CN105536064A - 一种复合型软组织修复水凝胶及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合型软组织修复水凝胶，它是以脱细胞胎盘微粉为原料制备而成的水凝胶，其中，原料和辅料的重量配比如下：氯化钠3.10～6.40份；氯化钾0.75份；氯化钙0.48份；醋酸钠3.10份～3.90份；壳聚糖6.00～20.00份；脱细胞胎盘微粉10.00份～30.00份。本发明还公开了其制备方法和用途。本发明复合型水凝胶的pH值、渗透压和粘度合适，而且无生物学毒性，有良好的组织相容性，可有效修复组织，临床应用前景良好。

Description

一种复合型软组织修复水凝胶及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物药物领域，具体涉及一种复合型软组织修复水凝胶及其制备方法和用途。
背景技术
胎盘是母体与胎儿进行物质交换的重要器官，富含细胞外基质和基底膜以及丰富的内源性生长因子。胎盘的细胞外基质具有类似于正常皮肤组织细胞再生真皮的功能，能有效调节全层皮肤伤口愈合的微环境，胎盘细胞因子也有助于创面修复；但胎盘中多种免疫原性物质直接接触机体会引发强烈的免疫反应，因此，以胎盘作为组织生物材料，通常采用脱细胞处理去除胎盘中的免疫原性物质。研究表明，脱细胞后的胎盘免疫原性低，且具有促进脂肪组织分化、促进创面修复的功能。
水凝胶是由具有三维网络结构的交联聚合物和作为分散介质的水组成的多元体系，能够在水中溶胀至平衡且保持其原有结构不被溶解。水凝胶具备以下特性：1)吸水能力强，吸收液体后可形成凝胶；2)低毒甚至无毒；3)生物相容性好，粘附蛋白质及细胞的能力很弱，不影响生命体的代谢；4)性能类似于细胞外基质，吸水后可减少对周围组织的摩擦和机械作用，水凝胶在生物医药领域，尤其是组织工程领域极具应用价值，可用作组织填充剂、人造皮肤、组织工程支架等材料。其中，用于涂敷的水凝胶具有载药量大、给药剂量、保湿性透气性好、易于药物吸收，使用方便等优点，是局部用药的优良载体。
公开号为CN104225667的专利申请公开了一种脱细胞胎盘组织组成的水凝胶，该水凝胶的制备需要对胎盘组织进行酶解，因此无法保留脱细胞胎盘的天然组织结构。此外，该水凝胶无法直接使用，在使用前必须在冰浴条件下加入预冷的无菌PBS等溶剂搅拌均匀，对使用人员的操作技能要求较高。
目前，未见可直接涂抹于用药部位的含有脱细胞胎盘组织的水凝胶的报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种可直接涂抹于用药部位的含有脱细胞胎盘组织的复合型软组织修复水凝胶及其制备方法和用途。
本发明复合型软组织修复水凝胶，它是以脱细胞胎盘微粉为原料制备而成的水凝胶，其中，原料药和辅料的重量配比如下：
优选地，所述原料药和辅料的重量配比如下：
优选地，所述原料药和辅料的重量配比如下：
优选地，所述原料药和辅料的重量配比如下：
优选地，前述脱细胞胎盘微粉的粒径为50～140目。
优选地，前述脱细胞胎盘微粉按照如下方法制备：
(1)取新鲜胎盘组织，清洗，加水，匀浆，离心，弃上清，得下层组织；
(2)取步骤(1)得到的下层组织，在甲醇和三氯甲烷的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；
(3)将步骤(2)得到的下层组织，在过氧乙酸和乙醇的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，过氧乙酸的浓度为0.1～0.3％(v/v)，乙醇的浓度为3～7％(v/v)；
(4)将步骤(3)得到的下层组织，震荡浸泡于浓度为0.3～0.7％(w/v)的十二烷基硫酸钠溶液中，浸泡4～10次，每次30～120min，震荡的频率为50～200r/min，离心，弃上清，清洗，得下层组织；
(5)-40～-80℃下真空冷冻干燥24～48h。
本发明还提供了前述水凝胶的制备方法，它包含如下步骤：
(a)按照权利要求1所述比例取原料和辅料；
(b)将各原料和辅料混合，得到复合水凝胶制剂；
(c)将复合水凝胶制剂预灌装至注射器中，辐照灭菌，即得。
优选地，步骤(c)中，所述辐照灭菌的剂量为15～25kGy。
本发明还提供了前述水凝胶在制备软组织修复材料中的用途。
采用本发明特定辅料，与本发明脱细胞胎盘微粉在本发明特定配比下，可以制备得到水凝胶，而其pH值、渗透压和粘度合适，无生物学毒性，有良好的组织相容性，可直接用于临床使用，涂抹于用药部位，有效修复组织，临床应用前景良好。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1常规组织学切片HE染色结果。其中，A：处理前的胎盘组织中有大量细胞(×200)；B：粉粹前的胎盘组织中未见有细胞残留(×200)。
图2外观图。其中，A：凝胶基质的外观图；B：复合型软组织修复水凝胶的外观图。
图3细胞毒性试验观察结果。其中：A：接种第1天细胞的生长情况；B：接种第3天细胞的生长情况。
图4植入后局部反应试验观察结果。其中：A：植入第7天周围组织的情况；B：接种第14天周围组织的情况。
具体实施方式
本发明各辅料均为市售品。
实施例1本发明复合型软组织修复水凝胶的制备
1.脱细胞胎盘微粉的制备
a取健康产妇胎盘，去除羊膜和脐带，用0.9％生理盐水多次浸泡清洗至胎盘组织呈淡黄色或白色，得到去除血液后的胎盘组织。
b将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:2混合，匀浆20min；将匀浆处理后的组织在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。
c将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。
d将c中处理得到的组织用0.18％的过氧乙酸和5％的乙醇混合溶液浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。
e将d中处理得到的组织用0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡10次，60min/次后，在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。
f将e中处理后所得的组织于-70℃下冷冻真空干燥48h，得到干燥的脱细胞胎盘基质。
g将f中获得脱细胞胎盘基质低温粉碎，得到脱细胞胎盘微粉。
2.复合型软组织修复水凝胶的制备
按照配方表1，制备复合型软组织修复水凝胶，预灌装，Co-60辐照灭菌(Co-60为钴的放射性同位素钴60，其为伽马射线源)，剂量为25kGy。
a将脱细胞胎盘微粉与甘油混合搅拌均匀，即为A液。
b按配方表1准确称量氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、枸橼酸钠、并加入适量注射用水溶解，搅拌均匀，即为B液。
c按配方表1准确称量壳聚糖、透明质酸钠、羧甲基纤维素均匀分散至适量的注射用水中充分溶胀，即为C液。
d依次将A液、B液、C液混合均匀，再加入适量的注射用水至总重1000g，再搅拌均匀，即为D液。
e将D液灌装至预灌封注射器中，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy，即得最终产品。
配方表1：
成分名称 添加量 备注
氯化钠 6.40g ——
氯化钾 0.75g ——
氯化钙 0.48g ——
氯化镁 0.30g ——
枸橼酸钠 1.70g ——
醋酸钠 3.90g ——
甘油 20g ——
壳聚糖 6.00g ＞300kD
透明质酸钠 10.00g ——
羧甲基纤维素 10.00g ——4 -->
脱细胞胎盘微粉 10g 140～120目
注射用水 加至总重1000g ——
实施例2本发明复合型软组织修复水凝胶的制备
1.脱细胞胎盘微粉的制备
a取健康产妇胎盘，去除羊膜和脐带，用0.9％生理盐水多次浸泡清洗至胎盘组织呈淡黄色或白色，得到去除血液后的胎盘组织。
b将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:2混合，匀浆20min；将匀浆处理后的组织在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。
c将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。
d将c中处理得到的组织用0.18％的过氧乙酸和5％的乙醇混合溶液浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。
e将d中处理得到的组织用0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡10次，60min/次后，在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。
f将e中处理后所得的组织于-70℃下冷冻真空干燥24h，得到干燥的脱细胞胎盘基质。
g将f中获得脱细胞胎盘基质低温粉碎，得到脱细胞胎盘微粉。
2.复合型软组织修复水凝胶的制备
按照配方表2，制备复合型软组织修复水凝胶，预灌装，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy。
a将脱细胞胎盘微粉与丙二醇混合搅拌均匀，即为A液
b按配方表2准确称量氯化钠、氯化钾、氯化钙、并加入适量注射用水溶解，搅拌均匀，即为B液。
c按配方表2准确称量壳聚糖、卡波姆、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素，并均匀分散至适量的注射用水中充分溶胀，即为C液。
d依次将A液、B液、C液混合均匀，再加入适量的注射用水至总重1000g，再搅拌均匀，即为D液。
e将D液灌装至预灌封注射器中，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy，即得最终产品。
配方表2：
成分名称 添加量 备注
氯化钠 3.10g ——
氯化钾 0.75g ——
氯化钙 0.48g ——
醋酸钠 3.10g ——5 -->
丙二醇 50g ——
壳聚糖 10g ＞300kD
卡波姆 6g ——
羧甲基纤维素 10g ——
羟丙基甲基纤维素 10g ——
脱细胞胎盘微粉 30g 110～90目
注射用水 加至总重1000g ——
实施例3本发明复合型软组织修复水凝胶的制备
1.脱细胞胎盘微粉的制备
a取健康产妇胎盘，去除羊膜和脐带，用0.9％生理盐水多次浸泡清洗至胎盘组织呈淡黄色或白色，得到去除血液后的胎盘组织。
b将a中处理得到的胎盘组织与纯化水以质量比1:2混合，匀浆20min；将匀浆处理后的组织在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，得到下层组织。
c将b中处理得到的组织用甲醇-三氯甲烷浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的有机残留量符合规定，得到下层组织。
d将c中处理得到的组织用0.18％的过氧乙酸和5％的乙醇混合溶液浸泡4h。之后在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的过氧乙酸和乙醇残留量符合规定，得到下层组织。
e将d中处理得到的组织用0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)浸泡10次，60min/次后，在3000g离心力下离心6min，弃去上清液，并反复用纯化水清洗并离心，直至组织中的表面活性剂残留量符合规定，得到下层组织。
f将e中处理后所得的组织于-70℃下冷冻真空干燥24h，得到干燥的脱细胞胎盘基质。
g将f中获得脱细胞胎盘基质低温粉碎，得到脱细胞胎盘微粉。
2.复合型软组织修复水凝胶的制备
按照配方表3，制备复合型软组织修复水凝胶，预灌装，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy。
a将脱细胞胎盘微粉与丙二醇混合搅拌均匀，即为A液
b按配方表2准确称量氯化钠、氯化钾、氯化钙、并加入适量注射用水溶解，搅拌均匀，即为B液。
c按配方表2准确称量壳聚糖、卡波姆，并均匀分散至适量的注射用水中充分溶胀，即为C液。
d依次将A液、B液、C液混合均匀，再加入适量的注射用水至总重1000g，再搅拌均匀，即为D液。
e将D液灌装至预灌封注射器中，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy，即得最终产品。
配方表3：
成分名称 添加量 备注
氯化钠 3.10g ——
氯化钾 0.75g ——
氯化钙 0.48g ——
醋酸钠 3.10g ——
甘油 50g ——
壳聚糖 20g ＞300kD
卡波姆 10g ——
脱细胞胎盘微粉 20g 80～50目
注射用水 加至总重1000g ——
以下通过实验例的方式说明本发明的有益效果：
实验例1本发明复合型软组织修复水凝胶的性质
1.检测方法
分别取实施例1、实施例2、实施例3制备的本发明复合型软组织修复水凝胶按照如下方法检测：
(1)胎盘组织处理前后细胞残留检测
通过常规石蜡切片，HE染色光学显微镜观察，实施例1的胎盘组织处理前后的细胞残留情况。
(2)pH值检测
分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的复合型软组织修复水凝胶，适量用蒸馏水做等质量比稀释，按照《中华人民共和国药典》二部ⅥH规定的方法测定。
(3)渗透压检测
分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的复合型软组织修复水凝胶，按照《中华人民共和国药典》二部附录ⅨG的方法测定。
(4)动力粘度检测
分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的复合型软组织修复水凝胶，采用旋转式粘度计，按照《中华人民共和国药典》二部附录ⅥG第二法测定(剪切速率不小于0.25Hz，温度控制25℃±0.1℃)。
(5)细胞相容性实验
在超净台中将复合型软组织修复水凝胶用细胞培养液稀释至1mg/mL，按照GB/T16886.5规定的浸提液试验方法检验，接种细胞为人脂肪间充质干细胞。
(6)植入后局部反应实验
按照GB/T16886.6规定的方法检验，每个植入点皮下注射入复合型软组织修复水凝胶0.5mL，7d、14d取样镜下观察。
(7)致敏性试验
按照GB/T16886.10医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验规定的方法检验。
2.检测结果
(1)胎盘组织处理前后细胞残留检测
如图1所示，胎盘组织处理前有大量细胞，处理后未发现有细胞残留。
(2)pH值检测结果见表4：
表4
序号 实施例1 实施例2 实施例3
1# 7.10 6.76 6.81
2# 7.13 6.78 6.84
3# 7.12 6.78 6.82
均值 7.12 6.77 6.82
三组实施例所制得复合型软组织修复水凝胶的pH值范围在6.7～7.2之间。
(3)渗透压检测结果(单位：mOsmol/L)表5：
表5
序号 实施例1 实施例2 实施例3
1# 313 311 316
2# 315 311 315
3# 314 314 316
均值 314 312 316
三组实施例所制得复合型软组织修复水凝胶的渗透压范围在310mOsmol/L～320mOsmol/L之间。
(4)动力粘度检测结果(单位：mPa·s)见表6：
表6
序号 实施例1 实施例2 实施例3
1# 134.54 151.47 128.12
2# 134.56 151.50 128.13
3# 134.55 151.52 128.15
均值 134.55 151.50 128.13
三组实施例所制得复合型软组织修复水凝胶的动力粘度均＞100mPa·s。
(5)细胞相容性实验
实验结果如图3所示，接种人脂肪间充质干细胞共培养72h，细胞保持成纤维细胞样形态，细胞的生长和增殖良好，说明本发明材料的浸提液对细胞无毒性，细胞相容性好。
(6)植入后局部反应实验
实验结果如图4所示，复合型软组织修复水凝胶入后7天，植入物内部及周围观察到小血管增生，可见出血现象；炎性反应明显，植入物内部有大量中性粒细胞和淋巴细胞侵润，可见纤维细胞、纤维母细胞增生，炎性反应明显；14天植入物几乎不可见，炎性反应不明显。
(7)致敏试验
实验结果显示，本发明实施例1～3制备的复合型软组织修复水凝胶的致敏性均为阴性。
实验结果说明，本发明复合型软组织修复水凝胶的pH值、渗透压和粘度合适，可以用于临床使用，而且无生物学毒性，有良好的组织相容性，可有效修复组织。
对比例1
一、制备方法
1、脱细胞胎盘微粉的制备
按照实施例1的方法制备。
2、复合型软组织修复水凝胶的制备
分别按照配方下表7，制备复合型软组织修复水凝胶，预灌装，Co-60辐照灭菌，剂量为25kGy。按照实验例1的方法检测凝胶的性质。
如下表中，A组、B组、C组分别为本发明实施例，D组、E组、F组为对比例。
表7
二、检测方法
按照实验例1的方法检测本方法制备的符合水凝胶的动力粘度、渗透压、pH、细胞毒性、植入后局部反应试验和致敏实验。
三、检测结果
结果见表8
注：“—”表示为阴性(可接受)；“+”表示阳性(不可接受)
由表8可知，采用本发明辅料和配比制成的水凝胶，制得的凝胶各个特性都非常优良，但是当采用其他常用辅料或在其他配比下，与脱细胞胎盘微粉制备成的水凝胶，植入后局部反应实验和致敏试验结果均为阳性，导致其安全性有问题，无法临床使用。
综上，只有采用本发明特定辅料，与本发明脱细胞胎盘微粉在本发明特定配比下，才可以制备得到pH值、渗透压和粘度合适、无生物学毒性、组织相容性好的水凝胶，而采用其他辅料或在其他配比下则无法得到合适的水凝胶。本发明水凝胶性能优良，可有效修复组织，直接临床使用，临床应用前景良好。

Claims (9)

1.一种复合型软组织修复水凝胶，其特征在于：它是以脱细胞胎盘微粉为原料制备而成的水凝胶，其中，原料和辅料的重量配比如下：
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述原料和辅料的重量配比如下：
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述原料和辅料的重量配比如下：
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于：所述原料和辅料的重量配比如下：
5.根据权利要求1～4任意一项所述的水凝胶，其特征在于：所述脱细胞胎盘微粉的粒径为50～140目。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于：所述脱细胞胎盘微粉按照如下方法制备：
(1)取新鲜胎盘组织，清洗，加水，匀浆，离心，弃上清，得下层组织；
(2)取步骤(1)得到的下层组织，在甲醇和三氯甲烷的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，甲醇和三氯甲烷的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；
(3)将步骤(2)得到的下层组织，在过氧乙酸和乙醇的混合溶液中浸泡2～6h，离心，弃上清，清洗，得下层组织；所述混合溶液中，过氧乙酸的浓度为0.1～0.3％(v/v)，乙醇的浓度为3～7％(v/v)；
(4)将步骤(3)得到的下层组织，震荡浸泡于浓度为0.3～0.7％(w/v)的十二烷基硫酸钠溶液中，浸泡4～10次，每次30～120min，震荡的频率为50～200r/min，离心，弃上清，清洗，得下层组织；
(5)-40～-80℃下真空冷冻干燥24～48h。
7.一种制备权利要求1～6任意一项所述的水凝胶的方法，其特征在于：它包含如下步骤：
(a)按照权利要求1～6任意一项所述比例取原料药和辅料；
(b)将各原料药和辅料混合，得到复合水凝胶制剂；
(c)将复合水凝胶制剂预灌装至注射器中，辐照灭菌，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(c)中，所述辐照灭菌的剂量为15～25kGy。
9.权利要求1～6任意一项所述水凝胶在制备软组织修复材料中的用途。
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