CN106580718A - 细胞生长因子组合物及其制备方法、美容制剂，以及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了细胞生长因子组合物及其制备方法、美容制剂，以及用途。本发明的细胞生长因子组合物，包含纤维蛋白胶和由壳聚糖微球包覆细胞生长因子所形成的细胞生长因子复合壳聚糖微球，该组合物从结构和功能上模拟激发后的PRP(富血小板血浆)，利用缓释体系延长复合生长因子的作用时间，提高复合生长因子的生物利用度。纤维蛋白胶能更好的附着于创面，提高复合生长因子稳定性。此外，当细胞生长因子组合物添加到美容制剂中，具有创面修复、祛皱抗衰、亮肤紧致的作用。

Description

细胞生长因子组合物及其制备方法、美容制剂，以及用途

技术领域

本发明涉及化妆品以及医学美容的技术领域，具体而言，涉及细胞生长因子组合物及其制备方法、美容制剂，以及用途。

背景技术

富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是将动物或人的全血经过离心后得到的富含高浓度血小板的血浆，在其中加入凝血酶后可变为胶状物，因此也被称为富血小板凝胶或富血小板白细胞凝胶(platelet-leukocyte-enriched gel,PLG)。PRP中含有大量的生长因子。研究发现，PRP未被激活时，其血小板中α颗粒释放的生长因子量较少，而被激活后其生长因子释放量则大大增加，并且激活后的PRP促增殖作用明显强于未激活组。并且随着凝血酶浓度的增加，PRP释放生长因子的量也随之增加。提取制备的缺点。

PRP被激活后，血小板中α颗粒释放的生长因子能通过跨膜受体结合到靶细胞膜的外表面，跨膜受体诱导并激活内源性蛋白信号后，进一步激活细胞内的第二信号，后者能够诱导细胞内多种基因的表达，如基质的形成、胶原蛋白的合成等。另外在血小板的激活过程中，纤维蛋白原转变成的纤维蛋白也能促进创伤组织的愈合，其作用主要表现在参与凝血过程、收缩创面并为细胞的增殖提供三维空间结构等。PRP凝胶是指血小板被激活后释放生长因子的同时，其纤维蛋白原转变为纤维蛋白并连接成网，所形成的乳白色胶状物，其具有一定强度和黏附性。

富血小板血浆具有以下几方面优点：(2)自体的富血小板血浆不可能出现传染病交叉感染或免疫抑制等现象；(3)使用自体血液不存在医学伦理学问题；(4)加速组织的修复与再生，可促进毛细血管的新生；(6)加速慢性创面上皮的形成。即便如此，PRP还是存在着一些亟待解决的问题。

然而，目前还存在以下问题有待解决：①PRP的制备尚无统一标准，需建立一套高效稳定的制备方法，标准化制备的PRP可以为其应用于研究与临床提供可靠的质量保证。②PRP浓度与促组织再生之间的量效与时效关系尚未完全阐明。③PRP中各生长因子的活性、细胞分子生物学机制及相互间的作用尚未完全阐明。④不能长时间起作用，应用在术区后众多生长因子多在第一个小时大量的释放，缺乏中期或长期的效果观察；⑤较快速度溶解，不能起到良好支撑作用；⑥白细胞随之浓缩后的作用及安全性尚不清晰；⑦由于只能使用自体PRP，其应用推广及产业化受到限制，有学者提出同种异体PRP取代自体PRP，这样可以减少病人的二次创伤，但目前来说还是受到异体排斥、交叉传染以及伦理等因素的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明一方面在于提供一种细胞生长因子组合物，该细胞生长因子组合物能较好地对细胞生长因子进行缓释控制。

一种细胞生长因子组合物，其包含纤维蛋白胶和由壳聚糖微球包覆细胞生长因子所形成的细胞生长因子复合壳聚糖微球，所述细胞生长因子复合壳聚糖微球的含量为50～200μg，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

进一步地，所述纤维蛋白胶包含10～50mg纤维蛋白原，50～200IU凝血酶、1～20IU第VIII因子、0.01～0.2M钙离子，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

进一步地，所述细胞生长因子复合壳聚糖微球的直径为0.5～5μm。

进一步地，所述细胞生长因子选自PDGF、VEGF、TGF-β1、EGF和IGF-1中的一种或二种以上；

优选地，所述细胞生长因子包含10～30ng PDGF、0.1～1ng VEGF、10～150ng TGF-β1、0.2～0.5ng EGF和10～50ng IGF-1，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

本发明另一方面在于提供一种细胞生长因子组合物的制备方法，该制备方法所获得的细胞生长因子组合物能较好地对细胞生长因子进行缓释控制。

一种如上述细胞生长因子组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖分散于酸液、表面活性剂和硫酸盐，形成空壳聚糖微球；

(2)将细胞生长因子和所述空壳聚糖微球分散于酸液中，形成细胞生长因子复合壳聚糖微球；

(3)将纤维蛋白胶和所述细胞生长因子复合壳聚糖微球混合。

进一步地，步骤(1)中：

所述酸液为冰醋酸溶液；

优选地，所述酸液的质量分数为1～5wt％；

优选地，所述表面活性剂为吐温-80；

优选地，所述硫酸盐的质量分数为15～25wt％；

优选地，所述分散之后还由先之后依次包括离心分离、用水洗涤干燥。

进一步地，步骤(2)中：

所述酸液为冰醋酸溶液；

优选地，所述酸液的pH为6～6.5；

优选地，所述纤维蛋白胶的浓度为4×10⁵～6×10⁵IU/mL；

优选地，所述分散之后还由先之后依次包括离心分离、用水洗涤干燥。

本发明再一方面在于提供一种美容制剂，该美容制剂可用作创面修复、祛皱抗衰、亮肤紧致。

一种美容制剂，包含如上述细胞生长因子组合物。

进一步地，所述细胞生长因子组合物的含量为0.5～5wt％，优选为1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％；

优选地，所述美容制剂所包含的护肤组分包含水、醇类、油剂、表面活性剂、pH调节剂、抗氧化剂和防腐剂；

优选地，还包含辅料组分，所述辅料组分选自透明质酸、小分子胶原蛋白、类人胶原蛋白中的一种或二种以上；

优选地，所述辅料组分组分的含量为0.01～10wt％，优选为0.1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％。

本发明的细胞生长因子组合物，包含纤维蛋白胶和由壳聚糖微球包覆细胞生长因子所形成的细胞生长因子复合壳聚糖微球，这样可使得细胞生长因子复合壳聚糖微球在受激发时不断地释放出细胞生长因子。于此同时，纤维蛋白胶能较好地凝结。此外，当细胞生长因子组合物添加到美容制剂中，具有创面修复、祛皱抗衰、亮肤紧致的作用。

附图说明

图1为复合生长因子组合物促细胞增殖曲线

图2为本发明实施例1光老化小鼠皮肤创面外观；

图3为本发明实施例1光老化小鼠皮肤创面HE染色；

图4为本发明实施例2复合生长因子结合微针疗法治疗前后图片。

具体实施方式

除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量分数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

本发明的细胞生长因子组合物，其包含纤维蛋白胶和由壳聚糖微球包覆细胞生长因子所形成的细胞生长因子复合壳聚糖微球，所述细胞生长因子复合壳聚糖微球的含量为50～200μg，例如其含量为50μg、55μg、70μg、100μg、120μg、150μg、180μg、190μg或200μg，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

上述术语“壳聚糖微球”是指以壳聚糖为化学成分的微球。这里，微球是指药物分散或被吸附在高分子、聚合物基质中而形成的微粒分散体系。壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。本发明中，壳聚糖微球作为壳层材质，其作为细胞生长因子的缓释载体。

为了提高载体的负载效果，壳聚糖微球的直径较好地为0.5～5μm，如0.5μm、0.52μm、0.55μm、0.6μm、1μm、2μm、2.5μm、4μm、4.5μm或5μm等。

上述纤维蛋白胶又称为纤维蛋白黏合胶、纤黏胶，是指由人血浆制备的纤维蛋白原(含有凝血因子ⅩⅢ、纤维结合蛋白及适量的抑肽酶)和凝血酶浓缩物组成。

作为本发明的纤维蛋白胶可以较好地为10～50mg纤维蛋白原，50～200IU凝血酶、1～20IU第VIII因子、0.01～0.2M钙离子，以纤维蛋白胶的质量为1g计。具体地，每1g纤维蛋白胶中，纤维蛋白原的质量可以为10mg、11mg、15mg、30mg、40mg、45mg、48mg或50mg等；凝血酶的含量可以为50IU、55IU、70IU、90IU、120IU、150IU、180IU、190IU或200IU等；第VIII因子的含量可以为1IU、1.5IU、2IU、5IU、10IU、15IU、18IU或20IU等，此处IU是指国际单位；钙离子的含量为0.01M、0.015M、0.02M、0.06M、0.1M、0.15M、0.18M或0.2M等，此处，M即mol/L。

上述，细胞生长因子没有特别的限定，较好地选自PDGF、VEGF、TGF-β1、EGF和IGF-1中的一种或至少二种。此处，PDGF即血小板衍生生长因子，VEGF即血管内皮生长因子，TGF-β1即转化生长因子-β1，EGF即表皮生长因子，IGF-1即类胰岛素样生长因子-1。

较好地，细胞生长因子可以包含10～30ng PDGF、0.1～1ng VEGF、10～150ng TGF-β1、0.2～0.5ng EGF和10～50ng IGF-1，以细胞生长因子的质量为1g计。具体地，PDGF的含量可为10ng、12ng、15ng、20ng、25ng、28ng、30ng等；VEGF的含量可以为0.1ng、0.15ng、0.2ng、0.5ng、0.8ng、0.9ng或1ng等；TGF-β1的含量可以为10ng、15ng、30ng、60ng、80ng、120ng、140ng、145ng或150ng等；EGF的含量可以为0.2ng、0.25ng、0.3ng、0.35ng、0.4ng、0.45ng、0.45ng等；IGF-1的含量可以为10ng、15ng、25ng、30ng、40ng、45ng或5 0ng等。

需要说明的是，上述细胞生长因子可以采用基因工程方法获得。

本发明的细胞生长因子组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖分散于酸液、表面活性剂和硫酸盐，形成空壳聚糖微球；

(2)将细胞生长因子和所述空壳聚糖微球分散于酸液中，形成细胞生长因子复合壳聚糖微球；

(3)将纤维蛋白胶和所述细胞生长因子复合壳聚糖微球混合。

在上述步骤(1)中，酸液可以列举出本领域常规的酸液，如稀盐酸、稀硫酸等，较好地为冰醋酸溶液。冰醋酸溶液的浓度可以为1～5wt％，如1wt％、1.5wt％、2wt％、4wt％、4.5wt％或5wt％等。

表面活性剂可列举出吐温-80、吐温-60、Span-80、Span-60，优选为吐温-80。

硫酸盐可以为碱金属或碱土金属盐，如硫酸钠、硫酸镁等。硫酸盐的浓度以15～25wt％为佳。

基于较好的分散效果，分散的方式可采用磁力搅拌和超声分散。在分散之后，还包括离心分离、用水洗涤干燥。离心分离的10000～12000r/min，离心的时间可以为12min～17min等。在洗涤之后，还可采用冷冻干燥。

分散过程中加料顺序没有特别严苛的限定，例如可以先将壳聚糖分散于酸液，再加入表面活性剂，而后再加入硫酸盐。

上述步骤(2)中，酸液可以列举出本领域常规的酸液，如稀盐酸、稀硫酸等，较好地为冰醋酸缓冲溶液。至于酸液的浓度较好地为以pH为6～6.5的用量，优选为pH为6.2。为了较好地维持酸液的pH，可以加入公知形式的缓冲盐。

纤维蛋白胶的浓度为4×10⁵～6×10⁵IU/mL，如4×10⁵、4.2×10⁵、4.5×10⁵、5×10⁵、5.5×10⁵、6×10⁵等，较好地为5×10⁵IU/mL。

当然该步骤中的分散的方式可相同于步骤(1)中的分散，在此略述。

在分散之后还由先之后依次包括离心分离、用水洗涤干燥。离心分离的10000～12000r/min，离心的时间可以为12min～17min等。在洗涤之后，还可采用冷冻干燥。

上述步骤(3)中，基于混合的均匀性和细胞生长因子组合物的稳定的分散之考虑，混合的加料顺序可以是，先将细胞生长因子复合壳聚糖微球加入到纤维蛋白原和第VIII因子中混合，再与凝血酶和Ca²⁺混合。

一种美容制剂，包含如上述的细胞生长因子组合物。

作为本发明的细胞生长因子组合物，其含量较好地0.5～5wt％，例如0.5wt％、0.52wt％、0.5 5wt％、1wt％、2wt％、2.7wt％、3.5wt％、4.5wt％、4.8wt％或5wt％等，优选为1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％计。

容易理解的是，美容制剂当然地包含护肤组分。护肤组分包含水、醇类、油剂、表面活性剂、pH调节剂、抗氧化剂和防腐剂。

此处，醇类可列举出乙醇、丙三醇或1,3-丁二醇中或任意组合的具体实例。

此处，油剂为选自脂肪酸类、高级醇、液体石蜡或硅油中的一种或多种。

此处，表面活性剂为选自用于乳化、助溶等的阳离子、阴离子、非离子或两性表面活性剂中的一种或几种。

此处，pH调节剂选自柠檬酸-柠檬酸钠、乳酸-乳酸钠等。

此处，抗氧化剂为选自维生素c、维生素E、核黄素类、烟酸类中的一种或多种。在本发明中，必要成分大多自身具有很强的抗氧化能力，可少加或不添加另外的抗氧化剂。

此处，防腐剂为选自尼泊金类、DMDMH(二羟甲基二甲基乙内酰脲)和IPBC(碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯)等中的一种或多种。本发明中的必要成分大多自身具有很强的抗菌抑菌能力，可减少化学合成防腐剂的添加量。

当然，还可进一步地包含美容制剂常规的其它组分，如色素、抗菌剂、黏度调节剂、清凉剂等。

本发明的美容制剂除了上述细胞生长因子组合物、护肤组分，还可以包含辅料组分。辅料组分选自透明质酸、小分子胶原蛋白、类人胶原蛋白中的一种或二种以上。

辅料组分的含量以0.01～10wt％为宜，例如0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、1wt％、2wt％、5wt％、8wt％、9wt％、9.5wt％或10wt％、，优选为0.1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％。

需要说明的是，本发明的美容制剂不限定形态，例如，但不限于但可以制成乳剂、精华水、凝胶剂以及面膜等的形式。

以上未述及之处适用于现有技术。

实施例1

步骤一、取壳聚糖0.25g溶解于100mL 2％冰醋酸溶液中,搅拌均匀,加入吐温-801.0mL,磁力搅拌和超声处理,滴加20％Na₂SO₄溶液,至上述溶液混浊。通过紫外分光光度计于500nm处测定其浊度来判定微球的形成。微球形成后继续搅拌及超声处理1h，离心分离,取10000～12000r/min,离心15min,将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯化,冷冻干燥,备用。

步骤二、按照PDGF：10ng/ml，VEGF：0.1ng/ml，TGF-β1：10ng/ml，EGF：0.2ng/ml，IGF-1：10ng/ml的配方量将这几种细胞生长因子，混合均匀制备成A溶液。

步骤三、细胞生长因子复合壳聚糖微球的制备：取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25mL醋酸缓冲液中(pH＝6.2)，加入5×10⁵U/mLA溶液1.0mL,4℃下磁力搅拌,10000～12000r/min离心沉淀,将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥。

步骤四、配比纤维蛋白胶的原料：10mg纤维蛋白原，50IU凝血酶、20IU第VIII因子、0.01钙离子。纤维蛋白原和第VIII因子溶于PBS中，混匀得B溶液。

步骤五、将凝血酶和Ca²⁺溶于PBS中，混匀得C溶液。

步骤六、将所制备的复合生长因子缓释微球加入B溶液中，并与C溶液混合均匀即得胶体组合物；其中细胞生长因子复合壳聚糖微球的用量为120μg，以纤维蛋白胶的质量为1g。

实施例2

步骤一、取壳聚糖0.25g溶解于100mL 1％冰醋酸溶液中,搅拌均匀,加入吐温-801.0mL,磁力搅拌和超声处理,滴加15％Na₂SO₄溶液,至上述溶液混浊。通过紫外分光光度计于500nm处测定其浊度来判定微球的形成。微球形成后继续搅拌及超声处理1h，离心分离,取10000～12000r/min,离心15min,将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯化,冷冻干燥,备用。

步骤二、按照PDGF：30ng/ml，VEGF：1ng/ml，TGF-β1：150ng/ml，EGF：0.5ng/ml，IGF-1：50ng/ml的配方量将这几种细胞生长因子，混合均匀制备成A溶液。

步骤三、细胞生长因子复合壳聚糖微球的制备：取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25mL醋酸缓冲液中(pH＝6)，加入6×10⁵U/mLA溶液1.0mL,4℃下磁力搅拌,10000～12000r/min离心沉淀,将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥。

步骤四、配比纤维蛋白胶的原料：50mg纤维蛋白原，200IU凝血酶、1IU第VIII因子、0.01M钙离子。纤维蛋白原和第VIII因子溶于PBS中，混匀得B溶液。

步骤五、将凝血酶和Ca²⁺溶于PBS中，混匀得C溶液。

步骤六、将细胞生长因子复合壳聚糖微球加入B溶液中，并与C溶液混合均匀即得胶体组合物；其中细胞生长因子复合壳聚糖微球的用量为200μg，以纤维蛋白胶的质量为1g。

实施例3

步骤一、取壳聚糖0.25g溶解于100mL 5％冰醋酸溶液中,搅拌均匀,加入吐温-801.0mL,磁力搅拌和超声处理,滴加20％Na₂SO₄溶液,至上述溶液混浊。通过紫外分光光度计于500nm处测定其浊度来判定微球的形成。微球形成后继续搅拌及超声处理1h，离心分离,取10000～12000r/min,离心15min,将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯化,冷冻干燥,备用。

步骤二、按照PDGF：20ng/ml，VEGF：0.5ng/ml，TGF-β1：80ng/ml，EGF：0.35ng/ml，IGF-1：30ng/ml的配方量将这几种细胞生长因子，混合均匀制备成A溶液。

步骤三、细胞生长因子复合壳聚糖微球的制备：取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25mL醋酸缓冲液中(pH＝6.5)，加入3×10⁵U/mLA溶液1.0mL,4℃下磁力搅拌,10000～12000r/min离心沉淀,将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥。

步骤四、配比纤维蛋白胶的原料：50mg纤维蛋白原，200IU凝血酶、10IU第VIII因子、0.1M钙离子。纤维蛋白原和第VIII因子溶于PBS中，混匀得B溶液。

步骤五、将凝血酶和Ca²⁺溶于PBS中，混匀得C溶液。

步骤六、将细胞生长因子复合壳聚糖微球加入B溶液中，并与C溶液混合均匀即得胶体组合物；其中细胞生长因子复合壳聚糖微球的用量为100μg，以纤维蛋白胶的质量为1g。

实施例4

步骤一、取壳聚糖0.25g溶解于100mL 3％冰醋酸溶液中,搅拌均匀,加入吐温-801.0mL,磁力搅拌和超声处理,滴加20％Na₂SO₄溶液,至上述溶液混浊。通过紫外分光光度计于500nm处测定其浊度来判定微球的形成。微球形成后继续搅拌及超声处理1h，离心分离,取10000～12000r/min,离心15min,将所得沉淀物重新悬浮于水中洗涤纯化,冷冻干燥,备用。

步骤二、按照PDGF：20ng/ml，VEGF：0.55ng/ml，TGF-β1：100ng/ml，EGF：0.35ng/ml，IGF-1：30ng/ml的配方量将这几种细胞生长因子，混合均匀制备成A溶液。

步骤三、细胞生长因子复合壳聚糖微球的制备：取10mg冷冻干燥的壳聚糖微球悬浮于25mL醋酸缓冲液中(pH＝6.2)，加入4×10⁵U/mLA溶液1.0mL,4℃下磁力搅拌,10000～12000r/min离心沉淀,将沉淀物重新洗涤纯化、冷冻干燥。

步骤四、配比纤维蛋白胶的原料：30mg纤维蛋白原，125IU凝血酶、10IU第VIII因子、0.1M钙离子。纤维蛋白原和第VIII因子溶于PBS中，混匀得B溶液。

步骤五、将凝血酶和Ca²⁺溶于PBS中，混匀得C溶液。

步骤六、将细胞生长因子复合壳聚糖微球加入B溶液中，并与C溶液混合均匀即得胶体组合物；其中细胞生长因子复合壳聚糖微球的用量为120μg，以纤维蛋白胶的质量为1g。

实施例5

取海藻糖5g，加入约100g磷酸盐缓冲液(pH约6.8)，再加入10mg的实施例1所述的复合生长因子组合物溶液，加磷酸盐缓冲液(pH约6.8)至1000g，即得预冻干溶液。将预冻干溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，分装到3ml的西林瓶中，每瓶1ml，根据现有技术通过通常已知的冷冻干燥方法来实施冷冻干燥。

实施例6

取卡波姆2g，丙二醇4g，对羟基苯甲酸甲酯0.5g，右旋糖苷2g，上述原料混合后呈酸性，为了保证蛋白不变性，加入三乙醇胺1g，调pH值，加水溶解至100g，混合均匀，然后在0.1Mpa，121℃条件下高压灭菌15分钟，冷却至室温，制成基质部分，在基质中实施例1中得到的复合生长因子组合物溶液，同时缓慢搅拌均匀，制成复合生长因子组合物凝胶剂。

实施例7

取800ml注射用水，边搅拌边加入泊洛沙姆200g，在4℃充分溶胀形成溶液，加入甘油50g、乙醇50g和对羟基苯甲酸乙酯2g，混合均匀，然后在0.1Mpa，121℃条件下高压灭菌15分钟，冷却至4℃，制成基质部分，将复合生长因子壳聚糖微球组合物和肝素钠按3:1的比例混合均匀，过滤除菌后加入到灭菌后的凝胶基质中，加入灭菌后注射用水至1000g，缓慢搅拌混合均匀，制成复合生长因子壳聚糖微球组合物温敏型凝胶剂。

评价方法：

1、增殖活性评价

将处于对数生长期的3T3细胞(3T3细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，目录号：GDC030)用含10％FBS(FBS购自杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM培养基(DMEM培养基购自美国Gibco公司)常规培养至80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化，以1×10⁵个/mL的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换无血清DMEM培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入浓度为100、50、25、12.5、6.25μg/mL的实施例1所述的复合生长因子组合物，每个浓度设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养24h，加入10μlMTT(噻唑蓝0.5mg/ml)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入150μl DMSO，振荡后于570nm波长下检测吸光度OD值。增殖率％＝(给药组OD值/空白对照组OD值-1)×100％。结果见表1和图1。

表1.3T3细胞增殖率(％)(n＝3，)

表1和图1的结果显示，本发明的复合生长因子具有促进3T3细胞增殖增殖的作用，且具有浓度依赖性。表明本发明的复合生长因子具有促进细胞增殖、代谢，抑制细胞老化的作用。

2、皮肤光老化损伤修复评价

昆明小鼠(购自广东省医学实验动物中心，6周龄，体重20±0.2g)在自然光暗周期的条件下饲养，自由进水进食。随机分为正常组、模型组、供试组和维生素c阳性药对照组，实验开始时先用剃刀脱毛，暴露背部面积为3×3cm，隔天剃毛一次。除正常组之外其余组用300W OSRAM紫外线固化灯泡照射，光源距离小鼠背部的照射距离为35cm，每天一次，单次照射时间为5min，持续照射15d，15d后各组每天于照射后分别微针给药，每天一次。供试组用微针导入实施例2制备的复合生长因子冻干粉(0.5g/kg体重)，阳性药对照组微针导入维生素C(1g/kg体重)，正常组和模型组则微针导入等量生理盐水。给药周期为8周。8周后对小鼠进行以下操作。

1、皮肤观察：观察并拍摄小鼠皮肤情况，结果见图1。

2、病理切片制备和观察：给药8周后将小鼠处死，取小鼠皮肤组织标本1.0×l.0cm²，经过4％多聚甲醛固定后，苏木精-伊红(HE)染色。并在显微镜下观察。结果见图2和图3。

请参阅图2，图2表明，A为正常组，背部皮肤薄嫩光滑,湿润有光泽，柔韧而富有弹性,皮纹细致,看不见皱纹,无光老化皮肤特征。B为模型组，背部皮肤触感皮肤增厚，弹性下降,活动性皱纹明显，皮肤潮红，干燥伴局部脱屑或结痂。C为供试组，背部皮肤略有增厚，具有一定弹性，皮纹细致，略见皱纹,光老化程度轻微。D为维生素c阳性对照组，与模型组比较皮肤恢复良好，局部皱纹不明显。经过长期紫外线照射小鼠皮肤弹性下降，与正常组其余各组比较皱纹明显增加，衰老加剧。但是经过供试组样品和阳性药作用后的皮肤具有显著改善。这能够证明供试组样品(即实施例1制备的复合生长因子组合物)具有祛皱抗衰的功能。

图3的显微镜下观察的小鼠皮肤组织切片结果表明，A为正常组，小鼠表皮组织结构完整，细胞分层清晰，表皮厚度正常，具有明显的表皮突及真皮乳头，真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分及数量适中；B为模型组，模型组小鼠的表皮层变厚，成纤维细胞数量减少、分布稀疏。真皮组织排列相对紊乱；C为样品组，跟模型组比较，皮肤受损程度较轻，表皮组织结构完整，细胞分层清晰，皮肤厚度较薄，具有表皮突及真皮乳头；真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致，细胞成分及数量适中；D为维生素c阳性对照组，比较接近正常组织。表皮组织结构完整，细胞分层清晰，皮肤厚度正常，具有明显的表皮突及真皮乳头；真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致。这能够证明供试组样品(即实施例2制备的复合生长因子组合物)具有抑制由于紫外线照射所造成的皮肤表皮增厚以及真皮结构的完整，减缓皮肤的衰老速度。

3、人体抗衰功效评价

受试者人数15人，年龄为30～60岁的女性或男性，III或IV型皮肤，具有皱纹、皮肤松弛或皮肤干燥等皮肤衰老现象。无严重系统性疾病以及非过敏性体质。受试部位近三个月没有参与皮肤治疗，美容或是其它皮肤测试。采用微针导入实施例2所述冻干粉试用周期60天，测试采用visia面部皮肤分析仪对受试者进行面部图像分析。结果见图4。图4治疗部位为眉间皱纹，A为治疗前皮肤情况，B为治疗后皮肤情况。治疗前眉间川字纹明显，纹理粗糙。治疗后皱纹平整，纹理细腻，眉间皮肤紧致。

由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅料组分成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞生长因子组合物，其特征在于，其包含纤维蛋白胶和由壳聚糖微球包覆细胞生长因子所形成的细胞生长因子复合壳聚糖微球，所述细胞生长因子复合壳聚糖微球的含量为50～200μg，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

2.根据权利要求1所述的细胞生长因子组合物，其特征在于，所述纤维蛋白胶包含10～50mg纤维蛋白原，50～200IU凝血酶、1～20IU第VIII因子、0.01～0.2M钙离子，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

3.根据权利要求1所述的细胞生长因子组合物，其特征在于，所述细胞生长因子复合壳聚糖微球的直径为0.5～5μm。

4.根据权利要求1所述的细胞生长因子组合物，其特征在于，所述细胞生长因子选自PDGF、VEGF、TGF-β1、EGF和IGF-1中的一种或二种以上；

优选地，所述细胞生长因子包含10～30ng PDGF、0.1～1ng VEGF、10～150ng TGF-β1、0.2～0.5ng EGF和10～50ng IGF-1，以纤维蛋白胶的质量为1g计。

5.一种如权利要求1所述细胞生长因子组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖分散于酸液、表面活性剂和硫酸盐中，形成空壳聚糖微球；

(2)将细胞生长因子和所述空壳聚糖微球分散于酸液中，形成细胞生长因子复合壳聚糖微球；

(3)将纤维蛋白胶和所述细胞生长因子复合壳聚糖微球混合。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：

所述酸液为冰醋酸溶液；

优选地，所述酸液的质量分数为1～5wt％；

优选地，所述表面活性剂为吐温-80；

优选地，所述硫酸盐的质量分数为15～25wt％；

优选地，所述分散之后还由先之后依次包括离心分离、用水洗涤干燥。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中：

所述酸液为冰醋酸溶液；

优选地，所述酸液的pH为6～6.5；

优选地，所述纤维蛋白胶的浓度为4×10⁵～6×10⁵IU/mL；

优选地，所述分散之后还由先之后依次包括离心分离、用水洗涤干燥。

8.一种美容制剂，其特征在于，包含如权利要求1～7任意一项所述的细胞生长因子组合物。

9.根据权利要求8所述的美容制剂，其特征在于，所述细胞生长因子组合物的含量为0.5～5wt％，优选为1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％计；

优选地，所述美容制剂所包含的护肤组分包含水、醇类、油剂、表面活性剂、pH调节剂、抗氧化剂和防腐剂；

优选地，还包含辅料组分，所述辅料组分选自透明质酸、小分子胶原蛋白、类人胶原蛋白中的一种或二种以上；

优选地，所述辅料组分的含量为0.01～10wt％，优选为0.1～5wt％，以美容制剂的总质量为100wt％。

10.一种如权利要求8或9所述美容制剂的用途，其特征在于，其用作创面修复、祛皱抗衰、亮肤紧致。