纹。

58.根据权利要求57所述的方法，其中步骤a)和b)进行2-6次。

59.根据权利要求57所述的方法，其中用针插入所述线。

60.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括将所述针从所述皮肤中移除。

61.根据权利要求57所述的方法，其进一步包括对所述线进行水合。

62.根据权利要求57所述的方法，其中在步骤a)之前，向所述线施加润滑增强剂。

63.一种用于治疗患者的皱纹的部件的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求16-56中任一项所述的线。

64.根据权利要求63所述的线，其进一步包含向患者递送所述线的装置。

65.一种在有需要的受试者中提供面部外形修复的方法，所述方法包括：

a)将根据权利要求16-56中任一项所述的线插入所述患者的邻近治疗部位或在治疗部位下面的皮肤或皮下间隙；和

b)邻近所述治疗部位或在所述治疗部位下面施加所述线，从而提供面部外形修复。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述治疗部位选自唇部、鼻唇褶和泪沟。

67.根据权利要求65所述的方法，其中步骤a)和b)进行2-6次。

68.根据权利要求65所述的方法，其中用针插入所述线。

69.根据权利要求68所述的方法，其进一步包括将所述针从所述皮肤中移除。

70.根据权利要求65所述的方法，其进一步包括对所述线进行水合。

71.根据权利要求67所述的方法，其中可将每根线植入表皮、真皮或皮下层。

72.根据权利要求67所述的方法，其中线彼此相对平行地植入。

73.根据权利要求67所述的方法，其中所述线彼此相对垂直地植入。

74.根据权利要求67所述的方法，其中所述线以交叉阴影线图案放置。

75.根据权利要求67所述的方法，其中所述线以阴影线图案放置。

76.一种部件的试剂盒，其包含根据权利要求16-56中任一项所述的线和针。