CN114351289B - 一种透明质酸纤维及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸纤维及其制备方法和应用，所述透明质酸纤维轴向有序；所述透明质酸纤维的表面具有沟槽；所述沟槽具有轴向有序的拓扑结构，所述沟槽的宽度为5‑50μm。本发明所述透明质酸纤维的结构有序，力学性能满足生物工程的应用，可通过接触引导作用定向调控细胞的行为及功能。
Description
技术领域
本发明涉及纤维技术领域，尤其涉及一种透明质酸纤维及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸纤维是目前生物医用材料中的一种重要材料。
CN111607844A公开了一种基于改性透明质酸的超分子纳米纤维的制备方法。由甲基丙烯酸酐和Phe-Cys-Cys-Phe四肽改性的透明质酸与葫芦脲发生主客体相互作用形成超分子结构再结合静电纺丝技术制得。其公开的方法通过对透明质酸改性而赋予的共价键和非共价键，可以解决透明质酸在组织工程和医药领域中极易溶于水、在组织中停留时间短、降解速度快等涉及稳定性和机械强度的问题。另外改性透明质酸与静电纺丝技术相结合制备的纳米纤维，对于像神经修复领域需要的高比表面积纤维状结构也是具有重大意义的，因此，有望替代神经修复领域常用的如PCL，PLA，PU等高分子聚合物材料。
CN111793854A公开了一种制备透明质酸纤维材料的方法，其公开的方法包括以下步骤：将透明质酸和聚环氧乙烷溶于甲酸的水溶液，得到电纺丝溶液；将得到的电纺丝溶液进行静电纺丝，得到静电纺丝纤维；将得到的静电纺丝纤维进行交联得到透明质酸纤维材料。与现有技术相比，其公开的方法通过高、低分子量的透明质酸进行合理配比，并通过添加聚环氧乙烷制成透明质酸含量较高的静电纺丝液，增加了透明质酸的浓度，同时改善了聚合物之间的缠结，提高了透明质酸电纺液的可纺性，增加了纤维的强度和柔韧度；制得的纤维材料，可以吸收人体或外界多余的液体，提高材料的柔软性和舒适度，同时可以提高材料的防护能力。
透明质酸纤维表面结构的有序性利于定向调控细胞的行为及功能，开发一种表面结构有序的透明质酸纤维至关重要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸纤维及其制备方法和应用，所述透明质酸纤维的结构有序，力学性能满足生物工程的应用，可通过接触引导作用定向调控细胞的行为及功能，在再生医学中具备重要的应用价值。
第一方面，本发明提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维轴向有序；
所述透明质酸纤维的表面具有沟槽；
所述沟槽具有轴向有序的拓扑结构，所述沟槽的宽度为5-50μm，例如16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、21μm、22μm、23μm、24μm等。
本发明所述结构的透明质酸纤维，具有较高的表面积比和表面能、较小的尺寸效应和表面效应，以及与天然细胞外基质相似的结构，从而为细胞在体外的生长、发育和细胞间的信号传导提供理想的微环境。而具体尺寸的设置是考虑到其应用实例，即在作为引导神经干细胞定向迁移分化的生物支架材料时，与细胞尺寸相当的沟槽可引导NSCs的定向迁移。
本发明所述结构的高度有序性，轴向有序结构具有重要的意义：纤维状结构是生物组织的基本结构形式，胶原纤维、神经元轴突、纤维状细胞群聚(如成纤维细胞)等都以纤维状结构的形式存在于生物体内，并在生命活动中发挥重要作用。另外，拓扑结构调节细胞功能。纤维孔洞大小及分布、沟槽的尺寸和取向等对细胞迁移和分化有重要影响。因此，可通过接触引导作用定向调控细胞的行为及功能，在再生医学中具备重要的应用价值，尤其是组织工程支架材料。
优选地，所述沟槽的内壁还分布有轴向有序的纳米结构，所述纳米结构的宽度为100-800nm，例如200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm等。
本发明中，沟槽的宽度和纳米结构通过扫描电镜进行观察。
优选地，所述透明质酸纤维的直径为50μm-500μm，例如100μm、200μm、300μm、400μm等。
优选地，所述透明质酸纤维的制备原料包括透明质酸、含巯基的化合物、含不饱和双键的化合物、光引发剂、纺丝溶剂和含有极性溶剂的凝固浴；
或，
所述透明质酸纤维的制备原料包括修饰后的透明质酸、光引发剂、纺丝溶剂和含有极性溶剂的凝固浴；
所述修饰后的透明质酸包括经巯基和双键改性的透明质酸。
本发明仅以纯透明质酸为原料进行改性，生物相容性良好；以修饰后的透明质酸为原料，也能制备所述结构的透明质酸纤维。
本发明中，凝固浴中含有极性溶剂，原因在于通过溶剂交换促进透明质酸分子链间的疏水作用和侧链间的氢键作用，产生径向应力从而在纤维表面形成轴向有序拓扑结构。
优选地，以所述透明质酸的重量为100份计，所述含巯基的化合物的重量份数为1-20份，例如5份、10份、15份等。
本发明中，以所述透明质酸的重量为100份计，所述含巯基的化合物的重量份数为1-20份，此范围内巯基-烯反应效率最高，形成的纤维性能较好；添加量过低使巯基-烯反应不充分，成胶不充分。
优选地，所述含不饱和双键的化合物的重量份数为1-100份，例如25份、50份、75份等。
本发明中，以所述透明质酸的重量为100份计，所述含不饱和双键的化合物的重量份数为1-100份，此范围内巯基-烯反应效率最高，形成的纤维性能较好；添加量过低使巯基-烯反应不充分，成胶不充分。
优选地，所述透明质酸的数均分子量为1.5×103–1.8×106g/mol，例如1×104g/mol、5×104g/mol、8×104g/mol、1×105g/mol、5×105g/mol、8×105g/mol等。
优选地，所述含巯基的化合物包括二硫苏糖醇、巯基丙酸、巯基丁二酸或巯基乙胺中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：二硫苏糖醇和巯基丙酸的组合，巯基丙酸、巯基丁二酸和巯基乙胺的组合，二硫苏糖醇、巯基丙酸、巯基丁二酸和巯基乙胺的组合等。
优选地，所述含不饱和双键的化合物包括降冰片烯、甲基丙烯酸酐或甲基丙烯酸缩水甘油酯中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：降冰片烯和甲基丙烯酸酐的组合，甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸缩水甘油酯的组合，降冰片烯、甲基丙烯酸酐和甲基丙烯酸缩水甘油酯的组合等。
优选地，所述纺丝溶剂包括磷酸缓冲盐溶液(PBS)和/或CaCl2溶液。
本发明中所述纺丝溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和/或CaCl2溶液，相较于现有技术常用的超纯水，结合透明质酸分子中羧酸根离子和纺丝溶剂中金属离子，利用离子交联作用提升透明质酸纤维的性能。
本发明中，所述CaCl2溶液优选质量浓度为1％～30％的溶液。
优选地，所述凝固浴包括极性溶剂。
优选地，所述极性溶剂包括二甲基亚砜(DMSO)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)或石油醚中的的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性组合包括：二甲基亚砜和四氢呋喃的组合，四氢呋喃和二甲基甲酰胺的组合，二甲基亚砜、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和石油醚的组合等。
本发明中，凝固浴中的极性溶剂选自DMSO，原因在于通过溶剂交换促进透明质酸分子链间的疏水作用和侧链间的氢键作用，产生径向应力从而在纤维表面形成轴向有序拓扑结构。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的透明质酸纤维的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将透明质酸纤维的制备原料进行湿法纺丝，得到表面具有轴向有序结构的透明质酸纤维。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1、将透明质酸先经过含不饱和双键的化合物修饰处理，得到经不饱和双键修饰的透明质酸，再将经不饱和双键修饰的透明质酸、含巯基的化合物和纺丝溶剂混合，挤压的同时对挤出部分进行固化，得到透明质酸微纤维；
步骤2、将挤压后的透明质酸微纤维浸入含有极性溶剂的凝固浴中，静置，得到所述透明质酸纤维；
或，
步骤1、将修饰后的透明质酸、光引发剂和纺丝溶剂混合，挤压的同时对挤出部分进行固化，得到透明质酸微纤维；
步骤2、将挤压后的透明质酸微纤维浸入含有极性溶剂的凝固浴中，静置，得到所述透明质酸纤维。本发明利用巯基-烯点击反应高效快速的性质，结合透明质酸分子中羧酸根离子和纺丝溶剂中金属离子的离子交联作用的动态稳定性，通过固化和简单的挤压，制备纯透明质酸水凝胶微纤维。在空气中拉伸中，透明质酸微纤维的重力赋予挤出纤维一定的径向拉伸力，使其具有轴向有序结构；通过在凝固浴中溶剂交换的过程，纤维内部透明质酸分子链间的疏水作用和分子间氢键作用增强，使纤维表面产生径向收缩应力，从而在纤维表面进一步形成具有表面沟槽的有序拓扑结构。
本发明所述方法条件温和，工艺绿色、简便，反应过程不会引起毒副作用。
优选地，步骤1中，所述挤出在避光条件下进行。
优选地，所述固化的方式为光固化。
步骤1示例性地操作方式为：将所述原料混合后，形成纺丝溶液，将纺丝溶液放在注射器中，注射器外面包锡纸避光，挤出来的部分进行光固化，实现挤压的同时完成固化。
优选地，所述挤压的速度为4-20mL/h，例如5mL/h、6mL/h、7mL/h、8mL/h、9mL/h、10mL/h、11mL/h、12mL/h、14mL/h、16mL/h、18mL/h等。
优选地，步骤3中，所述静置的时间为5-60min，例如15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min等。
第三方面，本发明提供一种第一方面所述的透明质酸纤维，或，第二方面所述的方法制备得到的透明质酸纤维在生物医用材料中的应用，尤其是作为组织工程支架材料的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述透明质酸纤维的结构有序，力学性能满足生物工程的应用，可通过接触引导作用定向调控细胞的行为及功能。
(2)本发明所述透明质酸纤维的屈服强度在0.1kPa～2.000MPa之间，拉伸强度在0.1kPa～1.000MPa之间，断裂伸长率在1％-30％之间，所述透明质酸纤维力学性能优异。
附图说明
图1是实施例1所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图2是实施例1所述的透明质酸纤维的局部放大的微观形貌图；
图3是对比例1所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图4是对比例2所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图5是实施例1-4所述的透明质酸纤维的力学性能对比图；
图6a是实施例5所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图6b是实施例6所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图6c是实施例7所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图6d是实施例8所述的透明质酸纤维的微观形貌图；
图7a是实施例1所述的透明质酸纤维的引导神经干细胞生长对比图；
图7b是对比例1所述的透明质酸纤维的引导神经干细胞生长对比图；
图8是实施例1所述的透明质酸纤维导神经干细胞生长的共聚焦图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维的表面具有轴向有序结构，其微观形貌图如图1所示，局部放大图如图2所示，长度为1m，直径为150μm，沟槽的宽度为20μm，所述沟槽的内壁还分布有轴向有序的微裂结构，所述纳米级结构的宽度分布在100-800nm之间，平均宽度为400nm。
所述透明质酸纤维的制备方法包括如下步骤：
(1)取500mg分子量为1.5-1.8×106Da的透明质酸(购于sigma，货号为53747-10G)溶解于100ml MES缓冲液(购自上海源叶，货号为R21352-100mL)(pH 5.5～6)中，室温下搅拌溶解(约2h)后加入4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉(DMTMM，购自sigma)2.0173g，活化透明质酸分子的羧基30min；随后滴加156μL 5-呋喃-2-甲胺(Norbmene)(约2min滴完)在室温下搅拌反应过夜(约12h)；将反应后的溶液用7kDa的透析袋透析(第一天用10X的PBS，第二三天用超纯水，每天换三次水)以除去未反应的小分子，冻干后得到降冰片烯改性的透明质酸(HA-Nb)；
(2)称取30mg HA-Nb(降冰片烯和透明质酸羧基摩尔比为0.5:1，记为HA-Nb-0.5)溶于900μL PBS中，搅拌后超声使充分溶解，避光取3mg二硫苏糖醇(DTT)和5mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)溶于100μL超纯水中，将二者混合均匀并离心去除气泡得到纺丝原液；
(3)用1mL注射器吸取纺丝原液，然后将其用铝箔纸包住注射器外表面以避光，再在注射器上连接规格型号为30G(挤出内径约300μm，具体实验中纤维直径会因冻干时溶剂的不同而有不同程度的收缩)的注射针头，调整注射泵的挤出速度为12mL/h，通过微量挤出泵挤出后紫外光照下5秒内固化形成微纤维；
(4)在挤出针头以下距离4cm高处放置装有凝固浴DMSO的大皿，将形成的微纤维垂直浸入凝固浴中浸泡30min，随后收集冻干，得到具有表面拓扑结构的透明质酸微纤维。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的区别在于透明质酸的挤出针头规格分别为34G、32G和26G，分别为HA100、HA200和HA400，各自对应的挤出时的直径为100μm、200μm和400μm；其余均与实施例1相同。
实施例5-8
本实施例与实施例1的区别在于所述凝固浴中极性溶剂DMSO进行替换，具体如下：
实施例5：极性溶剂为THF，其余均与实施例1相同；
实施例6：极性溶剂为DMF，其余均与实施例1相同；
实施例7：极性溶剂为石油醚，其余均与实施例1相同；
实施例8：极性溶剂为无水乙醇，其余均与实施例1相同。
实施例9
本实施例提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维的表面具有轴向有序结构，长度为1m，直径为150μm。
所述透明质酸纤维的制备方法包括如下步骤：
本实施例的制备过程与实施例1的区别在于将降冰片烯替换为等质量的甲基丙烯酸酐，其余均与实施例1相同。
实施例10
本实施例提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维的表面具有轴向有序结构，长度为1m，直径为150μm。
所述透明质酸纤维的制备方法包括如下步骤：
本实施例的制备过程与实施例1的区别在于将二硫苏糖醇替换为等质量的巯基丁二酸，其余均与实施例1相同。
对比例1
本对比例提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维的表面粗糙的网状结构，其微观形貌图如图3所示，长度为1m，直径为130μm。
所述透明质酸纤维的制备方法包括如下步骤：
本对比例的制备过程与实施例1的区别在于将凝固浴DMSO替换为等质量的超纯水，其余均与实施例1相同。
对比例2
本对比例提供一种透明质酸纤维，所述透明质酸纤维的表面粗糙的纹理结构，其微观形貌图如图4所示，长度为1m，直径为130μm。
所述透明质酸纤维的制备方法包括如下步骤：
本对比例的制备过程与实施例1的区别在于将凝固浴DMSO替换为等质量的PBS，其余均与实施例1相同。
性能测试
将实施例1-10和对比例1-2进行如下测试：
(1)微观形貌：在扫描电镜(SEM)下进行观察；
(2)力学性能：
1)将纤维用双面胶粘在拉伸模具上；
2)万能材料试验机选择2kN的传感器，然后将材料放置在拉伸模具上；
3)设置试验机的拉伸速度为3mm/min，使用游标卡尺分别量取每根纤维的直径以及长度，设置好测试参数后将上部的拉伸模具缓慢上升使纤维处于平展状态；
4)将标尺的初始位移和应力调零后点击开始进行拉伸测试，当纤维断裂后测试完成。
测试结果汇总于图1-8和表1中。
表1
| 屈服强度(MPa) | 拉伸强度(MPa) | 断裂伸长率(％) | |
| 实施例1 | 1.046 | 0.637 | 15.6 |
| 实施例2 | 1.100 | 0.654 | 14.3 |
| 实施例3 | 0.497 | 0.296 | 9.8 |
| 实施例4 | 0.614 | 0.177 | 10.5 |
| 实施例5 | 0.508 | 0.318 | 10.1 |
| 实施例6 | - | - | - |
| 实施例7 | - | - | - |
| 实施例8 | - | - | - |
| 实施例9 | 0.668 | 0.422 | 11.2 |
| 实施例10 | 0.685 | 0.453 | 10.8 |
| 对比例1 | 0.324 | 0.233 | 6.7 |
| 对比例2 | 0.453 | 0.322 | 7.8 |
“-”代表未测试数据。
分析表1数据可知，本发明所述透明质酸纤维的屈服强度在0.497-1.100MPa之间，拉伸强度在0.177-0.637MPa之间，断裂伸长率在9.8％-15.6％之间，所述透明质酸纤维力学性能优异。
分析对比例1-2与实施例1可知，对比例1-2性能不如实施例1，证明本发明所述结构的透明质酸纤维性能更佳。
分析实施例1-4可知，实施例3-4性能不如实施例1，应力应变曲线图如图5所示，证明透明质酸的直径在100-400μm范围内形成的透明质酸纤维性能更佳。
分析实施例5与实施例1可知，实施例5性能不如实施例1，证明凝固浴中的极性溶剂选自DMSO、DMF或THF中的任意一种或至少两种的组合形成的透明质酸纤维性能更佳。
图1是实施例1所述的透明质酸纤维的微观形貌图，图2进行了局部放大；将图1与图3和图4进行对比发现，本发明所述透明质酸纤维轴向有序，表面沟槽也是轴向有序的拓扑结构。
图5是实施例1-4所述的透明质酸纤维的力学性能对比图，根据图5结果可知，本发明所述透明质酸纤维的力学性能可以在较宽的范围内进行调控，满足不同的应用场合。
图6a-6d是选择不同极性溶剂形成的透明质酸纤维的微观形貌图，证明选择合适的极性溶剂对透明质酸纤维的微观形貌的影响至关重要，优选DMSO。
图7a和7b分别是实施例1和对比例1所述的透明质酸纤维的引导神经干细胞生长对比图，二者对比发现本发明所述结构的透明质酸纤维更利于可通过接触引导作用定向调控细胞的行为及功能。
图8通过实施例1所述的透明质酸纤维导神经干细胞生长的共聚焦图对上述结论进一步佐证。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种透明质酸纤维，其特征在于，所述透明质酸纤维轴向有序；
所述透明质酸纤维的表面具有沟槽；
所述沟槽具有轴向有序的拓扑结构，所述沟槽的宽度为5-50μm；
所述透明质酸纤维的制备原料由透明质酸、含巯基的化合物、含不饱和双键的化合物、光引发剂、纺丝溶剂和含有极性溶剂的凝固浴组成；
以所述透明质酸的重量为100份计，所述含巯基的化合物的重量份数为1-20份，所述含不饱和双键的化合物的重量份数为1-100份；
所述含巯基的化合物为二硫苏糖醇或巯基丁二酸；
所述含不饱和双键的化合物为5-降冰片烯-2-甲胺或甲基丙烯酸酐；
所述纺丝溶剂包括磷酸缓冲盐溶液；
所述极性溶剂包括二甲基亚砜、四氢呋喃或二甲基甲酰胺中的任意一种或至少两种的组合；
所述透明质酸纤维通过如下方法制备得到：
步骤1、将透明质酸先经过含不饱和双键的化合物修饰处理，得到经不饱和双键修饰的透明质酸，再将经不饱和双键修饰的透明质酸、光引发剂、含巯基的化合物和纺丝溶剂混合，挤压的同时对挤出部分进行固化，得到透明质酸微纤维；
步骤2、将挤压后的透明质酸微纤维浸入含有极性溶剂的凝固浴中，静置，得到所述透明质酸纤维。
2.根据权利要求1所述的透明质酸纤维，其特征在于，所述沟槽的内壁还分布有轴向有序的微裂结构，所述纳米级结构的宽度为100-800nm。
3.根据权利要求1所述的透明质酸纤维，其特征在于，所述透明质酸纤维的直径为50μm-500μm。
4.根据权利要求1所述的透明质酸纤维，其特征在于，所述透明质酸的数均分子量为1.5×103-1.8×106g/mol。
5.一种权利要求1-4任一项所述的透明质酸纤维的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1、将透明质酸先经过含不饱和双键的化合物修饰处理，得到经不饱和双键修饰的透明质酸，再将经不饱和双键修饰的透明质酸、光引发剂、含巯基的化合物和纺丝溶剂混合，挤压的同时对挤出部分进行固化，得到透明质酸微纤维；
步骤2、将挤压后的透明质酸微纤维浸入含有极性溶剂的凝固浴中，静置，得到所述透明质酸纤维。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述挤压在避光条件下进行。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述固化的方式为光固化。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述挤压的速度为4-20mL/h。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述静置的时间为5-60min。
10.一种权利要求1-4任一项所述的透明质酸纤维，或，权利要求5-9任一项所述的方法制备得到的透明质酸纤维在生物医用材料中的应用。
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