CN102657584A - 降解稳定的生物相容性胶原基质 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特征特别地在于包含可溶性胶原和肽组分的事实的降解稳定的、生物可相容的胶原基质、这种胶原基质的制备方法和根据本发明的胶原基质的用途，所述制备方法特别地包括应用环氧官能交联剂的化学交联，所述用途是作为美容试剂或药物试剂，特别地用于局部应用，和在人或动物中作为伤口治疗剂、作为植入物或作为止血剂，和作为生物工程学、基础研究和组织工程领域中细胞群的支架。

Description

降解稳定的生物相容性胶原基质

技术领域

本发明涉及降解稳定的生物相容性胶原基质、这种胶原基质的制备方法、以及根据本发明的胶原基质的用途，所述生物相容性胶原基质特别地特征在于其除了不溶性胶原纤维之外还包含可溶性胶原组分以及肽组分的事实，所述制备方法特别地包括应用环氧官能交联剂化学交联，所述用途是作为美容试剂或药物试剂，特别是用于局部应用，以及也作为人或动物中的伤口治疗剂、植入物或止血剂，以及作为生物技术、基础研究以及组织工程领域中细胞群的支架。

背景技术

在胶原材料领域中，机械稳定的、柔性的且显示出抗生物降解的足够稳定性的材料和支架的提供起重要作用。尤其是在伤口治疗、生物植入物领域以及在组织工程和细胞群支架领域，以及也在伤口愈合和止血领域中的高吸附性材料领域中，这种产品需求变得越来越重要。在美容领域中，特别地另外需要具有舒适的感觉和外观而同时被皮肤良好耐受的材料。而且，在美容和药物应用以及在组织工程中，活性成分经由另外具有高机械稳定性的这种降解稳定的载体或基质材料的提供是重要的方面。例如组织工程支架与活性成分的组合是反映在大量出版物中的一种策略。通过吸附或共价键合到支架或从贮库连续释放而经延长时期发挥其生物活性的活性成分属于现有技术。特别地，在具有短生物半衰期的活性成分的情形下，从相应活性成分贮库的连续释放开启伤口愈合中的靶向干预。例如，许多重要现象，例如细胞分化、细胞增殖和聚集经由基因表达受到信号蛋白的影响。个别细胞的可用性和分化、再生或替代、细胞分裂和调节是研究的主要目标(Rui Miguel Paz，Dissertation RWTH Aachen 2004)。为了改善其功能性而为生物材料装配生物活性物质说明了从完全被动植入物材料到参与与周围组织或组织液的有目的相互作用的主动植入物的发展。生物活性物质与生物材料的组合在医学中普遍存在，且起越来越多的作用，例如在预防植入物相关的感染中。例如，在伤口敷料领域中，越来越多更重要的作用是通过改善的伤口环境、减少感染和刺激细胞生长来产生的，其通过加入活性成分，也通过以可控方式调节材料的物理特性、例如尤其是基质材料的硬度而有目的地影响细胞分化和细胞表达方式而进行。近年来，所谓的伤口渗出物管理，其特别在慢性伤口的情形下特别涉及在渗出即湿润的伤口中，在经由纯吸附功能控制伤口渗出物等的物理水平和处于释放活性成分的药理水平的影响和相互作用也已变得更加重要。

胶原基质负载蛋白活性成分比如生长因子是长期已知的，并且描述在例如WO 85/04413或US 5219576(EP 0428541B1)中。

然而，还为了能够实现载体材料的高机械稳定性的产品需求，以及也实现降低例如在伤口或身体植入物中不期望的非常快的生物降解，已知且普遍采用交联的方法，特别是用化学交联剂进行交联。特别地，用环氧官能交联剂进行胶原的化学交联也是已知的。

在这方面，其中用环氧交联剂交联的主要已知方法是在固体、干燥的、通常是冷冻干燥的胶原材料上进行的。例如，DE 69533285描述了可以化学交联或部分交联的生物聚合物纤维的半月板假体，所述交联是对已经冷冻干燥的胶原纤维进行的。

WO 2003/053490A1(EP 1455855A1)也提供了可以化学交联的冷冻干燥的胶原材料。其中也描述了冷冻干燥的胶原-弹性蛋白材料的化学交联，戊二醛用作化学交联剂，且仅仅一般性地提及环氧化物作为交联剂。

DE 102006006461A1和DE 102004039537A1提供了填充(populated)以皮肤细胞的胶原基质(全皮肤模型)，其中填充的胶原材料采用戊二醛进行化学交联。仅仅一般性列出了大量其它化学交联剂。其中也仅仅描述了已经冷冻干燥的材料的交联。

在这些方法中的化学交联是通过将特别是片材或层形式的固体胶原材料浸入包含交联剂的溶液中常规进行的。所述片材样固体胶原材料(层)通常是如下方式获得的：首先，通过常规方法干燥(例如冷冻干燥)胶原材料，并且在浸入包含交联剂的溶液中之后，进行进一步的干燥步骤(例如进一步冷冻干燥)。在另外的步骤中，在进行交联反应之后，通常通过彻底冲洗来从材料洗除还没有偶联的过量交联剂，鉴于交联材料的生物相容性或由交联剂残余物引起的其毒性降低，这是必需的。

一种相应的方法特别地描述在“Cross-linking of Collagen-based materials”(论文，R.Zeeman，1998)和Zeeman等人在J Biomed Mater Res，46，424-433，1999，在J Biomed Mater Res，47，270-277，1999中，在Biomaterials，20，921-931，1999中和在J Biomed Mater Res，51，541-548，2000中。在此方法中，例如将通过冷冻干燥获得的层状皮肤绵羊胶原(DSC层)在pH酸性或碱性下浸入环氧官能交联剂溶液中，所述环氧官能交联剂比如1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)，并在室温下(20-30℃)交联几天时期。然后，冲洗完全交联的胶原层且再次冷冻干燥，以便获得环氧交联胶原材料。在那些出版物中，描述了用于交联的pH值对于交联材料的挠性和弹性具有显著的影响，与在碱性pH值下交联的材料相比，在酸性pH值＜6(pH 4-6)交联的材料具有较高的挠性和弹性。

EP 0898973B1还描述了一种用于化学交联胶原的方法。这里一般说来也将胶原悬浮液作为化学交联的可能原料提出。然而，所描述的交联方法基本上由至少两个交联步骤组成，通常在pH值4-9下进行。其中用环氧化物交联剂比如BDDGE进行交联的唯一具体实施的实施例涉及片材形式的如上所述皮肤绵羊胶原(DSC)，将其浸入包含BDDGE的溶液中，且在反应时间7天之后冲洗且之后再次冷冻干燥。

其中通过浸入固体、干燥的(冷冻干燥的)胶原材料，之后再进行干燥而进行交联的该方法的缺点是一方面必须进行几次干燥步骤，出于工艺经济性的原因这点特别不利，另一方面，就相关的时间、特别是与持续几天的交联时间相关的时间而言，费用高。还发现，再次冷冻干燥交联的、已经冷冻干燥的材料时，可以观察到所述材料不期望的变化，特别是对于层压材料以收缩的形式的变化。由于另外的第二次干燥过程不可避免引起的胶原材料的热应力升高，另外预期到对于胶原材料结构的不利影响，例如胶原肽结构的变性或其它结构变化增加，特别是在其中胶原以天然、生物结构蛋白存在的胶原材料中。

相反，例如，由EP 0793511A1已知用于制备特别地还包含胶原和弹性蛋白的聚合物混合物的复合生物聚合物泡沫的方法，其中将交联剂加入到聚合物悬浮液中，之后只进行简单的干燥步骤，特别是冷冻干燥。然而，没有公开用环氧官能交联剂交联这种聚合物混合物。

EP 0680990A1还描述了将交联剂加入到聚合物悬浮液中，使胶原和合成亲水性聚合物的聚合物混合物进行交联反应，所述合成亲水性聚合物比如特别是官能活化的合成亲水性聚合物，例如二醇，优选双官能活化的聚乙二醇(PEG)。作为交联剂的环氧化物仅仅一般性作为许多可能的交联剂之一列出。

US 4,883,864描述了化学改性的(交联的)胶原组合物，其中利用胃蛋白酶溶解所述胶原，然后通过加入交联剂进行交联。同样，在该出版物中环氧化物仅仅是一般性作为可能的交联剂提及。实施例18提到了根据该发明的胶原材料可以冷冻干燥，且用作外科海绵材料。该发明也没有公开特别地与冷冻干燥步骤相关的不溶性天然胶原的用途或环氧化物的具体用途。

化学交联胶原材料，特别是酸不溶性天然胶原，是从本申请人的早期专利申请DE 10350654A1中已知的。在那篇申请中，优选地使用具有pH值2-4的含水胶原悬浮液。另外，提到了将交联剂加入到这种含水胶原悬浮液中，接着冷冻干燥的可能性。其还进一步提到，特别地当使用在酸性介质中反应的交联剂时，交联处理可以在冷冻干燥之前进行。罗列出了多组多官能性交联剂作为可能的交联剂，该一般性罗列也包括双环氧化物，比如1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)。然而，优选地进行脱氢热交联。对于利用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)交联的材料，还提及令人惊奇地改善了胶原材料的血管生成性质。在其中作为优选识别的脱氢热交联方面，提及冷冻干燥温度为至少50至180℃，对于脱氢热交联，高于80℃的较高温度识别为优选的。特别地与考虑的具体过程，例如具体pH值＜4和选择的冷冻干燥温度范围组合的作为交联剂的环氧化物的具体选择在其中不是显而易见的。而且，该文件描述了纤维状、天然不溶性胶原的胶原悬浮液的操作(working-up)和制备。然而，没有提到可释放酸溶性胶原和肽组分的保存，所述胶原和肽组分可能是在胶原材料中在该操作情况中形成的。特别地在仅仅一般性提及的化学交联方面，既没有提到保存这种可溶组分的必要性，也没有提到因而其可能性。相反，该文件明确地涉及酸不溶性胶原材料的期望用途，且酸溶性胶原明确地被认为是不利的。在该文中，引入例如蛋白源(proteinogenic)活性成分(生长因子等)是通过包封和掺入微球实现的。

天然酸不溶性胶原常规指如下胶原悬浮液的级分：其在酸溶液中不溶、可离心沉淀、且包含光学显微镜检查可见的纤维；在本发明的范围内，天然酸不溶性胶原特别地包括纯胶原悬浮液的级分，其在pH＜4的酸溶液中不溶，可以通过16,000g的离心沉淀，且包含在光学显微镜下可见的纤维(纤维厚度0.2μm及以上)。

在另一方面，天然可溶性或酸溶性胶原指在pH＜4的酸溶液中形成澄清溶液，且不包含在光学显微镜下可见的任何纤维结构的胶原级分。

可以利用分级分离，例如利用已知的SEC(尺寸排阻色谱)方法将天然可溶性或酸溶性胶原分成具有分子量＞250kDa的高分子量、天然、完整胶原分子和具有分子量＜250kDa的低分子量胶原肽。因而，所述低分子量胶原肽不能指为完整胶原分子。

原则上，如下述实施例描述的，可以利用已知方法，例如SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析可溶性组分来定性地检测可溶性完整胶原分子以及低分子量肽组分的存在。

所述酸溶性胶原组分和胶原肽具有多种有利的特征。例如，它们具有成膜性能，以及当局部应用或从载体材料释放到皮肤上时，它们经由该薄膜形成可以提高皮肤的保水能力，因此，减少了经表皮的水分流失。此外，可溶性胶原片段是在伤口治疗和细胞群/细胞反应的可控制性方面产生积极性质的重要信号信使和基质组分，其特别在组织工程领域，在所谓细胞群的表达谱方面是有利的和期望的。因此，本发明的一个重要方面是将这种酸溶性胶原组分和肽以及其它低分子量肽组分保存在冷冻干燥的、降解稳定的(化学交联的)胶原基质中，以便当使用时，其从基质中释放出，且能够在应用部位获得其有利的作用。

现有技术已知的化学交联的和由此得到的降解稳定的胶原材料不再包含酸溶性胶原级分、片段及其它肽组分，这是因为例如在分离皮肤(split-skin)胶原或上述皮肤绵羊胶原(DSC)层的情形下所述材料的基本性质，或者因为进行的环氧化物交联过程和其中应用的交联条件。现有技术中描述的环氧交联过程是使用明显过量的交联剂在大量溶剂中进行至少72小时的长时间。可能存在于原料中的可溶级分由此被大量溶剂释放，稀释，因此被冲洗掉。由于高稀释效应的结果，可溶性肽和胶原级分以仅仅少量仍然存在于所述材料中。由于高交联剂浓度和长的交联时间，仍然少量存在的可溶性肽和胶原组分与所述胶原链交联，因此不可分地结合到交联的材料中。因为所述方法还包括作为必需步骤的从交联的材料中冲洗交联剂，在最后的该洗涤步骤中，从交联的材料中冲洗掉任何未结合的可溶性胶原级分或可溶性胶原片段或低分子量可溶性肽组分。因此，现有技术没有提供下述化学交联的胶原材料：由于化学交联，其具有高降解稳定性和机械强度，同时具有可以从交联材料中释放出的高生物相容性(低毒性)和酸溶性胶原级分、片段和/或其它肽组分。

发明内容

因此，本发明的目的是提供冷冻干燥的胶原基质，其同时具有适于美容应用和医学应用的高生物降解稳定性(水解稳定性)和机械性撕裂强度(tearstrength)，特别地在水合状态(湿撕裂强度)下。此外，所述胶原基质应当具有高生物相容性，特征为低毒性，并且允许从使用的交联基质中释放可溶性胶原和肽组分。此外，所述交联胶原基质应当具有高液体吸收能力和水合率，所述胶原基质应当具有高挠性和弹性，以及是触觉舒适的且具有有吸引力的光学性质(例如高光密度)，以便特别地适合作为美容试剂或药物试剂，特别地用作美容敷料或面膜和作为伤口治疗剂、植入物或止血剂以及也作为组织工程中细胞群/细胞培养的支架。在一个进一步的方面，提供胶原基质，在生物工程学、基出研究和组织工程领域中，由于受控制的硬度适合性，其允许有目的地影响细胞分化和细胞的表达模式。稳定且在影响细胞的表达模式方面最佳的支架和胶原材料的高生物相容性是有助的新细胞的掺入及其性能所需要的，例如当将其用作植入物和用作组织工程的细胞支架时。

最后但相当重要的，从经济学观点而言，所述方法优于现有技术。

附图说明：

图1：BCA方法：根据制备实施例2的含有另外的可溶性基质蛋白(弹性蛋白水解产物)的环氧交联胶原基质中可溶性蛋白组分[％]的测定，与含有弹性蛋白水解产物的仅仅脱氢热交联胶原基质(“未交联的”)进行比较。

图2a：胶原酶消化试验：根据本发明的制备实施例1a和2a的环氧交联胶原基质与含有弹性蛋白水解产物的仅仅脱氢热交联的胶原基质(“未交联的”)比较在6小时时期之内的降解率[％]的测定。

图2b：胶原酶消化试验：根据本发明的制备实施例1a和2a的环氧交联胶原基质与含有弹性蛋白水解产物的仅仅脱氢热交联的胶原基质(“未交联的”)比较在23小时时期之内的溶解部分的绝对量的测定(对10mg标准化)。

图3：水解稳定性：a)含有甘油三酯/中性油的脱氢热交联的胶原基质(“未交联的”)(冷冻干燥温度＞120℃)；b)根据本发明制备实施例3的环氧交联胶原基质(5％环氧化物/DM；含有甘油三酯/中性油；冷冻干燥温度＜100℃)；c)相应于根据制备实施例3的组合物的环氧交联胶原基质(5％环氧化物/DM；含有甘油三酯中性油；冷冻干燥温度＞120℃)。

图4：a)脱氢热交联胶原基质，与b)根据本发明的制备实施例3的胶原基质比较，在18天之后的水解度。

图5：冷冻干燥温度对湿撕裂强度的影响(内部法UV8801)。

图6：冷冻干燥温度和环氧化物交联剂浓度对湿撕裂强度的影响(内部法UV8801)。

图7：在冷冻之前的静置时间和含水胶原悬浮液/混合物的静置时间期间的温度对湿撕裂强度的影响(内部法UV8801)。

图8：残余环氧化物活性和再润湿对根据本发明的制备实施例1的胶原基质的残余环氧化物活性降低的影响。

图9：用于测量硬度/弹性模量E的试验装置。

具体实施方式

本发明人发现通过在pH值＜4下，将环氧官能交联剂加入到胶原的含水悬浮液中，然后在＜100℃的温度下，将该混合物冷冻和冷冻干燥，可以获得这种特定改善的胶原材料，所述胶原的水悬浮液除了包含纤维性、酸不溶性天然胶原之外，还包含如上定义的天然可溶性(酸溶性)胶原和胶原肽的级分、和/或来自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源(proteinogenic)活性成分和可溶性蛋白或肽组分的结构形成剂和活性成分。特别地，已经表明，令人惊奇地是，与现有技术已知的交联剂含量相比，该新方法能够使环氧化物交联剂的含量显著降低，而在交联度方面没有损失。特别地，在冷冻干燥后残余环氧化物活性方面，和在使用时可以释放的未交联的可溶性胶原和肽组分的保存方面，以及因此在交联胶原材料的毒性和生物相容性方面，＜4的低pH值以及降低的交联剂含量是有利的。从经济学观点而言，相较于脱氢热交联中常规应用的温度，更低的冷冻干燥温度可为有利的，但已知该更低的冷冻干燥温度特别地对于温和的加工和保护温度敏感组分(例如不稳定的活性成分)是必需的。根据本发明的方法的一个进一步的优点是使用所谓的一锅法：将交联剂加入到胶原悬浮液中，然后在最后的冷冻干燥之前优选不超过24小时的短的胶原/交联剂混合物的静置时间(适用期(pot time))的情况下，直接进行冷冻干燥得到交联的最终产物。因此，总的来说，显著更经济的方法是可能的。

因此，可以特别地通过提供包含可以在使用时释放的未交联可溶性胶原和肽组分的机械稳定的且降解稳定的、生物相容的环氧交联胶原基质的制备方法实现上述目的，所述方法包括下述步骤：

a)制备含水胶原悬浮液，

b)将来自步骤a)的胶原悬浮液的pH值调节至pH＜4，

c)任选地加入其它结构形成剂、活性成分和/或辅助物质，

d)加入环氧官能交联剂，步骤c)和d)的顺序是可变的，

e)冷冻从步骤d)可获得的胶原混合物，

f)在冷冻干燥温度＜100℃下，冷冻干燥来自步骤e)的冷冻混合物，

g)任选地调节如此可获得的冷冻干燥的交联胶原材料至水分含量为基于冷冻干燥的胶原材料计＜25重量％，和

h)任选地将从步骤g)可获得的的材料转化成期望的形式，杀菌和/或加工。

本发明进一步提供通过所述方法可获得的机械稳定的且降解稳定的、交联的、生物相容的胶原基质，其包含使用时可释放的未交联的、可溶性胶原和肽组分。

根据本发明制备交联胶原基质中使用的胶原特别地为牛、猪、马或人来源的或通过遗传工程生产的胶原。特别优选地，其为牛来源的胶原。特别优选的胶原的制备描述在本申请人的DE 4048622A1和DE 10350654A1中。其中描述用于制备胶原海绵的方法包括：

-使胶原原料接受碱处理，

-冲洗得到的胶原材料，

-使得到的胶原接受酸处理，

-冲洗得到的胶原材料，和

-碾磨得到的胶原材料，特别地使用胶体磨，

其中每个上述步骤都可以任选地重复几次。

由此获得纤维和原纤维形式的所谓天然酸不溶性胶原的含水胶原悬浮液，其还包含可测量量的酸溶性胶原和酸溶性肽组分。这种酸溶性级分的定性检测可以例如利用SDS-PAGE进行，如本文描述的。然后，可以利用根据本发明的方法加工该胶原悬浮液：调节pH值至pH＜4，任选地加入进一步的结构形成剂、美容或药物活性成分和辅助物质，接着加入环氧官能交联剂，在冷冻干燥温度＜100℃下冷冻干燥，得到根据本发明的产物。

相对于在根据本发明的方法中使用的主要包含纤维和原纤维形式的酸不溶性胶原的胶原悬浮液，使用现有技术(参见例如US 4,883,864)中常规描述的只有酸溶性胶原材料是不利的，因为比较而言，为了获得合适的交联度，对于只有酸溶性胶原的情形显著较高量的交联剂是必需的。已知与由酸不溶性胶原可获得的材料相比，由纯酸溶性胶原制备的材料在湿态下本身具有不足够的机械强度(湿撕裂强度)和低降解稳定性。这基本上是由于如下事实：酸溶性胶原是由个别胶原分子组成的，而酸不溶性胶原基本上是由胶原原纤维组成，该胶原原纤维是由已经自然彼此交联的横向排列胶原分子组成。这些原纤维进而通过自然交联横向结合形成更大的聚集体，胶原纤维。已经天然交联的胶原纤维和化学交联的胶原纤维的降解都由于相对表面积较小和包含于纤维复合物中的个别蛋白质链的可接近性降低而进行得显著更慢。

根据本发明的胶原材料基本上是I、III和V型胶原，主要是是I型胶原。根据本发明的方法中使用的胶原悬浮液是例如由DE 3203957A1已知的方法可获得的，其包含预碾磨形式、匀浆化形式和脱纤维形式的预处理和纯化的胶原材料，并且作为代表用于制备根据本发明的交联胶原基质的原料的水分散体存在。

所述分散体的干重应当为约1至4重量％，优选1.5至2.5重量％。所述水分散体的pH值应当为＜4，否则所述pH值必须调节至pH＜4。pH值的调节优选地采用稀盐酸进行。优选地，所述含水胶原悬浮液的pH值调节为pH 2.5至3.5，更优选pH2.7至3.3，最特别优选pH 3。

由于上述制备，特别是由于碾磨步骤，如此获得的胶原悬浮液通常除了包含纤维状天然酸不溶性胶原之外，还优选地包含胶体碾磨释放出的、根据本发明所期望的酸溶性胶原和肽组分。这种酸溶性组分的含量可以通过所述工艺控制和调节至期望的量。优选地，酸溶性胶原和肽组分在胶原悬浮液中的含量为基于胶原悬浮液的干质量计至多(up to)7重量％，其是通过在16,000g离心且然后冷冻干燥之后获得的可溶性组分的重量计的量确定的。

此时，向根据本发明的胶原组合物中加入如下所述其它可以存在的结构形成剂或任选的美容或药物活性成分和任选的辅助物质可以通过将其加入到含水胶原悬浮液中进行。通过加入来自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分等的其它结构形成剂或活性成分，上述可溶性胶原和肽组分在胶原悬浮液中的含量可以自然地升高，特别是由此也有可能获得＞7重量％(干质量)的显著更高含量。如果使用本身只包含少量酸溶性胶原和肽的胶原悬浮液，则此时，可以优选地以期望的量将这些组分混入所述悬浮液中。

然后，进行环氧化物交联剂向所述胶原悬浮液中的加入。然而，同样可能在加入任一种其它可以存在的结构形成剂、活性成分或辅助物质之前，混入环氧化物交联剂。因此，这些步骤在加工顺序中是可变的，且一般可互换。

所述环氧官能交联剂选自环氧化物化合物(环氧化物)，其特别地包含双环氧化物，以及聚环氧化合物，比如具有聚合度为1至3的聚甘油聚缩水甘油醚、多元醇聚缩水甘油醚、乙二醇二缩水甘油醚、甘油二缩水甘油醚、甘油三缩水甘油醚、双甘油四缩水甘油醚、乙二醇缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚，比如特别是1，4-丁二醇二缩水甘油醚、二羧酸二缩水甘油酯等。所述环氧官能交联剂可以特别地选自根据下述通式的聚乙二醇二缩水甘油醚：

或选自聚乙二醇、聚丙二醇和聚乙烯丙二醇的聚缩水甘油醚-官能分子，其中所述二缩水甘油醚衍生物由下述通式代表：

其中x+z＝0-70和y＝0-90。

所述双环氧化物组特别地包括符合下述通式的那些：

其中R可以为不干扰交联过程和/或降低交联物质在水溶液中的水溶性的任何取代基，且其中n为1-6，优选n＝1-4。

一般地，根据本发明的胶原基质的主要性质可以通过选择合适的环氧化物交联剂来控制，例如在其双官能度、链长等方面选择。

水溶性环氧化物交联剂是优选的；所述环氧化物交联剂特别优选地选自双环氧化物，1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)是最特别优选的。在合适的条件下，所述环氧化物化合物可以与包括胺基和羧基的大量官能团进行酸催化和碱催化反应。在现有技术(例如Zeeman等人)中，描述了当在酸性pH范围(pH 4-6)进行交联时，主要发生羧基交联，而在碱性交联(pH 9)的情况下，主要在酰胺基发生交联。

对于交联剂和选自可溶性蛋白和肽组分的可能其它成分、以及活性成分和/或辅助物质的掺入，优选地将所述胶原悬浮液冷却到低于室温(23℃)的温度。特别地，混合进行的温度为＜20℃，优选地温度＜10℃，特别优选地≤5℃，此时以此加工顺序，所述胶原悬浮液/混合物的温度自然还没有低至该物质冷冻。

如此获得上述含水胶原悬浮液，其包含交联剂以及任选的其它结构形成剂、活性成分和/或辅助物质(胶原混合物)，且具有pH值＜4，然后优选在24小时以内将其冷冻，这样如果可能使所述含水胶原混合物的静置时间(适用期)不超过24小时。

在这些静置时间(适用期)期间，所述含水胶原混合物的优选温度相当于上述定义的混合操作的降低的温度，因此，该胶原混合物保持温度＜20℃，优选地＜10℃，特别优选地≤5℃，而在任何静置时间期间，胶原混合物没有冷冻。

在混合期间降低的温度和在冷冻之前胶原混合物的静置时间令人惊奇地对于根据本发明的冷冻干燥的胶原基质的机械稳定性(湿撕裂强度)具有有利的作用。例如，已经令人惊奇地表明可以通过在静置时间期间降低温度获得机械性湿撕裂强度的改善。

优选地，随后的冷冻是在-10至-60℃温度下进行0.5至4小时，优选1至3小时的时期。

令人惊奇地，已经发现如现有技术中描述的，几天的较长静置时间对于获得完全和令人满意的交联显然不是绝对必要的。相反，已经令人惊奇地表明，在根据本发明的方法中，在冷冻之前较长的静置时间对于交联度和从而对于撕裂强度(湿撕裂强度)及降解率都具有不利影响。在这方面，已经发现在根据本发明的方法中，在其制备之后立即、不超过24小时的时期内、更优选不超过18小时的时期内、特别优选少于12小时的时期内，冷冻所述含水胶原混合物是有利的。除了对于材料性质的有利影响之外，出于方法经济性的原因，短的静置时间也是优选的。

假设所述含水混合物中肽分子和交联剂分子之间的交联反应受到立即冷冻含水悬浮液的抑制，由于与进行的反应机理相关的理论其是有利的，如下所解释的：

当将所述环氧官能交联剂加入到含水胶原悬浮液中时，一般地，一方面在环氧化物水解之间发生竞争反应，另一方面在环氧化物和蛋白质之间发生交联反应。立即冷冻引起反应组分固定，该反应如“冻结的”。另外，水由此以高纯形式冷冻，并将溶解组分(环氧化物)转移到水晶体的外围，由此所述环氧化物以浓缩形式相对接近地定位于待交联的蛋白质。由于得到的环氧化物相对于蛋白质的相对接近和浓度升高，可能获得了与胶原纤维有利的反应动力学，所述竞争反应向

的方向移动。进一步假设，在冷冻干燥过程的开始，经由输入能量，由此发生冷冻的水分子立即升华转变成气态，也获得了反应的活化能，由此启动该反应。而且，因为由于升华水不再进入液相的中间状态，竞争水解反应另外受到抑制。

因此，根据本发明特别优选的是保持在含水悬浮液中的反应时间尽可能地短，并尽可能快地将该悬浮液转化成冷冻形式。

基于上述说明，特别地还可能在根据本发明的方法中使用非常少量的环氧交联剂。根据本发明，优选使用的环氧浓度至多最大量50重量％，优选地至多20重量％，更优选地至多10重量％，特别优选地至多7重量％，在每种情况下都是基于胶原悬浮液的干质量计，或至多1重量％，优选地至多0.4重量％，更优选地至多0.2重量％，特别地至多0.14重量％，在每种情况下都是基于含水胶原悬浮液计(其任选地还包含其它结构形成剂、活性成分和辅助物质)。

为了获得令人满意的交联度(湿撕裂强度/降解率/水解稳定性)，所述交联剂的使用量优选地为至少0.5重量％，更优选地至少1重量％，仍然更优选地至少3重量％，在每种情况下都是基于含水胶原悬浮液的干质量计，或者至少0.01重量％，优选地至少0.02重量％，更优选地至少0.06重量％，在每种情况下都是基于含水胶原悬浮液计(其任选地还包含其它结构形成剂、活性成分和辅助物质)。合适的交联剂浓度的选择在显著程度上取决于期望的材料性质和特定应用领域。

相反，现有技术中使用的环氧化物浓度高许多倍。使用这种低环氧化物浓度特别地对于生物相容性具有特别有利的影响，生物相容性相当于最终产物中环氧化物交联剂的残余活性(和由此的低毒性)，并且另外允许在使用最终产物时期望地保留可释放的酸溶性胶原和肽组分。

考虑到相关的潜在毒性，残余环氧化物活性表示交联基质的生物相容性的量度。残余环氧活性的测定可以利用改进的NBP测定(硝基苄基-吡啶测定)进行，该改进的NBP测定是基于Agarwal等人(1979)的“Detection of Epoxides with4-(p-nitrobenzylpyridine)”，Bull.Environm.Contam.Toxicol.23，第825-829页，根据Zocher等人(2000)的“Epoxide hydrolase activity of Streptomyces strains”J.Biotechnol.Feb 17；77(2-3)，第287-292页进行改进，如本文详细描述的。

根据本发明的胶原基质的低残余环氧活性和由此的高生物相容性可能还归因于＜4的低pH值，其是该方法优选的，因为最终产物中低pH值造成剩余残留环氧化物的快速水解，且因此加速其在最终产物中的降解性。该作用还显著地受到交联胶原基质(最终产物中)的水分含量的影响，如下进一步解释的。

进一步令人惊奇地发现，根据本发明优选的低环氧化物浓度对于撕裂强度、水解稳定性和酶促降解(例如胶原酶降解)具有显著的影响。本文在上述定义的优选范围内获得了最佳结果。

将通过上述步骤可获得的悬浮液优选地冷冻为片材形式，但是适合其它可能的几何形式、天然形式或生理学形式的任何构型也都是可能的。得到的片材的厚度可以为0.5至5.0cm，优选1.0至3.0cm，特别优选1.5至2.0cm。

通过根据本发明的方法可获得的胶原基质为多孔胶原材料，这特别地也是其高吸附或吸水能力和水合率的原因。根据本发明的胶原基质的孔隙率也代表其在组织工程中作为细胞群/细胞培养的支架的适合性的一个明显性质。

根据本发明的胶原材料的孔隙度基本上是两个参数材料密度和冰晶尺寸的函数。含水混悬液中高固体含量增加了冷冻干燥的最终产物中的材料密度，并减少了再水合试剂/固体的接触面。高冷冻梯度产生小的冰晶，其引起大的材料内表面，进而有助于再水合。另一方面，低冷冻梯度产生大的冰晶，其进而产生最终产物中的大孔材料结构。因此，根据本发明的胶原基质的孔径大小可以有目的地受到控制冷冻速度的影响。而且，另外有可能通过加入表面活性物质影响孔径大小，尽管这是较不优选的。

获得的片材可以任选地立即贮存在-3至-35℃。优选地，将冷冻片材贮存至少24小时。

在冷冻和任选的立即贮存之后，对所述片材进行冷冻干燥。

令人惊奇地，已经表明，在根据本发明的方法中，为了获得如下交联胶原基质：在机械撕裂强度、水解稳定性、相当于低残余环氧活性的生物相容性，在最终产物中保留可释放的可溶性胶原和肽组分或可释放的选自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白质或肽组分的结构形成剂或活性成分等，以及在所述材料的挠性、弹性和柔软性形式的触觉相关方面具有期望的最佳性质，冷冻干燥温度不应当超过100℃。

现有技术已知为了获得胶原基质的脱氢热交联，应用50至180℃的相对高冷冻干燥温度，优选稳定＞80℃。进一步已知采用所述冷冻干燥温度增加了交联度，因此增加了撕裂强度。根据现有技术获得了特别高的交联度，例如，采用80至150℃的冷冻干燥温度或高于110至150℃的温度。因此，将假设在交联度方面和在与使用交联剂相关的撕裂强度方面，较高的冷冻干燥温度也将导致较好的结果。然而，相反地，已经发现在根据本发明的环氧化物交联过程中，在撕裂强度(湿撕裂强度)方面，较高的冷冻干燥温度导致较差的结果。特别地，还发现在温度＞100℃下脱氢热后交联对湿撕裂强度具有不利影响。该效果是令人惊奇的，因为本领域技术人员将预期化学交联和脱氢热交联的累加效应。

假设根据本发明＜100℃的冷冻于燥温度的优点是通过相关的延长升华过程决定的。由于冷冻干燥温度比较低，延长升华过程以完成干燥该材料是必需的，由此可使得完成交联剂和肽分子的反应的时期延长。因此，在该延长升华过程期间可能完成交联反应，其导致较高的交联度，而高冷冻干燥温度导致随后非均匀的和非均衡地发生的加速交联反应，产生具有低撕裂强度的最终产物。因此，根据本发明的方法以冷冻干燥温度＜100℃进行，冷冻干燥温度＜85℃是更优选的，＜80℃是仍然更优选的。

如前所述，作为为了获得令人满意的脱氢热交联有利的冷冻干燥温度＞100℃在保留可释放的可溶性胶原和肽组分和/或结构形成剂或活性成分方面是不利的，所述结构形成剂或活性成分来自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分，在一方面是因为那些组分同时交联因此不能分开地结合在所述材料中，在另一方面是因为不期望的至少部分的那些蛋白源组分的热变性可在太高的温度下发生。

根据现有技术中描述的交联方法，其中使用20至30℃范围的冷冻干燥温度，则在冷冻干燥之前比较长的交联时间至多44小时，即几天(至多7天)是必需的。在根据本发明的方法中，在另一方面，在冷冻干燥之前没有要求另外的交联时间，在冷冻干燥之前胶原悬浮液的静置时间进行不超过24小时，然后所述交联基本上在冷冻干燥过程中进行。特别地，已经发现冷冻干燥温度≥40℃，优选地≥50℃，更优选地≥60℃对最佳过程是有利的。因为在根据本发明的方法中的交联反应基本上是在冷冻干燥期间进行的，如上定义的较高交联温度允许特别短的冷冻干燥时间和因此特别短的交联时间，而没有不利地影响交联度和因而得到的材料稳定性。而且，时间优点也是从一步进行交联反应和冷冻干燥中所获得的。

在根据本发明的方法中，然后任选地将得到的冷冻干燥的交联胶原材料的水分含量调节至水分含量至多最大量25重量％，其基于冷冻干燥的胶原材料(再水合)计。更优选地，调节水分含量至多20重量％，仍然更优选地至多15重量％，在每种情况下都是基于冷冻干燥的胶原材料计。优选地，进行再水合或调节水分含量至至少3重量％，更优选地至少5重量％，仍然更优选地至少7重量％，在每种情况下都是基于冷冻干燥的胶原材料计。特别地，有利地是调节水分含量至含量为3至25重量％，更优选地为5至20重量％，仍然更优选地为7至15重量％，在每种情况下都是基于冷冻干燥的胶原材料计。再水合或调节水分含量一般地可以通过已知的空气调节(climatisation)或水分调节的方法进行。例如，根据本发明的冷冻干燥的胶原材料可以通过贮存在合适的-气候控制的环境条件下一段合适的时间进行相应地调节或调整，所述条件为例如在10至25℃的温度，40至95％、更优选地50至75％的相对湿度，所述合适的时间为例如5至120小时，更优选12至80小时。一般地，为了在期望的水分调节方面获得最好可能的结果，本领域技术人员能够合适地组合提到的参数：温度、湿度和贮存时间。

令人惊奇地，已经发现如此调节冷冻干燥的胶原材料的水分含量对冷冻干燥的材料中环氧化物交联剂的残余活性方面是有利的。特别地，利用本文定义的测定方法可能表明，通过合适地选择再水合条件(水分含量、贮存时间)，可以显著地加速残余环氧活性降低至不再可检测的水平。特别地，因此可能通过选择再水合参数，有目的地控制残余环氧活性的消耗和因此以经济学有利的方式影响所述方法。

根据本发明得到的环氧交联的冷冻干燥的胶原基质优选地为多孔、海绵样形状制品，其可以任选地切成合适的形状，灭菌和加工。

根据步骤h)将胶原材料转化成期望的形式有利地通过切开进行。一般地，可以使用常规已知的方法将它们切成任何期望的几何形状或厚度。

根据本发明的胶原基质的灭菌对于治疗应用特别重要，此处也提及常规方法。利用γ/X射线灭菌是优选的。

加工包括根据本发明的胶原基质的任选地印刷、压印、冲压、打孔和/或层压以及任选的激光雕刻(改变表面结构)，以及包装。

根据本发明的多孔胶原基质优选地以层状材料的形式提供，其具有的厚度(具有最小纵向长度的尺寸)优选地为约0.1至30mm，优选0.5至20mm，仍然更优选1至10mm。

根据本发明的交联胶原基质除了包含胶原之外，还可以包含任选地至少一种选自其它结构形成剂、美容或药物活性成分和/或辅助物质的其它组分。

对于其它结构形成剂，藻酸盐、弹性蛋白、透明质酸是优选选择的。

在本发明范围内的美容活性成分特别地包括旨在外部应用于人类用于清洗、护理或影响外观或体味或赋予嗅觉印象的那些活性成分，除了它们主要旨在减缓或消除疾病、痛苦、身体损伤或病理学不适之外。在此意义上来说，根据本发明用于美容应用的材料是例如洗浴制品、皮肤清洗和清洁剂、皮肤护理剂，特别是面部皮肤护理剂、眼部美容、唇部护理剂、指甲护理剂、脚部护理剂、毛发护理剂，特别是洗发香波、护发素、软发剂等、防晒剂、皮肤晒黑和亮白剂、褪色剂、除臭剂、止汗剂、脱毛剂、驱虫剂等，或这样的试剂的组合。用作美容敷料或面膜是特别优选的。

具有美容的、任选地以及例如皮肤病学的、治疗活性的化合物的实例包括：祛痘剂(antiacne agent)、抗微生物剂、止汗剂、收敛剂、除臭剂、脱毛剂、皮肤调节剂、皮肤光滑剂、提高皮肤水合的试剂，比如D-泛醇(泛酰醇、羟泛醇)、甘油或尿素、以及其它NMF(天然保湿因子)比如吡咯烷酮羧酸、乳酸和氨基酸、防晒剂、角质层分离剂、用于自由基的自由基受体、抗氧化剂、抗脂溢试剂(antiseborrheics)、抗头皮屑试剂、抗菌活性成分、用于处理皮肤老化征兆的活性成分和/或调节皮肤分化和/或增生和/或色素沉着的试剂、蛋白酶抑制剂例如MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、用于减少AGE(晚期糖化终产物)物质形成的糖化抑制剂，维生素类比如维生素C(抗坏血酸)及其衍生物，例如糖苷，比如抗坏血酸葡糖苷(ascorbyl glucoside)或抗坏血酸的酯，比如抗坏血酸磷酸钠或镁、或抗坏血酸棕榈酸钠或镁和抗坏血酸硬脂酸钠或镁，L-抗坏血酸磷酸酯，碱金属盐，如L-抗坏血酸磷酸酯的钠和钾盐；L-抗坏血酸磷酸酯的碱土金属盐，如镁和钙盐；L-抗坏血酸磷酸酯的三价金属盐，如铝盐；L-抗坏血酸硫酸酯的碱金属盐，如L-抗坏血酸硫酸酯的钠和钾盐；L-抗坏血酸硫酸酯的碱土金属盐，如镁和钙盐；L-抗坏血酸硫酸酯的三价金属盐，如铝盐；L-抗坏血酸酯的碱金属盐，如钠和钾盐；L-抗坏血酸酯的碱土金属盐，如镁和钙盐；以及L-抗坏血酸酯的三价金属盐，如铝盐，任何天然的、同样性质的和人工肽，比如有和没有通过共价键合脂肪酸或酯化改性的神经肽、抗微生物肽和马曲金肽(matrikines)。

具有刺激性副作用的活性化合物，比如α-羟基酸、β-羟基酸、α-酮酸、β-酮酸、类维生素A(视黄醇、视黄醛、维A酸(retinic acid))、蒽林(蒽三醇(dioxyanthranol))、蒽醌类(anthranoids)、过氧化物(特别是过氧化苯甲酰)、米诺地尔、锂盐、抗代谢物、维生素D及其衍生物；儿茶酚类、类黄酮类、神经酰胺类、多不饱和脂肪酸类、必需脂肪酸(例如γ-亚油酸)、具有脂质体结构的活性成分、载体系统、酶类、辅酶类、酶抑制剂、保湿剂(hydrating agents)、皮肤舒缓剂、洗涤剂或发泡剂、以及无机或合成控油填料、或装饰性物质，比如颜料或着色剂以及用于粉底、美容制剂的着色颗粒，以及其它用于眼部、唇部、脸部等的美容装饰和着色试剂，以及研磨剂。

可进一步提及的是植物活性成分提取物或由此获得的提取物或单独物质。通常，植物活性成分提取物通常选自固体植物提取物、液体植物提取物、亲水性植物提取物、亲脂性植物提取物、单一的植物成分；及它们的混合物，比如类黄酮类及其苷元(aglyca)：芦丁、槲皮素、香叶木苷、金丝桃苷(hyperoside)、(新)橙皮苷、橙皮素(hesperitin)、银杏(Ginkgo biloba)(例如银杏黄酮苷)、山楂提取物(例如低聚原花青素)、荞麦(例如芦丁)、槐(例如芦丁)、桦树叶(例如槲皮素糖苷、金丝桃苷和芦丁)、接骨木花(例如芦丁)、椴树花(例如含槲皮素和金合欢醇的精油)、圣约翰草油(St.John’s wort oil)或圣约翰草提取物、月见草油(例如橄榄油提取物)、金盏花、山金车(例如含有精油的油性的花提取物、含有类黄酮类的极性提取物)、蜜蜂花(例如黄酮类、精油)；免疫刺激剂：紫锥菊(例如酒精提取物、新鲜汁液、榨汁)、刺五加；生物碱：咖啡因、茶碱、红茶或红茶提取物、可可碱、辣椒素、西萝芙木碱(例如普拉马林(prajmalin))、长春花(例如长春胺)；其他植物药(phytopharmaceuticals)：芦荟、七叶树(例如七叶皂苷)、大蒜(例如大蒜油)、菠萝(例如菠萝蛋白酶)、人参(例如人参皂苷)、水飞蓟果实(例如标准化水飞蓟素提取物)、假叶树根(butcher′s broom root)(例如鲁斯可皂苷元)、缬草(例如缬草醚酯(valepotriates)、缬草酊(tct.Valerianae))、卡法根(kava-kava)(例如卡瓦内酯)、啤酒花(例如啤酒花苦味素)、西番莲提取物、龙胆(例如乙醇提取物)、含蒽醌的药物提取物，例如含有芦荟素的芦荟汁、花粉提取物、藻类提取物、甘草根提取物、棕榈提取物、金英树(例如母酊剂)、槲寄生(例如水-乙醇提取物)、植物甾醇(例如β-谷甾醇)、毛蕊花(例如水-酒精提取物)、茅膏菜(Drosera)(例如利口酒提取物)、沙棘果实(例如从其得到的汁或沙棘油)、药蜀葵根、报春花根提取物，锦葵、紫草、常春藤、木贼、欧蓍草、车前草的新鲜植物提取物(例如榨汁)，荨麻、白屈菜、欧芹；来自Norolaena lobata、大叶万寿菊(Tagetes lucida)、Teeoma siems、苦瓜的植物提取物和芦荟提取物、倒地铃属母酊剂(Cardiospermum mother tincture)、白英提取物、以及鞣剂和丹宁酸。

与如上所述基本上用于美容的活性成分不同，治疗组活性成分(药物)是这样的那些，其在药物法规的意义上，特别地旨在用于治愈、缓解或预防疾病、病痛、身体损伤或病理学不适。特别地，根据本发明，旨在用于外用或经皮用途，特别是在伤口处理以及愈合领域中和在治疗烧伤特别地是烧伤急救领域的那些试剂和活性成分是合适的。

用于皮肤或经皮用途的活性成分特别是皮肤-活性成分和透皮活性成分。它们包括，例如：用于治疗烧伤的试剂、用于治疗皮肤病的试剂、外用的止痛药，例如右旋丙氧芬、喷他佐辛、哌替啶、丁丙诺啡；抗风湿剂/消炎剂(抗炎药，NSARs)，例如乳香或乳香提取物、吲哚美辛、双氯芬酸、萘普生、酮洛芬、布洛芬、氟比洛芬、水杨酸及其衍生物，例如乙酰水杨酸、昔康类；类固醇激素，例如肾上腺皮质激素和糖皮质激素，比如氢化可的松、皮质醇、醋酸可的松、氯泼尼醇、泼尼松、泼尼松龙、地夫可特、氟可龙、曲安西龙、倍他米松、戊酸倍他米松、糠酸莫米松、地塞米松、甲泼尼龙、乙炔基雌二醇、medroergotamine、双氢麦角碱；抗痛风药，例如苯溴马隆、别嘌呤醇；外用皮肤病药物，抗组胺剂比如溴苯那敏、巴米品，抗生素比如红霉素、克林霉素、四环素，包括抗菌剂比如胶体银和银盐，比如氯化银、硝酸银、碘化银或现有技术已知的其它含银伤口治疗剂；抗真菌药、肽药物、抗病毒活性成分、抗炎活性成分、止痒活性成分比如麻醉活性成分例如抗组胺剂、苯佐卡因、聚多卡醇(polidocanol)或肾上腺皮质激素和糖皮质激素；祛痘剂(antiacne agent)；抗寄生物活性成分；外用激素；静脉治疗剂；免疫抑制剂比如钙调神经磷酸酶抑制剂，比如他克莫司和吡美莫司，矿物质和痕量元素，比如例如无机或有机硒化合物，锌和锌盐等，所有都用于皮肤或透皮用途。

作为澄清，注意到在本发明上下文内活性成分分类为美容或治疗活性成分并不代表最终分类。特别地，此处的分类不排除相应活性成分既用作美容又用作治疗活性成分的可能性。

用于皮肤和透皮使用的优选的活性成分选自：用于治疗皮肤疾病比如神经性皮炎、特应性皮炎、银屑病、酒渣鼻等的试剂，抗炎活性成分、止痒活性成分、鞣剂(tanning agents)、局部止痛药、麻醉剂和抗菌活性成分。

特别优选的，至少一种活性成分选自皮肤样脂质，包含例如磷脂、中性脂和神经鞘脂，以及皮肤的天然保湿因子(NMF)的成分，包含例如脲、氨基酸和羧酸、吡咯烷酮羧酸、钠、钾、钙、镁、乳酸盐(乳酸)、柠檬酸盐、氯化物、磷酸盐等、尿酸及其它有机酸。

特别优选地进一步给出在伤口治疗领域，特别是慢性伤口，褥疮、下肢溃疡、糖尿病性足部综合征等的领域中使用的那些活性成分，例如止痛药，例如免疫抑制剂、激素、麻醉活性成分、抗寄生虫药、杀真菌或抗真菌和抗细菌活性成分，比如特别是含银活性成分，例如硝酸银、氯化银、碘化银、微米尺寸银颗粒或现有技术已知的其它含银伤口处理物质，支撑和调节伤口环境的活性成分，比如特别是电解质、二氧化硅、矿物质和痕量元素例如钾、镁、钙、硒、碘等，用于实现伤口清创术的活性成分，例如胶原酶或现有技术已知的其它合适的蛋白水解酶，以及帮助伤口愈合的活性成分，例如生长因子、酶抑制剂、基质蛋白质或细胞外基质组分或可溶性(低分子量)蛋白和肽组分，不同于已经包含在根据本发明使用的胶原悬浮液中的I、III和V型胶原的胶原类型。

伤口治疗试剂领域的特别优选的活性成分选自含银活性成分，比如特别是硝酸银、氯化银、微米尺寸银颗粒、他克莫司、吡美莫司、抗组胺剂、聚多卡醇、乳香/乳香提取物、辣椒素、丹宁酸、圣约翰草油/圣约翰草提取物、月见草油、泛醇以及无机或有机硒化合物、锌和锌盐。

进一步优选的活性成分为选自蛋白源活性成分的那些，优选地包含生长因子、蛋白源激素、酶类、辅酶类、糖蛋白类、凝血因子、其它细胞因子和通过重组体技术制备的上述活性成分的变体。

根据本发明可使用的生长因子优选地选自VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、FGF-1(酸性成纤维细胞生长因子)、TGF-β、TGF-α(转化生长因子β或α)、EGF(内皮生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IGF I和II(胰岛素样生长因子/胰岛素结合生长因子I和II)、肝素结合生长因子I和II、PDGF(血小板衍生的生长因子)、PD-ECGF(血小板衍生的内皮细胞生长因子)、BMP(骨形态发生生长因子)、GHRP(生长激素释放因子)、软骨诱导因子A和B、骨生长因子、白细胞介素8、血管生成素、血管生成因子、抑肽酶和vWF(von Willebrand因子)。

作为活性成分的糖蛋白包括例如免疫球蛋白和抗体。

作为活性成分的其它细胞因子包括例如白细胞介素和干扰素。

进一步优选的活性成分为具有止血作用的那些，比如凝血因子，例如凝血酶、纤维蛋白原或胆甾醇硫酸盐(例如胆甾醇硫酸钠)，或对外部和/或内部凝血级联的因子和物质具有活化作用的活性成分，例如磷脂类、高岭土、抑肽酶、因子的浓缩物、组织因子或钙离子。

进一步可能地是给予其它活性成分，比如支气管治疗药，比如平喘药、止咳药、化痰药(mucolytics)等，抗糖尿病药，例如格列本脲、激素、类固醇激素，例如地塞米松、强心苷如毛地黄毒苷，心脏和循环治疗剂，例如β-阻断剂、抗心律失常药、抗高血压药、钙拮抗剂等，精神病药物和抗抑郁药，例如三环抗抑郁药(NSMRI)、血清素再摄取抑制剂(SSRI)、去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)、血清素-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)、单氨氧化酶抑制剂(MAO抑制剂)等，神经安定药、抗惊厥药或抗癫痫药，安眠药、镇静剂、麻醉剂、胃肠治疗剂、降脂药、镇痛药，例如抗偏头痛剂，扑热息痛，水杨酸及其衍生物，如乙酰水杨酸、双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、萘普生等，消炎药、血管舒张药、利尿剂、抗痛风药、细胞抑制剂、肌肉松弛药、避孕药，例如作为激素贴剂的形式，成瘾戒断剂，作为例如烟碱贴剂的形式，植物提取物、前维生素如β胡萝卜素，维生素例如维生素C、A、B、E等，在根据本发明的组合物中通过透皮给药，例如以透皮活性成分贴剂的形式。

根据本发明最特别优选的是加入其它结构形成剂或活性成分物质，选自基质蛋白、细胞外基质组分或可溶性(低分子量)蛋白和肽组分，优选地选自弹性蛋白、弹性蛋白水解产物，糖胺聚糖比如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、肝素和透明质酸，蛋白多糖比如聚集蛋白聚糖、纤维调节素、核心蛋白多糖、双糖链蛋白多糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖(perlecan)、高密度基底膜蛋白多糖、多配体蛋白聚糖和serglycine、纤维蛋白、纤连蛋白、葡聚糖比如眼虫糖等。最特别优选的那种类型的细胞外基质组分和结构形成剂为弹性蛋白和弹性蛋白水解产物、透明质酸和纤连蛋白。

所述胶原材料本身还可以具有一些治疗作用，特别地比如止血作用或在伤口愈合中的正向辅助作用。然而，其不是本发明含义内的活性成分。

上述活性成分单独或与以多种活性成分的组合存在于所述交联胶原基质中，基于冷冻干燥的最终产物计，优选地存在量有利地为至多40重量％，优选地至多60重量％，更优选地至多80重量％。

在所述冷冻干燥的胶原基质中，选自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分的结构形成剂或活性成分，和来自使用的胶原悬浮液操作后的任何酸溶性胶原和肽组分一起的总量可以优选地为基于冷冻干燥的最终产物的干质量计至多10重量％，更优选地至多20重量％，其通过本文定义的测定方法(BCA)测量。

根据本发明的胶原基质可以任选地包含至少一种辅助物质。

辅助物质包括：调节pH的试剂，比如缓冲剂、无机和有机的酸或碱；脂肪物质，比如矿物油，比如石蜡油或凡士林油、硅酮油，植物油比如椰子油、甜杏仁油、杏仁油、玉米油、霍霍巴油、橄榄油、鳄梨油、芝麻油、棕榈油、桉树油、迷迭香油、熏衣草油、松树油、百里香油、薄荷油、小豆蔻油、橙花油、豆油、麸油、米糠油、菜籽油和蓖麻油、小麦胚芽油和从中分离的维生素E、月见草油、植物卵磷脂(例如大豆卵磷脂)、从植物中分离的神经鞘脂/神经酰胺类、动物油或脂肪，比如牛脂、羊毛脂、乳脂肪、中性油、角鲨烷，脂肪酸酯、脂肪醇酯例如甘油三酯，以及具有与皮肤温度相应的熔点的蜡(动物蜡，比如蜂蜡、巴西棕榈蜡和小烛树蜡，地蜡比如微晶蜡，以及合成蜡比如聚乙烯蜡或硅酮蜡)，以及所有适于美容目的的油(所谓的美容油)，例如在CTFA paper CosmeticIngredient Handbook，1st ed.，1988，The Cosmetic，Toiletry andFragranceAssociation，Inc.，Washington中提到，除上述提及的清洗表面活性剂之外的表面活性试剂，比如分散剂、湿润剂、乳化剂等；填料；稳定剂；助溶剂、药学及美容常用的或其他着色剂和颜料、特别是主要用于着色水凝胶组合物而不是用于人体并着色的那些，例如那些颜料和着色剂，如在活性化合物组下面列出的装饰性着色剂；防腐剂；软化剂；润滑剂和助流剂，等。

根据本发明优选的辅助物质为脂肪和油。特别优选地为上文列出的美容油，特别是甘油三酯，特别优选辛酸/己酸甘油三酯、角鲨烷或霍霍巴油，以及月见草油。

上述辅助物质单独或与多种辅助物质组合存在于所述交联胶原基质中，基于冷冻干燥的最终产物计，优选的存在量有利地为至多80重量％，优选地至多60重量％，更优选地至多40重量％。

通常，在本发明上下文中将上面提及的材料分类为辅助物质类别并不排除这些辅助物质可能也具有一定的美容和/或治疗作用，这特别地适用于所提到的优选使用的美容油。

如果根据本发明的胶原材料包含来自至少两种所提及的组，结构形成剂、活性成分和/或辅助物质的另外组分的组合，则这些另外的组分在整个多孔胶原载体基质中的总量为至多40重量％，优选地至多60重量％，更优选地至多80重量％，在每种情况下都是基于冷冻干燥的胶原材料计。

单独的或在至少两种所述组的组合中，这些结构形成剂、活性成分和/或辅助物质的量优选地不少于0.1重量％，更优选地不少于1重量％。

如已所述，根据本发明的方法的一个进一步的优点是由于特殊的工艺，特别是由于该工艺造成的低残余环氧化物活性和在冷冻干燥之后通过调节水分含量灭活任何残余活性的可能性，例如从现有技术的方法(例如Zeeman group)已知的冲洗环氧化物交联剂不是必需的。不仅对于保存冷冻干燥的交联物质中可释放使用的胶原悬浮液的酸溶性胶原和肽组分，而且对于另外加入到胶原悬浮液中的其它结构形成剂或活性成分，这都很重要，所述其它结构形成剂或活性成分选自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分，如本文定义的，例如弹性蛋白等。为了使这些组分能够在使用时开发其积极作用，它们必须是使用时从几乎作为载体材料的交联胶原基质可释放的。因此，必须的是这种蛋白源活性成分和组分在所述材料中主要保持未交联的，且在胶原材料中没有例如通过加入环氧而交联，从而不可分开地结合的。利用根据本发明的方法，有可能将这些可溶性基质蛋白组分以未交联形式引入到胶原材料中，并且在其中主要地保持未交联，特别地还因为在根据本发明的方法中存在非常少量的环氧化物交联剂。由于该少量的交联剂，交联反应主要发生在少量环氧化物交联剂与作为反应配偶体过量存在的胶原多肽之间，而不是与低分子量蛋白源基质分子。

总的来说，这种使用时可释放的可溶性、未交联的、蛋白源组分在根据本发明的胶原基质中的含量为至少0.1重量％，优选地至少2重量％，特别优选地≥5重量％，在每种情况下都是基于冷冻干燥的胶原材料的干质量计。这种包含酸溶性胶原和肽组分和/或选自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分的结构形成剂或活性成分的可释放可溶组分的量有利地为最大直至20重量％。

这种可溶性可释放胶原和肽组分的定量可以如下来确定：例如利用BCA测定(二醌酸测定)，在37℃下，与在0.9％NaCl中提取24小时之后，上清液中作为标准的牛血清白蛋白比较，如在本文详述中描述的。

在根据现有技术的方法中，因为大量的交联剂，这种可溶性蛋白源组分也会交联，因此将不可分开地结合载体材料。在为了降低残余环氧活性而必须冲洗残余环氧化物交联剂的进一步加工中，将另外从所述材料中冲洗掉任何未交联的残余物。

在本方法的一个特别优选的实施方案中，在加入交联剂之前，不将合成亲水性聚合物，特别是不将非官能活化的合成亲水性聚合物，例如二醇比如特别是双官能活化的聚乙二醇加入到胶原悬浮液中。因此，根据本发明的交联胶原基质的特别优选的实施方案是不包括胶原与合成聚合物的偶联物的那些。

如上所述，最迟在水分调节步骤之后，根据本发明的冷冻干燥的环氧交联胶原基质不再显示出可检测残余环氧反应性，如通过本文描述的方法测量的。

此外，还表明通过根据本发明的方法可获得的胶原材料在体外毒性测定的标准方法(XTT试验)中没有显示出任何毒性，其进一步证实这种交联胶原材料的高生物相容性。

根据本发明的冷冻干燥的环氧交联胶原基质另外的特征为降解稳定性提高、相应地降解率降低(胶原酶降解/胶原酶消化减少)、在提高湿撕裂强度方面水解稳定性提高和机械稳定性增加，每种情况都是如下文定义和描述的。

因为降解速度或降解率反映胶原基质对酶促降解，特别是胶原酶消化的稳定性，可以例如利用胶原酶消化试验来测定。在该测定中，通过酶胶原酶(在PBS(磷酸缓冲盐水)缓冲液中的来自溶组织梭状芽胞杆菌(1型)的胶原酶)对胶原纤维和原纤维的降解是在控制的条件下有目的地产生的，并且在给定的反应时间之后，利用分光光度计中的UV/VIS测量来测定分解产物的量，如在下述实施例中详述的。

根据本发明的降解稳定的胶原基质的特征在于与未交联的或仅仅脱氢热交联的冷冻干燥胶原相比，降解率降低、可溶性分解产物的含量减少、其可以利用如本文描述的胶原酶消化试验测定。

降解率一方面取决于使用的交联剂的量，但在另一方面也取决于加入的任何可溶性蛋白组分(基质蛋白质，等)的量。根据使用的加工参数，可以根据期望的应用领域控制降解性质。

与未交联的或仅仅脱氢热交联的冷冻干燥胶原(降解率100％)相比，在加入胶原酶之后6小时的反应时间测量，根据本发明的胶原基质优选地具有的降解率不超过85％，优选地不超过70％，更优选地不超过50％。这意味着与未交联的或仅仅脱氢热交联的胶原相比，降解稳定性提高至少15％、优选地至少30％、特别优选地至少50％。

在用于测定胶原基质的降解率的其它方法中，通过测定被来自溶组织梭状芽胞杆菌(I型，Worthington Biochemicals)的胶原酶酶促降解前后样品的重量来确定胶原基质的降解速度。为此，将指定胶原基质片浸入包含在1ml PBS(pH 7.2)中的给定单位的胶原酶的溶液中，并在37℃下温育2小时，同时轻轻振摇。通过加入0.2ml的0.25M的EDTA溶液中止降解，并在冰上进行冷却10分钟。然后，将该样品用5ml的PBS缓冲液(pH 7.2)冲洗三次15分钟，并用5ml的去离子水冲洗三次15分钟，在-80℃下冷冻过夜，然后冷冻干燥。在冷冻干燥之后，测定部分降解的胶原载体样品的重量，并如下确定降解速度：

降解速度(％)＝100×(原始重量-降解后的重量)/原始重量

根据本发明的胶原基质的特征在于降解速度不超过约60％，更优选地不超过约50％，仍然更优选地不超过约40％，降解速度优选地为至少约2％，更优选地至少约4％，仍然更优选地至少约8％，然而更优选地至少约10％。

取决于交联度，根据本发明的交联胶原基质为在不同程度上快速可再吸收的材料。即，具有低交联度的材料在例如皮下或肌内给药之后在生物体中占优势的条件下被酶降解。因此，在接触伤口之后，所述材料可保留在其上或其中，且有助于伤口愈合。除去该材料有利地不是必需的。特别地当用作伤口治疗剂时，这样的应用是有利的。如果这种伤口治疗剂预期保留在伤口中，则它们也称为可降解的植入物。

交联的胶原材料不仅具有增加的机械稳定性(撕裂强度)，其对生物降解力(例如酶促降解)的稳定性也增加，且特别地适于作为组织重构的或缺损填充的半永久性植入物或作为例如组织工程领域中的细胞群的支架。

胶原基质的低降解速度和因而的高降解稳定性对于用作美容敷料、细胞群支架或用作例如真空辅助的伤口治疗疗法中吸收伤口渗出液的海绵材料也特别地有利。

然而，在另一方面，用作伤口治疗剂和可降解伤口治疗植入物的基质的降解率太低是不期望的，因为其可导致不完全降解的材料包封在伤口内或体内，因而导致发生不期望的组织硬化。因此，根据本发明特别重要的是调节降解速度/速率最佳化以用于期望的应用。胶原材料的降解性质受到如上所述获得的材料的性质和在制备根据本发明的胶原基质期间应用的交联条件或干燥条件的影响。根据本发明，可以采用如上所述制备的胶原材料，特别地与下文描述的胶原基质的取决于期望的应用领域的优选制备条件相结合，获得特别有利的降解性质。

特别地，用作美容敷料、组织工程中细胞群的支架和用于真空辅助伤口治疗疗法中的敷料材料的胶原材料具有不超过50％的较低降解率，这相当于与未交联的或仅仅脱氢热交联的胶原相比降解稳定性提高了至少50％。在另一方面，作为伤口治疗剂或作为保留在伤口中的可降解伤口治疗剂(可降解的植入物)或作为组织重构以及填衬(lining)深层皮肤缺损的植入物的胶原材料具有不超过85至70％的较低的降解率，这相当于与未交联的或仅仅脱氢热交联的胶原相比降解稳定性提高了至少15至30％。

在本发明的范围内，交联效果或交联度在一方面表示可以通过交联获得的胶原基质的降解率降低、或降解稳定性增加，和在另一方面表示通过增加撕裂强度(湿撕裂强度)和此外增加材料硬度提高了机械稳定性，所述撕裂强度一般地可以通过特别地本文描述的常规测定方法进行测定，所述材料硬度是通过测量弹性模量可计量的。

例如，可以通过例如本文描述的方法(胶原酶消化)测定胶原结构对胶原酶的抗性，其是交联的一个量度，未交联的材料比交联的材料被酶降解得快得相当多。

水解稳定性也是胶原基质交联的一个量度，其可以通过例如将给定量的胶原材料放置到水溶液中，并测定材料性质随时间的变化来确定。虽然未交联的或脱氢热交联的胶原材料在选择的条件(在50℃的水溶液中)下，在＜18天之后显示出完全水解(基质结构的结构分解)，但根据本发明的交联胶原材料在相同条件下没有观察到基质的结构变化。

根据本发明的胶原基质的湿撕裂强度可以根据DIN EN ISO 3376测定，其优选地为＞50cN/mm层厚度，更优选地＞100cN/mm，仍更优选地＞300cN/mm。

然而，优选地，使用如下实施例中描述的内部测量法(UV8801)测定湿撕裂强度。通过该内部法(UV 8801)测定的根据本发明的交联胶原基质的优选的湿撕裂强度为＞200cN/mm层厚度，更优选地＞400cN/mm，仍更优选地＞500cN/mm。

与未交联的胶原基质相比，以及与仅仅利用脱氢热交联或利用其它已知的化学交联剂交联的胶原基质相比，根据本发明的冷冻干燥的环氧交联胶原基质还显示出吸收、液体吸收和贮存能力显著提高，以及保湿性或水合率增加。

根据本发明的胶原基质的液体吸收或贮存能力表示吸收液体量的能力，特别结合贮存和保持这种吸收液体量的能力。根据本发明，优选地给出的那些交联胶原基质能够吸收和贮存的液体量为其自身重量的1至200倍，优选10至100倍。

可以被所述材料吸收的液体量的量度由质量溶胀度(Q_m)表示：

$Q_m=\frac{m_{\mathrm{Gel}}}{m_{\mathrm{tr}.\mathrm{Pr}.}}$

其中Q_m表示溶胀材料的质量(m_Gel)与溶胀前干材料的质量(m_tr.Pr.)的比值。

为了测量质量溶胀度，因而称重冷冻干燥的材料，然后将其放入包含15至25℃温度的过量蒸馏水的皿中的水表面上，并使其溶胀10分钟。在没有机械作用下，倾倒出过量的水。在重新测量溶胀组合物的重量之后，根据上式计算质量溶长度。

根据本发明的冷冻干燥的组合物优选地具有的质量溶胀度为15至100。

另外，还可能基于组合物的重量指出液体保持能力。为此，在倾倒出过量液体之后，将在上述试验方案中计算的溶胀材料样品的重量增加转换为相应于该重量增加的液体体积，并且基于使用的1g组合物指出该被吸取的液体体积。

根据本发明的胶原基质的特征还在于与未交联的或仅仅脱氢热交联的胶原基质相比光密度较高。

此处的光密度表示定量的单位光密度，测量为透射光强度与入射光强度的商的常用对数，其是使用Heiland SW比重计TD 03对于具有层厚度1m的层状胶原基质计算的。本发明的胶原基质优选地具有的光密度为每mm层厚度≥0.02，更优选地≥0.03，仍然更优选地≥0.05。

根据本发明胶原基质的除了上述优点之外，所述优点基本上是由根据本发明的方法引起的结果，根据本发明的环氧化物交联胶原材料特别地具有相对于未交联的或仅仅脱氢热交联的胶原材料和利用其它已知化学交联剂交联的胶原材料而言下述有利的性质：

-触感更好：所述材料比例如同样层厚度的未交联的/脱氢热交联的材料更柔软、柔滑、触感更饱满或更丰满。这在美容领域中是特别地有利的。

-光密度更高：在美容应用和对于采用颜色印象评价的实施方案的领域中是有利的。

-恢复力更高：交联的材料不与例如未交联的/脱氢热交联的材料一样容易地响应机械作用而在湿态下收缩，且其更容易再次呈现出其原始体积，类似于海绵。

-吸水能力提高，

-水合率提高，

-高挠性和弹性

-可控制的细胞群/细胞反应(细胞与材料的反应)

关于可控制的细胞群/细胞反应，应当注意利用根据本发明的方法，已发现有目的地控制关于硬度和挠性、酶降解性(降解率)的材料性质，和提供如上所列可释放的可溶性胶原和肽组分或其它基质蛋白和可溶性肽组分的可能性。

在硬度和挠性的控制方面，应当注意已知适于细胞群的基质的硬度/挠性对于粘附于其的细胞的性质有显著影响。近年来，细胞环境对细胞表型发育及其表达方式、迁移和增殖行为的影响逐渐推进到组织工程领域中基础研究的最前沿。除了其组成，细胞外基质(ECM)的硬度(刚度或硬度)和弹性是特定细胞环境的主要方面。

细胞外基质的硬度是细胞行为的调节信号。例如，干细胞分化直接取决于基底的硬度；同样地，成肌纤维细胞的行为例如是基于细胞环境的特定硬度。细胞直接对包围其的ECM的机械反馈(机械-化学传感)产生反应。

为了研究包围细胞的材料的硬度与基于此的细胞反应之间的联系，使用不同硬度和组成的凝胶是现有技术已知的(Mih等人，PLoS ONE 6(5)：e19929；2011)。合成基底的实例是不同聚合度的聚丙烯酰胺水凝胶，以及聚电解质多层(PEM)；也使用蛋白质基凝胶，例如胶原凝胶(例如根据Yang等人，BiophysicalJournal Vol.97，2051-2060；2009)。可溶性胶原的胶原凝胶硬度直接取决于形成凝胶的蛋白质的浓度，并可以通过另外的交联，例如与戊二醛或京尼平(genipin)交联进行进一步改性。

所述材料的弹性是利用所谓的弹性模量(也称为：杨氏模量)E.定量的。其定义如下：

弹性模量(也称为：杨氏模量，来自物理学家Thomas Young)是一个来自材料工程的材料常数，其描述具有线性弹性行为的固体变形时应力和应变间的关系。弹性模量缩写为符号E。

弹性模量的值越高，材料对变形的抗性越大。因此，具有高弹性模量的材料是坚硬的，具有低弹性模量的材料是挠性的。

已知在健康组织和病态组织或受损伤组织中的ECM硬度具有宽的分布。

例如，神经组织(脑)的硬度为E＝约2.5kPa，肌肉组织的硬度为E＝12kPa，而骨的硬度为E＝18GPa。对于如伤口愈合中存在的肉芽组织，描述了起始硬度为0.1至1kPa，7天之后为18kPa(Krishnan等人，Cell Adhesion&Migration2：2，83-94；2008)。

感兴趣的是提供用于生物工程学、基础研究和组织工程领域中3D培养的支架，其也具有高生物相容性和相应降解稳定性，还具有对所述组织特异性的硬度，并且可以有目的地调节以便能够提供用于待培养细胞的最佳细胞环境。

根据本发明的胶原基质具有利用根据本发明的方法可调节的硬度，其范围为0.01至100kPa，优选范围为0.1至60kPa，特别地优选范围为2至40kPa。

因此，有可能利用本发明的方法交联胶原基质，有目的地使材料性质适应于最佳细胞向内生长(群)、细胞分化、特别是用于直接接触基质的细胞的所谓表达谱的要求。表达谱表示例如特定基质蛋白、细胞骨架蛋白(肌动蛋白)、细胞因子、蛋白酶等的表达。这种细胞分化或填充基质的表达谱的控制在组织工程和生物植入物领域中，以及构建基础研究、诊断学和分析的模型系统中特别有利。

由于根据本发明的交联胶原基质的上述有利的性质，它们特别地适用于美容和医学、药学或生物技术应用。

因此，本发明还提供根据本发明的胶原基质作为美容试剂，特别地作为美容敷料或面膜的美容用途。

根据本发明的冷冻干燥的环氧交联胶原基质作为美容敷料或面膜的应用优选地通过将干燥状态的敷料或面膜应用到待处理的身体部分上、且然后用水或一种或多种活性成分和/或任选辅助物质的水溶液水合，或者在将其应用到待处理的身体部分上之前通过用一种或多种活性成分和/或任选的辅助物质的水溶液浸泡美容敷料或面膜形式的胶原基质而进行。

当使用根据本发明的胶原基质作为伤口处理剂时，也可以进行相应的干燥或预润湿应用。

本发明进一步涉及根据本发明的冷冻干燥的环氧交联胶原基质用作人或动物中的药物试剂(也包括医疗装置)，特别是局部或皮肤应用或用于植入。

特别优选地是根据本发明的胶原基质作为植入物、作为皮肤或透皮治疗剂和/或作为止血剂和作为组织工程领域中细胞培养的支架的用途。

本发明进一步涉及根据本发明的胶原基质，其用于至少一种选自下述的适应症或应用：治疗急性或慢性伤口，改善伤口愈合，补偿组织缺损，填衬深部皮肤缺损同时构建体积，帮助组织再生，再生皮肤，治疗烧伤，用于整形外科，瘢痕切除后使用，与自体分离皮肤(split-skin)移植物联合治疗，帮助形成肉芽组织，帮助血管生成，确保较好的瘢痕质量，治疗慢性伤口比如下肢溃疡、褥疮和糖尿病足，治疗开放伤口，治疗伤口愈合障碍，治疗与深部皮肤缺损有关的疾病，生产颌植入物，生产骨植入物，生产软骨植入物，生产组织植入物，生产皮肤植入物，生产医用敷料，生产透皮敷料，生产伤口橡皮膏，生产伤口绷带材料，生产伤口敷料和生产用于植入细胞基质元件的用于细胞增殖的细胞培养物基质，和在生物工程学中生产用于基础研究、诊断学和分析的体外繁殖组织系统的模型系统(例如皮肤模型)。

此外，根据本发明的胶原基质也可以用于真空辅助伤口治疗疗法，如由现有技术一般已知的，描述在例如US 2007/0027414中。因为其高挠性，根据本发明的胶原基质可以成功地引入到这种真空处理的创面(wound bed)中，在该处它们由于其良好的吸收和水合性质积极地有助于除去过量伤口液体。在一方面，可渗透的多孔胶原基质由于其基本的高亲水性和溶胀性已实现了渗出液的转运。此外，由于冷冻干燥处理的结果，根据本发明的胶原基质具有高孔隙率，其另外还促进了液体的通过。一个另外的优点是根据本发明的胶原基质本身对于伤口愈合过程已具有积极的影响，这特别地是由于其中包含的可释放的可溶性胶原、肽和蛋白组分。

特别地还由于其相应于低残余环氧活性的高生物相容性，和它们包含的可释放的可溶性胶原、肽和蛋白组分，根据本发明的胶原基质特别适于上述应用。

对于根据本发明的交联胶原基质的上述优选的应用领域，其优选地为层状面膜、片材、基质、敷料、垫、层或类似的扁平形式的形式。这种层状形式特别适于还受到较大影响的皮肤区域的外部处理和平面处理。

在一个进一步可能的实施方案中，这种层状胶原基质也可以是完全地或部分地层压的，即以互相结合的多层(夹层)形式存在。其可以用作现有技术已知的层压常规材料，例如合适材料的纤维、非织造布、网状物、膜、或箔，例如人造纤维(rayon)、纤维素、聚乙烯(PE)或聚氨酯(PU)或其它合成或半合成聚合物/共聚物，其可以用常规方法例如粘合、热层压、交联等坚固地结合本发明范围内的载体材料。这种层压物特别适于另外提高根据本发明的层状胶原材料的机械稳定性，以及改善特别地应用期间以润湿状态的其处理性。一种优选的层压物包括与自粘性层或层状橡皮膏材料的层压物，其优选地以如下方式应用于所述层状胶原材料：使得该自粘性层压层完全地或部分地凸出胶原材料的边缘，以便类似于常规橡皮膏排列，层压的胶原材料可以容易地利用边缘凸出的自粘性层压物固定到待处理的皮肤区域。在这种自粘性层压胶原材料的情形下，特别优选地给出皮肤特别良好耐受的那些自粘性层压涂层，其具有低的引起刺激和变态反应的倾向，且容易除去，以便不对可能已经损害或刺激的皮肤区域在除去粘合层时带来另外的损伤。根据期望的使用领域，这种层压物可以是闭合的、半闭合的或亲水的和非闭合的，优选地给出亲水性、非闭合的或至多(“至多仍然(at most still)”的含义)半闭合的层压物，以便允许层压的胶原材料水合而使用。此外，当选择这种自粘性层压涂层时，必须保证粘合层是非水溶性的，以便当润湿该材料时粘合剂不能溶解，因此不丧失粘合或固定作用。

因此，本发明还特别地包括层状交联胶原材料，其完全或部分地提供有选自纤维、非织造布、网状物、膜或箔或自粘性层的其它层，其以如下方式应用于层状胶原材料：其随胶原材料在边缘终止或完全或部分地在边缘凸出胶原材料外。

如上所述，在美容使用和医学使用之前，根据本发明的胶原基质可以为预浸泡的，即完全再水合的。这样的浸泡或再水合优选地采用选自下述的水溶液进行，包含：水和任选的软化水或所谓的热水、生理溶液和包含至少一种活性成分和/或辅助物质的水溶液。用于浸泡或再水合的水溶液也称为活化剂溶液。

这种活化剂溶液可以为，例如容易挥发的活性成分和/或辅助物质的溶液，由于制备过程例如冷冻干燥，其不应当或不能引入到冷冻干燥的材料中，例如一些精油的级分、香料等。还可以存在如下活性成分和/或辅助物质：其获得了另外的水合作用，且由于该水合作用或吸湿性趋势，不能掺入到根据本发明的冷冻干燥的胶原基质中，或者因为不能保持冷冻干燥的胶原材料本身的稳定性或存在的任何水分不稳定的活性成分的稳定性而可以仅仅少量掺入。

一般地，上文提及的一种或多种活性成分和/或辅助物质可以存在于活化剂溶液中。特别地，包含一种或多种上文提及的优选的活性成分或辅助物质的活性成分溶液特别适于根据本发明优选的适应症的治疗用途。

在一个特别优选的实施方案中，使用基本上不含来自聚醚、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚二醇(PG)的防腐剂和/或辅助物质的活化剂水溶液。

在本发明的一个进一步优选的实施方案中，根据本发明的环氧交联胶原材料与所述活化剂溶液以相关的空间排列(组合制剂、应用试剂盒、组件(set)、配套组件(kit-of-parts)等)存在。这种组合制剂或配套组件排列优选包括至少一种根据本发明的胶原基质，优选地为层状敷料、垫或面膜形式的那些，以及至少一种可以包含一种或多种活性成分和/或至少一种或多种辅助物质(活化剂溶液)的水溶液。

在一方面根据本发明的胶原材料的这种组合制剂或配套组件组合的结构和在另一方面活化剂溶液可以提供使这两个部分分开从该配套组件配置取出，并在外部将其组合用于进一步使用。然而，也可能在配套组件包装本身内组合所述组分，例如在为其提供的室内，然后，该再水合的组合物直接从中取出用于进一步的外部或透皮使用。这可以优选地由最终使用者直接进行。

本发明采用下述实施例更详述地阐述。

实施例

实施例1：

制备实施例1a

环氧化物交联的纯胶原基质(5％环氧化物交联剂/干质量)

使用基于胶原悬浮液的干质量5％的环氧化物交联剂量，在不加入其它可溶性蛋白或肽组分、活性成分和/或辅助物质下，根据本发明的环氧交联的胶原生物基质的制备实施例。

a)提供3000g的胶原悬浮液(干含量胶原：1.6％，胶原含量：48g)，其是通过根据DE4048622A1，特别是DE 10350654A1的方法制备的。

b)将该胶原悬浮液的pH值调节至pH 3.3。

c)(省略)。

d)在低于10℃的温度下，在5分钟时期内，将2.4g的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE，Sigma-Aldrich)滴加到胶原悬浮液中，同时用桨式搅拌机(eurostar，IKA)以600转/秒(rps)搅拌。使得到的物质按约750g的份在真空搅拌机(Smartmix，Amann/Girrbach)中脱气。

e)在混入交联剂2小时之内，将脱气的悬浮液倾倒成片并冷冻，将该胶原悬浮液保持在＜18℃的温度下直到冷冻。

f)然后，将冷冻的物质贮存在-20℃下24小时，之后进行冷冻干燥，冷冻干燥温度保持在低于100℃。

g)经24-48小时期间，在60-70％相对湿度的湿度下，将冻干的胶原基质再水合至基于干燥胶原基质计含水量直至(up to)25％。

h)将如此得到的胶原基质分成1-2mm的层，加工，并任选地进行γ灭菌(20kGy)。

制备实施例1b

环氧化物交联的纯胶原基质(10％环氧化物交联剂/干质量)

使用基于胶原悬浮液的干质量10％的环氧化物交联剂量，在不加入其它可溶性蛋白或肽组分、活性成分和/或辅助物质下，根据本发明的环氧交联的胶原生物基质的制备实施例。

该制备是类似于制备实施例1a进行的，其中在步骤d)中，加入4.8g的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE，Sigma-Aldrich)，并在步骤g)中，进行再水合直至96小时。

实施例2：

制备实施列2a

含有来自基质蛋白(弹性蛋白水解产物)的另外的可溶性蛋白组分的环氧化物-交联的胶原基质(5％环氧化物交联剂/干质量)

使用基于含水胶原悬浮液的干质量5％的环氧化物交联剂量，在加入其它可溶性蛋白/肽组分(基质蛋白：弹性蛋白)下，根据本发明的环氧交联胶原生物基质的制备实施例。

a)提供3000g的胶原悬浮液(干含量的胶原：1.6％，胶原含量：48g)，其是通过根据DE4048622A1，特别是DE 10350654A1的方法制备的。

b)将该胶原悬浮液的pH值调节至pH 3.3。

c)在低于10℃的温度下，在5分钟时期内，将2.4g的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE，Sigma-Aldrich)滴加到胶原悬浮液中，同时用桨式搅拌机(eurostar，IKA)以550转/秒搅拌。

d)然后，在相同的条件下，加入30g的弹性蛋白水解产物(Elastin spezialB1N，GfN，Naturextrakten GmbH生产)。使得到的物质(含水胶原混合物)按约750g的份在真空搅拌机(Smartmix，Amann/Girrbach)中脱气2×5分钟。

e)在混入交联剂和弹性蛋白水解产物2小时之内，将脱气的胶原混合物倾倒成片并冷冻，将该胶原混合物保持在＜10℃的温度下直到冷冻。

f)然后，将冷冻的物质贮存在-20℃下24小时，之后进行冷冻干燥，冷冻干燥的温度保持在低于100℃。

g)经2448小时期间，在60-70％相对湿度的湿度下，将冻干的胶原基质再水合至基于干燥胶原基质计含水量直至25％。

h)将如此得到的胶原基质分成1-2mm的层，加工，并任选地进行γ灭菌(20kGy)。

制备实施例2b

含有来自基质蛋白(弹性蛋白水解产物)的另外的可溶性蛋白组分的环氧化物-交联的胶原基质(10％环氧化物交联剂/干质量)

使用基于含水胶原悬浮液的干质量10％的环氧化物交联剂量，在加入其它可溶性蛋白/肽组分(基质蛋白；弹性蛋白)下，根据本发明的环氧交联的胶原生物基质的制备实施例。

该制备是类似于制备实施例2a进行的，其中在步骤c)中，加入4.8g的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE，Sigma-Alcrich)，并在步骤g)中，进行再水合直至96小时。

实施例3：

制备实施例3

含有来自美容脂肪和油(甘油三酯/中性油)的另外的活性成分/辅助物质的环氧化物-交联的胶原基质(4.8％环氧化物交联剂/干质量)

使用基于含水胶原悬浮液的干质量4.8％的环氧化物交联剂量，在加入其它来自脂肪和油(甘油三酯/中性油)的活性成分/辅助物质下，根据本发明的环氧交联胶原生物基质的制备实施例。

a)提供3900g的胶原悬浮液(干含量胶原：1.6％，胶原含量：62.4g)，其是通过根据DE4048622A1，特别是DE 10350654A1的方法制备的。

b)将该胶原悬浮液的pH值调节至pH 3.3。

c)在低于10℃的温度下，在5分钟时期内，将2.95g的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE，Sigma-Aldrich)滴加到胶原悬浮液中，同时用桨式搅拌机(eurostar，IKA)以550转/秒搅拌。

d)然后，在相同的条件下，加入3.8g的中性油。使得到的物质(含水胶原混合物)按约750g的份在真空搅拌机(Smartmix，Amann/Girrbach)中脱气2×5分钟。

e)在混入交联剂和中性油2小时之内，将脱气的胶原混合物倾倒成片并冷冻，将该胶原混合物保持在＜10℃的温度下直到冷冻。

f)然后，将冷冻的物质贮存在-20℃下24小时，之后进行冷冻干燥，冷冻干燥温度保持在低于100℃。

g)经24-48小时期间，在60-70％相对湿度的湿度下，将冻干的胶原基质再水合至基于干燥胶原基质计含水量直至25％。

h)将如此得到的胶原基质分成1-2mm的层，加工，并任选地进行γ灭菌(20kGy)。

实施例4：

利用SDS-PAGE定性测定可溶性蛋白

缩写解释：SDS-PAGE

SDS＝十二烷基硫酸钠，洗涤剂，长链脂肪酸的钠盐

PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳，在丙烯酰胺聚合物凝胶中的电泳

电泳：通过应用电压，导致粒子迁移，从而分离载体物质中的带电粒子。

简要说明：通过加入pH＞7离子洗涤剂，将不带电蛋白转变成带电粒子，其通过应用电压在引起的电场中，基于它们的大小与形状在凝胶中沿着迁移距离分离。质量低的蛋白比质量较高的大蛋白迁移得更快。球形蛋白比细长形、线状蛋白迁移得更快。蛋白组根据其大小和形状在凝胶中分离成窄条(称为条带)，其可以用特定染料显影。基于它们的迁移距离，与参照物质(分子量标准＝已知大小的蛋白)比较，目测评价蛋白或蛋白片段的大小。

合适的测试系统是常规市售可获得的标准测试系统，例如来自Biorad的标准系统：

标准XT Precast Gel 4-12％丙烯酰胺，

缓冲系统：Bis-Tris，12+2Well Comb，45μl/孔

凝胶厚度：1mm，编号345-0123Bio Rad

缓冲液B：Criterion XT Mes(缓冲液，20×)Control 210007145

样品缓冲液：XT样品缓冲液4×，10ml Control 310008088

采用基于蛋白-敏感性染料考马斯蓝的即用型试剂GelCode Blue Safe Stain(Thermo Scientific)获得最终蛋白凝胶的染色。

实施例5：

利用BCA方法定量测定可溶性蛋白组分

利用BCA试验检测可溶性蛋白和蛋白组分是基于蛋白与碱性溶液中的Cu²⁺离子形成络合物(双缩脲反应)的事实。该络合物的Cu²⁺离子还原为Cu⁺离子，其与二喹啉甲酸(BCA)形成紫色络合物。通过光谱测定法在562nm测定该颜色络合物的吸收。利用半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和肽键的侧链进行还原，颜色形成的强度(涉及基团的氧化还原作用)特别地依赖于温度，使得试验的敏感性可以通过温度变化来调节。

合适的试验系统是常规市售可获得的标准试验系统，例如Pierce BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)。

该测定与BSA(牛血清白蛋白)标准溶液的比较进行。

显色反应条件：60℃，1小时反应时间。

试验结果：

图1显示与含有弹性蛋白水解产物(100％)的仅脱氢热交联胶原基质相比，在含有另外的可溶性基质蛋白(弹性蛋白水解产物)的环氧交联胶原基质中可溶性蛋白组分的百分比，该环氧交联胶原基质对应于根据制备实施例2a和2b的组合物，其为用5％和10％浓度的环氧化物交联的，在每种情况下都是基于胶原悬浮液的干质量。(在该图中，“未交联”表示脱氢热交联的(即非化学交联的)胶原基质)。该图清楚地显示出，尽管化学交联，所述材料中保持高比例的可溶性蛋白组分和基质蛋白。所述测量另外显示出如下重量的可溶性蛋白组分，在每种情况下都是基于冷冻干燥的最终产物计，对于试验材料：

含有弹性蛋白的脱氢热交联的胶原基质(“未交联的”)：＞15重量％

含有5％环氧化物的制备实施例2a：＞10重量％

含有10％环氧化物的制备实施例2b：＞4重量％.

实施例6：

降解率的测定

胶原酶消化试验

利用基于胶原酶降解胶原纤维的方法进行胶原基质的酶稳定性(降解稳定性)的测定。在该方法中，胶原酶(在PBS缓冲液(磷酸缓冲盐水)中，来自溶组织梭状芽胞杆菌(1型)的胶原酶)对胶原纤维和原纤维的降解是在控制条件下有目的地实现的，在规定的反应时间之后，利用分光光度计的UV/VIS测量来测定分解产物的量。

使用的化学品：

-TRIS缓冲溶液：TRIZMA碱(Fluka Art No.93350LOT 450756/1)，CaCl₂*6H₂O(Riedel de Haen Art No.12074LOT 12610)，

-HCl 25％(Merck Art No.1.00316.1000LOTZ730816335)

-EDTA溶液：乙二胺-四乙酸二钠盐二水合物0.2mol/l(Fluka Art No.03679LOT 1104109 10505293)

-胶原酶：Sigma C 688T LOT 122k8607，700U/mg

-胶原基质：例如根据制备实施例1至3

试剂的制备：

-TRIS缓冲溶液0.1M/25mM CaCl₂：

将1.21g的TRIZMA碱和0.55g的CaCl₂*6H₂O一起溶解在80ml的RO水中，并用约1ml的25％HCl调节至pH值为7.4。然后，将该溶液转移到100ml的量瓶中，用RO水补足。

EDTA溶液0.2mol/l：

将3.7224g的乙二胺-四乙酸二钠盐二水合物溶于50ml的RO水中(使用磁力搅拌器约30分钟)。

酶溶液：

将5mg的所述酶溶于1ml的TRIS缓冲溶液中。对于各个试验，将50或100U(电荷-依赖体积，此处＝35和70μl)的等分试样加入到该试验系统中。

乙酸0.95％：

用RO水将0.95ml的冰醋酸补足为1000ml。

步骤：

将具有半径10mm(干重约15mg)的片切为2mm厚的胶原片材，并在干燥器中干燥12小时。将样品称重到2ml的离心管容器(Safe Lock Tubes0030.120.094)中，加入1.5ml的TRIS缓冲溶液。一旦加入35μl的酶溶液，就在Thermoblock(Stuart Scientific封闭加热器)中将样品调节至37℃。

在相应消化时间(1.5小时、3小时、6小时和23小时)之后，将200μl的EDTA溶液加入到离心管容器中，并在18℃下，用最大性能离心40分钟。用7.5ml0.95％的冰醋酸用于稀释，将800μl的等分试样转移到10ml标准磨口试管中，用塞子密封，并轻轻地从一侧移动到另一侧用于匀浆化目的。

光度计测量：

在UV/VIS分光光度计中，在234nm的波长处进行测量。使用10mm石英比色杯。将7.5ml的乙酸与800μl的TRIS缓冲溶液测量为空白值。在测量样品之前，相应酶溶液(此处：在离心管容器中1.5ml的TRIS缓冲液中的35μl酶溶液，其中800μl在7.5ml的乙酸中)应当测量为零值，其吸收设定为图中的零值(吸收约0.0166)。

对于绝对值的测定，还根据上述步骤制备和测量校准溶液。

校准溶液的制备：

在37℃下，在8ml的TRIS缓冲液中，将0.1006g的胶原用233μl的胶原酶溶液(相当于600U)完全地降解过夜。在第二天，将1333μl的EDTA溶液加入到该溶液中，并将其在量瓶中用TRIS缓冲液补足至10ml。根据下表，用0.95％乙酸将该溶液的相应体积稀释至10ml，并在234nm处测量该溶液的吸收。

相应校准曲线具有线性方程

A(234nm)＝0.0011c-0.0407(R²＝0.9983)。

试验结果：

图2a显示与含有弹性蛋白水解产物的仅脱氢热交联的胶原基质相比，根据制备实施例1a不含有另外组分的环氧交联胶原基质和根据制备实施例2a含有另外可溶性基质蛋白(弹性蛋白水解产物)的环氧交联胶原基质(在每种情况下，环氧化物的浓度为5％)的相对降解率(％)。(在该图中，“未交联的”表示脱氢热交联的(即非化学交联的)胶原基质)。

该图清楚地显示出根据本发明的环氧化物交联胶原材料随着降解率的降低(酶促降解减少)降解得到改善。

此处，将在6小时之后完全溶解的基质设定为100％。将吸收值对10mg的基质标准化。

通过测定校准曲线，可以由吸收值计算溶解量的绝对值：

图2b显示在直至23小时期间对10mg使用基质标准化的溶解基质的相应绝对浓度。

图2b还以降解百分数显示直至23小时期间降解的发展。因此，甚至在23小时胶原酶消化之后，根据本发明交联的胶原基质显示出比化学未交联的基质显著更好的降解稳定性。

实施例7：

水解稳定性的测定

通过将给定的胶原材料放置在水溶液中、并贮存在50℃并测定材料性质随着时间的变化来研究胶原基质的水解稳定性。

用于研究水解稳定性的水溶液的实施例具有下述组成：

	制造商	量(％)
			甘油	Merck	2.50
1，5-戊二醇	Merck	2.40
			Rokonsal MEP	ISP	0.250
氯化钠	AppliChem	0.10
			超纯水		94.75

制备：

1)使用磁力搅拌器将甘油、戊二醇和Rokonsal MEP溶解在玻璃烧杯中，

2)用超纯水(SHC 101)补足至最终量的约98％，同时搅拌

3)加入NaCl，并使用磁力搅拌器溶解

4)用1％柠檬酸溶液调节pH值至pH5.0

5)用超纯水(SHC 101)补足至最终量

6)如有必要，检查pH值，并再次调节至pH5.0

在一方面，可以通过测量由于基质收缩引起的表面积减小来确定水解稳定性。

另外可以利用根据下式确定的质量减小来确定水解稳定性

水解稳定性(％)＝M_tx×100/M_t0

其中M_tx＝干的完整的/粘性基质材料的质量

M_t0＝开始试验之前干基质材料的质量

试验结果：

在上述条件下，通过测定下述材料的表面积减小来研究水解稳定性：

a)包含甘油三酯/中性油的脱氢热交联的胶原基质(“未交联的”)，其为在冷冻干燥温度＞120℃下冷冻干燥的，

b)根据本发明制备实施例3的环氧交联胶原基质(包含甘油三酯/中性油)，和

c)相应于根据制备实施例3的组合物(包含甘油三酯/中性油)的环氧交联胶原基质(5％环氧化物/DM)，其为在冷冻干燥温度＞120℃下冷冻干燥的。

图3显示在选择试验条件下仅仅5天之后，根据a)仅脱氢热交联的胶原材料(“未交联的”)显示出完全水解(基质结构的结构分解)，而在根据b)的根据本发明的环氧交联胶原材料的情形下，在相同条件下甚至18天之后没有观察到基质的结构变化。在相同时间点，与根据b)的根据本发明的材料相比，根据c)在冷冻干燥温度＞100℃下干燥的环氧交联胶原材料显示出开始水解(表面积收缩)。在约4周之后，根据b)的根据本发明的基质也显示出开始水解，根据c)在较高温度下干燥的材料此时显示出显著较差的水解稳定性。因此，结果反映出冷冻干燥温度也对水解稳定性有影响的事实。因此，与根据本发明制备的材料(冷冻干燥温度＜100℃)相比，暴露于冷冻干燥温度＞100℃下的基质显示出的水解稳定性较差。

例如，图4显示在上述试验条件下贮存18天之后，与根据b)的根据本发明的基质相比，根据a)的脱氢热交联基质的水解度。

实施例8：

湿撕裂强度的测定内部法(UV8801)

在利用模具测定撕裂强度的方法(内部测量方法UV8801)中，借助于机械测试器(Zwick材料测试器B Z 2.5/TN 1S)将具有球型头(直径为25mm)的金属模具压在根据本发明的胶原基质的层压实施方案上，并记录模具留下和施加的路径和力。

对于测定，将具有厚度1.5mm的层状胶原基质切成8×8cm的尺寸，并引入到所述装置的样本接收器中，并在其中完全润湿。然后，开始测量，并将球形模具压在样品上直到所述材料撕裂。

利用电子数据记录记录该材料撕裂的力，计算并显示。

试验结果：

例如，图5显示与仅脱氢热交联的胶原基质(未交联的，在100℃干燥，“未交联的”表示仅仅脱氢交联的(即，非化学交联的))相比，具有根据制备实施例1a的组合物的环氧交联胶原基质的湿撕裂强度(根据内部法UV8801)增加。

图5还显示冷冻干燥温度对湿撕裂强度的影响。根据该图，暴露于冷冻干燥温度≥100℃或干燥后在＞100℃下的基质显示出比根据本发明的材料更差的湿撕裂强度。

而且，图6另外显示了环氧化物交联剂浓度对湿撕裂强度的影响。表明随着环氧化物浓度增加＞5％(在含水胶原悬浮液/混合物的DM中)，湿撕裂强度降低。在给定的工艺条件下，采用5％至10％(DM)的环氧化物浓度获得最佳湿撕裂强度。该图还显示，如预期的，仅仅脱氢热交联的胶原材料的湿撕裂强度随着冷冻干燥温度的增加而增加。

图7显示在冷冻之前保持含水胶原悬浮液/混合物的静置时间和温度对湿撕裂强度的影响。由此显然可见比较长的静置时间和较高的温度会不利地影响胶原材料的湿撕裂强度。

所有测试的环氧交联基质材料都显示出湿撕裂强度＞400cN/mm层厚度。

脱氢热交联的材料显示出湿撕裂强度＜200cN/mm层厚度。

实施例9：

反应性环氧化合物的检测

残余环氧活性的测定(NBP测定)

可以利用修改的NBP测定(硝基苄基-吡啶测定)来测定残余环氧活性，所述测定是基于Agarwal等人的“Detection of Epoxides with 4-(p-nitrobenzylpyridine”(1979)Bull.Environm.Contam.Toxicol.23，第825-829页，根据Zocher等人(2000)“Epoxide hydrolase activity of Streptomyces strains”J.Biotechnol.Feb 17；77(2-3)，第287-292页进行修改。

1.原理

该试验方法用于在用环氧化物稳定的生物基质的情形下，在冷冻干燥的最终产物中可溶性、反应性环氧化合物的定量测定。

对硝基苄基吡啶与烷基化化合物(包括环氧化物)反应，得到无色、微溶的盐，当与碱反应时，其去质子化成兰色、微溶的染料。可以通过光谱测定法在波长570nm处检测色密度。

2.试剂/化学品

对-硝基苄基吡啶(NBP)(Merck，用于合成)

乙二醇(Fluka，purum)

丙酮(Fluka，用于紫外光谱)

三乙胺(Fluka，purum)

1，4-丁二醇二缩水甘油醚或BDDG或环氧化物(Sigma Aldrich，purum)

RO水

由其制备的：

基质溶液：在50℃，将1g的NBP溶于5ml的乙二醇和1.25ml的丙酮中(足够10个样品)

碱溶液：50％三乙胺的丙酮溶液(v/v)(足够10个样品)

3.装置

具有磨砂玻璃的试管，磨砂玻璃塞，磨砂玻璃夹钳或具有螺旋盖的50ml实验室烧瓶

温箱和加热器(50℃)

具有安全封闭或螺旋封闭的2ml反应容器

200μl和1000μl的微量移液管(Eppendorf)，匹配有吸管头

UV光谱仪(570nm)

1.5ml一次性塑料比色杯(Plastikbrand，No.7591 50)

4.样本

将待试验的胶原材料切开(12mm)，每个样本(一式三份)1-3个压模(dies)

比较样本：不含化学交联剂的冷冻干燥的生物基质(例如，仅仅脱氢热交联的胶原基质)

5.步骤

基质溶液：

对于每种情况下的10个样本，将1g的NBP称重到具有磨口玻璃的试管中，并与5ml的乙二醇和1.25ml的丙酮混合。对于较大数量的样本，相应地扩大数量，并使用有螺旋盖的烧瓶。

在仔细地关上容器(磨口玻璃塞/磨口玻璃夹钳或螺旋盖)之后，在温箱中于约50℃加热该基质混合物，同时不时从一侧移动到另一侧，直到固体完全溶解(1/2-1小时)。然后，将该基质溶液冷却至室温。盐保持溶解。

碱溶液：

将3ml的三乙胺和3ml的丙酮密封在具有磨口玻璃的试管中，并混合。

用于校准曲线的标准样本的制备：

预稀释：

利用Pasteur移液管(玻璃)将1g的环氧化物，精确到0.001g，直接称重到100ml测量瓶中，用RO水补足100ml，并充分混合(1∶100)。

利用1000μl的移液管，将精确1000μl预稀释液转移到100ml测量瓶中，补足100ml，并充分混合。这是用于产生标准测量值(校准曲线)的环氧化物稀释液(1∶10,000)。

标准测量值：

将等量的12mm比较材料的片(不含交联剂)加入到2ml反应容器中，标记该反应容器。使用200μl移液管，向非织造布中加入不同体积的RO水(体积参见A行，表1)，然后加入600μl的基质溶液。

表1标准测量值

最后-就在试验样本完成之后-向反应容器的标准系列中加入环氧化物稀释液1∶10,000(体积参见B行，表1)。简单地，再次从一侧移动到另一侧。

试验材料：

将1-3个12mm的待试验材料的片称重到2ml反应容器中，精确到0.1mg，一式三份，用200μl的RO水浸泡。然后，将600μl的基质溶液加入到该浸泡的片中。

轻拍该反应容器直到最初是浑浊的悬浮液变得澄清。如果反应溶液处于顶部之下，通过短暂的离心将该液体移动回到底部。在温箱中或加热器中，于50℃下，将所有仔细地密封的样本温育1小时。

冷却至室温，然后加入600μl的碱溶液，并短暂振摇。必须在10分钟之内进行吸收的测量。

使用1000μl的移液管移除所有胶原片的上清液，并转移到1.5ml塑料比色杯中。

在加入碱溶液之后10分钟之内，在570nm处测量吸收。

测量程序：方法/浓度/ENBP

校准点：标准测量值50(＝25nmol环氧化物)

平行光束和空白：空的塑料比色杯

6.评价

利用校准曲线(浓度/吸收关联)确定反应性环氧化物的量。测量结果与试验基质材料的原始称重量相关联，并得到：

环氧化物的量：ng/mg胶原

试验结果：

例如，图8显示根据本发明基于根据制备实施例1a的基质制备的胶原材料的残余环氧化物活性，及其在冷冻干燥之后随时间的指数递减(降解曲线)。在不超过60℃的冷冻干燥温度下，干燥其中试验的基质。该图还特别地显示再水合条件对残余环氧化物活性降低的影响。对于该试验，使胶原材料在被控制的气候条件下，在冷冻干燥之后立即进行再水合。比较如下再水合时期的材料残余活性的降低：

a)24小时，

b)48小时，

c)72小时，和

d)96小时。

在每种情况下，在再水合完成之后立即进行测定。在进行第一次测量之前，仅仅将样本a)贮存在标准环境条件下24小时。从而获得显示如下的测量点：样本a)和b)48小时(2天)之后，样本a)、b)和c)72小时(3天)之后，样本a)、b)、c)和d)96小时(4天)之后，并且所有样本a)至d)为168小时(7天)之后和336小时(14天)之后。

显然，随着再水合时期增加，残余环氧化物活性可以显著更快地耗尽，并降低为不再可检测的水平。

实施例10：

根据制备实施例3的对环氧交联胶原材料的体外细胞毒性试验

(XTT试验)

1.装置和方法

1.1试验材料：

根据制备实施例3的冷冻干燥的环氧交联胶原材料。

1.2.提取物的制备

由试验材料，由3个不同的胶原片材切下相同大小(9.6cm²)的片。在37±1.5℃下，在9.6ml的细胞培养基(RPMI 1640培养基)中在振摇下提取切开的片24小时，所述细胞培养基补充有10％FCS(Gibco，Invitrogen，Ref.No.10270-106)、1mM丙酮酸钠、4mN L-谷氨酰胺和100μg/ml青霉素/链霉素(完全培养基)。以相同的方式，提取阳性和阴性对照。

根据ISO 10993-12，以表面积/体积比为3cm²/ml提取试验材料。

1.3.对照

预先制备较大量阴性和阳性对照的提取物，并贮存在-20℃下。在处理之前立即解冻并稀释100％提取物。以表面积/体积比为6cm²/ml，将阴性和阳性对照提取在根据ISO 10993-12的完全培养基中。

1.3.1阴性对照

RM-C(高密度聚乙烯)

制造商：Hatano Research Institute，Hatano/Japan

批号：C-042

1.3.2阳性对照

名称Latex

供应商：VWR International GmbH(64295Darmstadt，Germany)

批号：03200694110385

1.4试验系统

1.4.1选择细胞系L929的标准

在体外试验中，已经成功地使用了ATCC，CCL 1NCTC克隆929细胞系(L系小鼠结缔组织的克隆)许多年。特别地，对于合适地进行研究所必需的未处理细胞的高增殖速率(倍增时间：16小时，1992年10月22日测量)和良好生存力(通常超过70％)都是支持选择该细胞系的方面。

1.4.2细胞培养

将大量L929细胞系(LMP提供，Darmstadt工业大学，D-64287Darmstadt)贮存在Harlan Cytotest Cell Research GmbH细胞库的液氮中，这允许在实验中重复使用相同细胞培养批次。结果，由于细胞的可再生产特性，确保在实验中维持恒定参数。

在塑料瓶(Greiner，D-72634Frickenhausen)中，在37±1.5℃下使解冻的干细胞培养物扩增，在6ml完全培养基中以约2×10⁵细胞/培养瓶进行培养。将细胞每周传代培养2次。将该细胞培养物温育在37±1.5℃下和5.0±0.5％的二氧化碳气氛中。

1.5试验组

1.5.1培养基对照：完全培养基

1.5.2.阴性对照：RM-C

用完全培养基提取24小时，100％提取物

1.5.3.阳性对照：Latex

用完全培养基提取24小时；3％提取物、10％提取物、30％提取物、70％提取物、100％提取物

1.5.4.试验材料：根据制备实施例3的胶原基质

用完全培养基提取24小时；3％提取物、10％提取物、30％提取物、100％提取物

1.6试验步骤

1.6.1.细胞培养

用不含Ca-Mg的盐溶液冲洗超过50％融合的指数生长的干细胞培养物，并在37±1℃用胰蛋白酶处理5分钟(Gibco BRL胰蛋白酶/EDTA溶液10×目录号35400-019)。然后，通过加入完全培养基终止酶溶解，并制备单细胞悬浮液。

所述不含Ca-Mg的盐溶液具有下述组成(每升)：

将包含约15,000个细胞的0.1ml培养基加入到96-孔细胞培养微量滴定板(Greiner)的各个孔中。所述培养基是完全培养基。

为了使细胞能够粘附，将该板温育24小时。

1.6.2处理

然后，除去培养基，向细胞加入0.1摩尔的处理培养基，该处理培养基包含不同浓度的试验材料提取物、阴性和阳性对照提取物和培养基对照。

所有的温育都是在5.0±0.5％的CO₂气氛中，在潮湿空气中，在37±1.5℃下进行的。

1.6.3XTT标记和测量

在温育时间24小时之后，加入50μl的XTT标记混合物。该该混合物包含XTT标记试剂和电子耦合试剂(体积比1∶100)。将细胞温育约1小时35分钟，然后转移到装有450nm过滤器的微量培养板读数器(

MolecularDevices，D-85737Ismaning)中，进行吸收的测量(参考波长690nm)。

1.7数据记录

记录产生的数据作为原始数据。结果显示为包含具有试验材料的试验组、阴性培养基和对照组的表格的形式。

1.8结果的评价

活细胞的数量减少导致样品中线粒体脱氢酶的总活性降低。该降低与形成的通过吸收测量的橙色甲

的含量直接相关。剂量相关的细胞毒性反应结果可以表示为算术平均数±标准偏差。为了计算对于培养基对照而言吸收降低50％所必需的毒性材料的浓度(XTT₅₀)，使用下式：

${\mathrm{XTT}}_{50}={\mathrm{Conc}.}_{>50}-\frac{({\mathrm{Conc}.}_{>50}-{\mathrm{Conc}}_{<50})\&CenterDot;({\%}_{>50}-50)}{({\%}_{>50}-{\%}_{<50})}$

a)Conc.＞50＝培养基对照＞50％的最大测量浓度％

b)Conc.＜50＝培养基对照＜50％的最小测量浓度％

c)％＞50＝在a)的相对吸收％

d)％＜50＝在b)的相对吸收％

XTT₅₀值越小，试验材料的细胞毒性潜能越高。

活力降低至培养基对照的＜70％和≥50％意味着细胞毒性低。在活力降低至培养基对照的＜50％的情况下，存在细胞毒性潜能。

2.结果

2.1.结果表

在完全培养基中提取24小时之后的结果

指出的吸收显示四舍五入值。使用校正吸收值计算相对吸收。

深色试验组代表试验材料的浓度，在该浓度下，在处理之后的显微镜研究显示了由于发生细胞毒性引起的细胞形态变化。

*7孔的平均吸收(绝对值)

**相对吸收[四舍五入的值]：

因为细胞活力没有以相关的方式降低，不能计算试验材料的XTT₅₀值。

阳性对照的XTT₅₀值：16.3％(v/v)

3.讨论

为了研究根据制备实施例3冷冻干燥的环氧交联胶原材料的细胞毒性潜能，利用XTT试验，使用小鼠细胞系L929进行体外研究。

从三种试验材料中切出相同的试验片(9.6cm²)，如上所述提取该切片。

研究下述浓度的测试提取物：

3％、10％、30％和100％(v/v)

测试下述浓度的提取物(阳性对照)：

3％、10％、30％、70％和100％(v/v)

未观察到培养基对照(完全培养基)和阴性对照(提取的阴性对照RM-C)之间有显著差异。

阳性对照(latex)显示出细胞活力和细胞增殖的显著剂量相关性降低。采用未稀释的参考标准提取物(100％)，得到各个孔中细胞活力和/或细胞增殖的降低为约1.81％。计算的XTT₅₀值为16.3％(v/v)。

在任一个根据制备实施例3的胶原材料的试验提取物中，在温育之后都没能观察到细胞毒性作用。因为细胞活力没有以相关的方式降低，不能计算XTT₅₀值。

4.结果

总之，在描述的实验条件下该试验的上下文中，根据制备实施例3的试验材料的提取物在直至最高试验浓度下也根本没有表现出任何细胞毒性潜能。

实施例11：

根据制备实施例2a和2b的环氧交联胶原材料(5％和10％环氧化物交联剂/干质量)的硬度/弹性模量E的测量(根据Stok等人；J Biomed Mater Res；2009)

根据Stok等人2009，使用具有5N力传感器的材料试验机(Zwick/Roell1456，Ulm)进行加压试验来测量硬度。根据Spilker等人；Journal of BiomechanicalEngineering，series 114，H.2，第191-201页；1992；计算试验模具的合适尺寸；直径为1.38mm。将样本置于微坐标工作台上的夹具里(参见图)，其中将其用PBS层盖住。有机玻璃盖防止样品向上弯曲。

将该模具逐渐移动到样本中至样本厚度的5％、15％和25％，并保持直到该系统松驰。弹性模量根据三次加压步骤的平衡相的最后十个值的平均值确定：

弹性模量[kPa]为应变(x)和应力(y)的斜率

应变＝渗入深度[mm]/样本厚度[mm]

应力＝力[mN]/模具的表面积[mm²]

将样本浸入PBS中至少15分钟，放置到夹具中并静置于此，用PBS层盖住，进行至少5分钟。样品的表面规定为感受器检测到0.1mN抗力的位置。通过测量进行E值的测定，一式三次(n＝3)。

试验装置通过图9中的实施例显示。

结果：

根据制备实施例2a的胶原基质(5％环氧化物)显示出9kPa的硬度。

根据制备实施例2b的胶原基质(10％环氧化物)显示出22kPa的硬度。

未交联的胶原-弹性蛋白基质(脱氢热交联的)显示出仅仅6kPa的硬度。

实施例12：

交联胶原基质的用途

根据本发明的制备实施例1至3的材料特别适合用作美容和药物试剂。

应用实施例12a

作为美容面膜的用途

对于处理，将根据本发明的制备实施例1至3的材料切成期望的形状和待处理的皮肤区域的尺寸，和

a)以干燥态放置到待处理的皮肤上，并用水或活化剂溶液湿润直到饱和来进行再水合，或

b)在放置到皮肤上之前用水或活化剂溶液浸泡直到饱和，然后以再水合态放置到待处理皮肤区域上。

将再水合的胶原敷料置于处理的皮肤区域上约20至30分钟的时间。

在该处理期间，存在的发红或刺激、以及存在的发痒显著减轻，外观更新、皮肤弹性更大和改善了皮肤水合。

应用实施例12b

作为皮下植入物的用途

根据本发明制备实施例1和2的材料可用作整形或重建外科领域中的皮下植入物，目的是重建体积构建，例如在各种原因继发的面中部区域皮肤容积损失的情况，例如用于在肿瘤外科之后或在独立于涉及身体部分的创伤之后需要的鼻整形术以及美学重建手术。

在植入之前，可以将干燥态的材料切开，并相应地适合于皮下区域。

在将基质引入准备的皮袋之前，其必须在大量的无菌生理盐水或林格氏溶液中再水合。在所述基质在无菌生理盐水或林格氏溶液中的再水合完成之后，立即快速地将其插入到准备的皮下皮袋中。根据手术步骤采取伤口闭合，并且这由治疗医生决定。

基质的作用：

在植入时，该基质起支架作用，且使参与构建皮肤组织的细胞向内生长。

在愈合过程期间，迁移的细胞合成自体组织结构，如此在插入的植入物区域提供期望的体积增加。

随着组织新生发展，基质的结构可以完全地被再吸收和重塑。

天然的结构完整的胶原模板最佳地适于促进细胞和血管向内生长；因此，这支持组织再生。在两个不同的组织层之间放置的基质的应用预防性地对抗粘连形成和继发的挛缩。

应用实施例12c

作为皮肤替代(植入物)(急性和慢性伤口)的用途

在烧伤外科手术、整形-重建外科手术和治疗需要移植的愈合性差的伤口(例如慢性伤口)中深层皮肤缺损和全层皮肤伤口的情况下，根据本发明的制备实施例1和2的材料可以与自体分离皮肤(split-skin)移植物联合用于皮肤结构。

应用：

从包装中无菌取出相应材料片，并大致切片以适合皮肤缺损。

然后，将该干燥材料放在伤口上，并首先利用胃布(stomach cloth)将其压入伤口区域中。

该材料被伤口液体浸泡，并粘附到伤口表面，而无形成气囊的风险。将边缘切成保留约2mm窄重叠的圆形。

如果该材料合适地固定在伤口区域，利用注射器小心地施用盐水溶液；可选地，可以施用用盐水溶液浸泡的非常湿的胃布(stomach cloth)，并静置几分钟。在该时间之后，将该材料完全再水合，并根据上述放置精确固定在伤口床中。

在该材料上直接进行分离皮肤到伤口区域的移植。通过缝合或订书机装订实现所述材料与分离皮肤的另外的固定。如果没有用分离皮肤移植物盖住所述基质直到更迟的时间，则应当保证其是未干的。用生理盐溶液浸泡的无菌、非粘附性纱布适于该目的。

为了盖住伤口，推荐使用非闭合性硅氧烷箔或几层无活性成分脂肪纱布以确保湿润伤口环境。迄今，已经发现实际上使用5-6层脂肪纱布和3-4层纱布绷带的组合的致密绷带是有利的。绷带技术应当设计用于确保分离皮肤、所述基质和伤口基底之间良好的接触，且吸收剪切力。对待治疗伤口应用真空绷带由医生对每个具体病例的决定管理。在许多情况下，采用该绷带技术获得了好的结果。

治疗目标是构建新皮肤，以便改善修复皮肤的质量。要减少瘢痕形成和防止伤口挛缩。

应用实施例12d

作为止血剂(急性和外科伤口)的用途

根据本发明的制备实施例1和2的材料可用作局部给药的止血剂，优选在静脉出血和弥漫性出血的手术的情况下，例如内脏外科手术、心胸血管手术、神经外科手术、颌骨外科手术和一般的口腔学、ENT、泌尿科学和妇科医学。

将所述材料优选地以干燥态放在擦洗过的伤口上，并稍微对其塑形，但是其也可以在使用前润湿。在更严重出血的情况下，可以采用湿压进行填塞。给较大伤口提供几片；对于小的区域，可以用剪刀适当地剪切所述材料。

作用方式：

所述材料吸收几倍其自身重量的液体。血小板凝聚在大的内表面，且有助于通过释放凝血因子而局部止血。形成的纤维蛋白将胶原基质锚定在伤口基底并从而形成稳定的伤口闭合。

通过该治疗可以获得快速止血。

应用实施例12e

作为渗出性伤口(慢性伤口)的皮肤/透皮伤口敷料的用途

根据本发明的制备实施例1和2的材料可用作局部相互作用性伤口治疗的伤口敷料。对于最佳作用，应当将该材料直接应用到整个伤口床。在没有或有少量渗出物的伤口中，可以将所述材料用盐水或林格氏溶液再水合。

为了保持湿润的伤口愈合环境，必须用合适的第二个绷带盖住该伤口敷料。在第一次应用之后，根据渗出的程度，应当以直至72小时的间隔再次用所述材料处理伤口。任何非再吸收的基质都可以保持在伤口中。

作用方式：

所述材料能够吸收几倍其自身重量的液体，且因此非常好地适于控制伤口液体。在吸收伤口分泌物时，也可以吸收伤口排出的坏死物、细菌和纤维蛋白覆盖物，作为结果可以辅助和加速肉芽组织的形成。这两者都有助于加速伤口愈合。

应用实施例12f

在真空辅助伤口治疗的治疗法(慢性伤口)中的用途

对于应用，将根据本发明的制备实施例1和2的材料以干燥态应用到待治疗的身体部分或伤口，如有必要，将所述材料切成伤口的形状。然后，将该材料充分浸泡，并用存在的伤口液体或水或水溶液或生理盐水溶液再水合。另外，有可能在将根据本发明的材料应用于待处理的身体部分之前润湿该材料。

然后，采用常规真空密闭的覆盖箔以气密方式将伤口闭合。在应用合适的真空之后，通过利用转移出伤口液体(引流装置)的常规装置的常规真空治疗方法抽取伤口液体。

利用这一治疗，有可能获得伤口表面积减小、伤口边缘挛缩、肉芽组织的形成增强、以及伤口愈合加速。

Claims (15)

1.交联胶原基质的制备方法，包括如下步骤：

a)制备含水胶原悬浮液，

b)将来自步骤a)的胶原悬浮液的pH值调节至pH＜4，

c)任选地加入其它结构形成剂、活性成分和/或辅助物质，

d)加入环氧官能交联剂，步骤c)和d)的顺序是可变的，

e)冷冻从步骤d)可获得的胶原混合物，

f)在冷冻干燥温度＜100℃下，冷冻干燥来自步骤e)的冷冻混合物，

g)任选地调节如此可获得的冷冻干燥的交联胶原材料至水分含量为基于最终产物至多25重量％，和

h)任选地将从步骤g)可获得的材料转化成期望的形式，杀菌和/或加工。

2.根据权利要求1的方法，其中来自步骤a)的胶原悬浮液包含纤维和原纤维形式的天然酸不溶性胶原。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述胶原悬浮液包含酸溶性胶原和肽组分，和/或其中在步骤c)中，加入来自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分的结构形成剂或活性成分。

4.根据权利要求1、2或3的方法，其中所述环氧官能交联剂选自双环氧化物，特别如1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDGE)。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述环氧官能交联剂以基于来自步骤a)的胶原悬浮液的干质量计不超过50重量％的量加入。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中根据步骤e)的冷冻是在由步骤d)制备胶原混合物的24小时之内进行的。

7.通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的交联胶原基质。

8.冷冻干燥的环氧交联胶原基质，其包含未交联的酸溶性胶原和/或肽组分和/或结构形成剂或活性成分，所述结构形成剂或活性成分来自基质蛋白、细胞外基质组分、蛋白源活性成分和可溶性蛋白或肽组分，其是使用时可释放的且利用BCA方法可检测的，优选地其总量为根据BCA方法测量的基于冷冻干燥的胶原基质至少0.1％。

9.根据权利要求7或权利要求8的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，其具有的湿撕裂强度为利用DIN EN ISO 3376测量的＞50cN/mm层厚度，或利用UV8801方法测量的＞200cN/mm层厚度。

10.根据权利要求7至9中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，其包含至少一种其它结构形成剂、至少一种美容或药物活性成分和/或至少一种辅助物质。

11.根据权利要求7至10中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，其为可以任选地整体或部分提供的层状敷料、片材、垫或面膜的形式，其具有选自纤维、非织造布、网状物、膜、或箔或自粘层的其它层，该其它层以其随胶原材料在边缘终止或完全或部分地在边缘凸出胶原材料外的方式应用于所述层状胶原材料。

12.根据权利要求7至11中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，包含：至少一种活性成分，所述活性成分选自用于皮肤处理、治疗皮肤病、伤口治疗或止血的皮肤和透皮活性成分，特别是选自如下的那些活性成分：包括基质蛋白、可溶性肽组分比如特别是弹性蛋白和/或生长因子、抗菌伤口治疗剂比如特别是含银活性成分，特别是硝酸银；和/或至少一种辅助物质，所述辅助物质选自美容油和脂肪，比如特别是甘油三酯或中性油。

13.根据权利要求7至12中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，用作药物试剂，特别地用作治疗急性和/或慢性伤口的试剂、用作植入物、用作皮肤或透皮的皮肤治疗剂、用作止血剂和/或用于真空辅助伤口治疗疗法。

14.根据权利要求7至12中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质作为美容试剂、作为美容敷料或面膜或作为用于细胞群的支架的用途。

15.组合制剂，其包含至少一种根据权利要求7至13中任一项的冷冻干燥的环氧交联胶原基质或通过根据权利要求1至6中任一项的方法可获得的胶原基质，以及至少一种包含一种或多种活性成分和/或任选地一种或多种辅助物质的水溶液，其以相关联的空间排列作为组件或配套组件组合。

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