CN112641996A - 髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法 - Google Patents

髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术与组织工程技术领域，更具体地，本发明涉及髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法。包括：将髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。采用液状细胞支架，可通过注射的方式进行再植入，有效减少了对退变椎间盘的损伤。该细胞支架能够在短时间内由液状变为胶状，能够最大程度的还原髓核细胞的应力微环境，有利于髓核间充质干细胞的增殖、分化及髓核细胞产生细胞外基质。本发明制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架具有好的机械稳定性，髓核间充质干细胞联合壳聚糖可更好的附着于纤维凝胶支架上，进行生长和分化。

Description

髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术与组织工程技术领域，更具体地，本发明涉及髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法。
背景技术
增加髓核细胞的数量和质量的研究在组织工程中具有重要意义，但髓核细胞实际应用于临床，缺乏足够的途径获取足量的髓核细胞，间充质干细胞最早于1968年由德国科学家Frieden Stein在骨髓中发现，随后还发现存在于人体多种组织器官中，并可在体外培养扩增，且能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞在内的多类细胞，还在多种人体重要功能中起重要调节作用。
目前应用较多的是骨髓来源的间充质干细胞，但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：①随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；②制备过程不容易质控；③取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞的应用，使得寻找其他来源的间充质干细胞成为当前面临的一个重要课题。
目前经过研究证明髓核间充质干细胞具有更强的细胞增殖能力，如从退化椎间盘中分离的髓核间充质干细胞具有较强的增殖能力和分化潜能，且在过去的研究中发现单纯植入髓核间充质干细胞被证明是可行且有效的，虽然在具体应用中出现了植入后渗漏和分化缺乏控制等问题，但也为后续的组织工程髓核治疗腰椎间盘突出症打下了坚实的基础。为解决这一系列的问题，研究者们提出了将细胞联合支架植入的治疗方法。可在细胞支架的选择上也并非是一帆风顺的：虽然可注射支架具有传递细胞潜能的作用，但其缺乏所需的机械稳定性；而那些具有较满意的机械性能的支架却也有着因整合不良导致植入材料的挤出或排出等问题。且植入的操作难度及对椎间盘等的损伤大小也是一个不容忽视的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：
将髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
作为本发明一种优选的技术方案，所述相容剂包括纤维蛋白溶液和凝血酶溶液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的质量和相容剂的体积比为5mg：(50～150μL)。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备方法包括：将壳聚糖微球放入髓核间充质干细胞的完全培养基中交联、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球。
作为本发明一种优选的技术方案，所述髓核间充质干细胞的个数为4×106～6×106。
作为本发明一种优选的技术方案，所述壳聚糖微球的制备方法包括：
将表面活性剂和溶剂混合，加入壳聚糖溶液，混合后，加入交联剂搅拌、离心、清洗、冷冻干燥，得到壳聚堂微球。
作为本发明一种优选的技术方案，所述交联剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、氯化钙、三聚磷酸钠、聚磷酸钠中的一种或多种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述纤维凝胶支架的制备方法包括：将纤维蛋白溶液和凝血酶溶液混合，得到纤维凝胶支架。
作为本发明一种优选的技术方案，所述纤维凝胶支架中，纤维蛋白的质量浓度为15～30mg/mL。
本发明第二个方面提供了一种所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)通过使用髓核来源的间充质干细胞，较其他来源的干细胞来说，能够更好地适应髓核特殊的低氧、酸性的环境，对干细胞的增殖分化也更加有利。
(2)本发明采用液状细胞支架，可通过注射的方式进行再植入，有效减少了对退变椎间盘的损伤。
(3)该细胞支架能够在短时间内由液状变为胶状，能够最大程度的还原髓核细胞的应力微环境，有利于髓核间充质干细胞的增殖、分化及髓核细胞产生细胞外基质。
(4)本发明制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架具有好的机械稳定性，髓核间充质干细胞联合壳聚糖可更好的附着于纤维凝胶支架上，进行生长和分化。
(5)本发明提供的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架具有稳定的营养缓释功能，且得到的凝胶支架结构规整、孔隙均匀。
附图说明
图1为退变节段髓核组织的图像。
图2为髓核间充质干细胞的培养过程。
图3为髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的图像。
图4为纤维凝胶支架的图像。
图5为纤维凝胶支架的电镜图。
图6为髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的电镜图。
图7为营养缓释性能测试结果。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
以下通过具体实施方式说明本发明，但不局限于以下给出的具体实施例。
本发明第一个方面提供了一种髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：
将髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球
间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，存在于骨髓、骨骼肌、骨外膜和骨小梁中。间充质干细胞的迁移、定植、增殖与分化，需要从外界获取信息，其分化方向取决于所在的微环境。当前使用较多的干细胞为骨髓来源的间充质干细胞，但是骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：①随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；②制备过程不容易质控；③取材时对人体有损伤，有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓，而且髓核内部的低氧、酸性的环境势必不利于骨髓间充质干细胞的增殖分化。本发明选用髓核来源的间充质干细胞，较其他来源的干细胞来说，能够更好地适应髓核特殊的低氧、酸性的环境，对干细胞的增殖分化也更加有利。且本发明髓核间充质干细胞的来源为腰椎间盘突出症患者的退变髓核，这类患者目前多采取手术治疗，对退变的髓核进行摘除，不会对人体造成任何不良影响；且通过自体细胞原位移植，发生排异反应的可能性将降到最低。
在一种实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞的培养方法包括：将髓核组织加入酶消化后，加入培养基离心，得到的细胞机构过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
本发明髓核间充质干细胞的培养中，消化用的酶可包括胰蛋白酶，胶原酶，如II型胶原酶等，不做具体限定，等到酶消化一段时间，细胞团块基本散开后可加入培养基终止消化，所述MSC培养基为本领域熟知的间充质干细胞培养基，如达科为生物技术股份有限公司的MSC专用基础培养基、上海微科生物技术有限公司的MSC无血清培养基等，并进行离心，得到细胞经过完全培养基重悬培养，得到髓核间充质干细胞。
基础培养基添加血清、抗生素等物质后，叫完全培养基，也叫(血清)细胞培养基。基础培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需添加天然培养基，常用的是牛血清，因为牛血清中含有促细胞增殖的各种生长因子和其他多种有利于细胞生存的物质。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素。本发明不对完全培养基做具体限定，可实现间充质干细胞培养的功能，如联科生物的StemXVivoTM Mesenchymal Stem CellExpansion Media、StemXVivoTM Serum-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivoTMXeno-Free Human MSC Expansion Media、StemXVivo Serum-Free MSC Freezing Media，南京生航生物技术有限公司的10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基等，优选为南京生航生物技术有限公司的10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基。
优选地，本发明所述髓核间充质干细胞的培养包括：无菌条件下获取人退变节段髓核，将髓核组织剪碎并用Ⅱ型胶原酶消化，过滤去除组织残留碎块，离心后再用0.25％胰蛋白酶消化，加入MSC培养基终止消化，再次离心收集细胞，完全培养基重悬细胞，传至第3代备用。其中退变节段髓核组织可通过微创得到，如图1所示，髓核间充质干细胞的培养过程如图2所示。
优选地，本发明所述壳聚糖微球的制备方法包括：
将表面活性剂和溶剂混合，加入壳聚糖溶液，混合后，加入交联剂搅拌、离心、清洗、冷冻干燥，得到壳聚堂微球。
本发明所述表面活性剂为促进壳聚堂溶液和溶剂的乳化、分散，不做具体限定，可列举的有，聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，如吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)，失水山梨醇脂肪酸酯，如司盘20、司盘60、司盘40、司盘80等，在一种优选的实时方式中，所述表面活性剂包括聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯和失水山梨醇脂肪酸酯，体积比为1：(1～4)，可列举的有，1：1、1：2、1：3、1：4。
本发明所用溶剂为油性溶剂，如液体石蜡、白油等，不做具体限定。液体石蜡为熔点在40℃以下的比从C10到C18的各种正构烷烃组成的混合物，白油的主要成分是烷烃、环烷烃和少量的芳烃。本发明所述壳聚糖溶液为壳聚糖-水溶液，优选为1～5wt％壳聚糖-水溶液，可列举的有，1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％。
更优选地，本发明所述交联剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、氯化钙、三聚磷酸钠、聚磷酸钠中的一种或多种，优选为三聚磷酸钠、聚磷酸钠、京尼平中的至少两种，更优选为三聚磷酸钠和京尼平。本发明所述交联剂为交联剂的水溶液，所述交联剂溶液中交联剂的质量百分数为0.5～4wt％。
进一步优选地，本发明所述壳聚糖微球的制备方法包括：取4～8mL表面活性剂加入溶剂至100mL混合后，加入3～8mL1～5wt％壳聚糖溶液，继续搅拌，搅拌至半透明，依次加入0.5～2wt％三聚磷酸钠2～6mL和0.5～2wt％京尼平1～5mL，调节pH值至4.5～5.5，继续搅拌3～7h，当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应，将溶液装入离心管中，调节转速800～1500r/min，离心5～20min后，将上层液体吸出，清洗，得到的颗粒样品冷冻干燥后得到壳聚糖微球。
更进一步优选地，本发明所述壳聚糖微球的制备方法包括：取2mL吐温80，4mL司班80，共同放入烧杯中，加入液体石蜡定容到100mL，放在搅拌机下搅拌均匀，混匀后加入5mL2wt％壳聚糖溶液，继续搅拌，搅拌至半透明，再加入1％三聚磷酸钠4mL，继续搅拌，搅拌至乳白色，最后加入1％京尼平3mL，调节pH值至5，继续搅拌5h；当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应，将溶液装入离心管中，调节转速1000r/min，离心10min；离心后将上层液体吸出，再加入石油醚清洗颗粒，清洗2遍；接着用无水乙醇清洗2遍；最后用PBS清洗2遍；离心后吸去上层液体，将得到的颗粒样品冷冻干燥后得到壳聚糖微球。
在一种优选的实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备方法包括：将壳聚糖微球放入髓核间充质干细胞的完全培养基中交联、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球。
在一种更优选的实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞的个数为4×106～6×106，优选为5×106。
在一种进一步优选的实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备方法包括：将3～8mg壳聚糖微球放入含4×106～6×106髓核间充质干细胞的3～8mL完全培养基中交联2～4h、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球。
在一种更进一步优选的实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备方法包括：将5mg壳聚糖微球放入含5×106髓核间充质干细胞的5mL完全培养基中交联3h、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球。
纤维凝胶支架
本发明纤维蛋白溶液和凝血酶溶液一经接触即在几秒内反应成纤维蛋白凝胶支架。在一种实施方式中，本发明所述纤维凝胶支架的制备方法包括：将纤维蛋白溶液和凝血酶溶液混合，得到纤维凝胶支架。
优选地，本发明所述纤维凝胶支架中，纤维蛋白的质量浓度为15～30mg/mL，可列举的有15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL。本发明所述纤维蛋白溶液和凝血酶溶液的溶剂为生理盐水，本发明所述纤维蛋白溶液的质量百分数优选为30～60mg/mL，可列举的有，30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、55mg/mL、60mg/mL，所述凝血酶溶液的质量百分数优选为10～30U/mL，可列举的有，10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL。
更优选地，本发明所述纤维凝胶支架的制备方法包括：将30～60mg/mL纤维蛋白溶液和10～30U/mL凝血酶溶液在35～40℃混合，得到15～30mg/mL纤维凝胶支架。进一步优选地，本发明所述纤维凝胶支架的制备方法包括：将50mg/mL纤维蛋白溶液和20U/mL凝血酶溶液在37℃中混合，得到25mg/mL纤维凝胶支架。
主剂
在一种实施方式中，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：
将髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
优选地，本发明所述相容剂包括纤维蛋白溶液和凝血酶溶液。本发明所述相容剂中，纤维蛋白溶液和凝血酶溶液的溶剂为生理盐水，本发明所述纤维蛋白溶液的质量百分数优选为30～60mg/mL，可列举的有，30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、55mg/mL、60mg/mL，所述凝血酶溶液的质量百分数优选为10～30U/mL，可列举的有，10U/mL、15U/mL、20U/mL、25U/mL、30U/mL。
更优选地，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的质量和相容剂的体积比为5mg：(50～150μL)可列举的有，5mg：50μL、5mg：60μL、5mg：70μL、5mg：80μL、5mg：90μL、5mg：100μL、5mg：110μL、5mg：120μL、5mg：130μL、5mg：140μL、5mg：150μL。
进一步优选地，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：将3～8mg髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和50～150μL相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
更进一步优选地，本发明所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：将5mg髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球依次和50μL凝血酶溶液、50μL纤维蛋白溶液混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
本发明第二个方面提供一种如上所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
实施例
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本例提供一种髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：
(1)髓核间充质干细胞的培养：无菌条件下获取人退变节段髓核，将髓核组织剪碎并用Ⅱ型胶原酶消化，过滤去除组织残留碎块，离心后再用0.25％胰蛋白酶消化，加入MSC培养基终止消化，再次离心收集细胞，10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬细胞，传至第3代备用；
(2)壳聚糖微球的制备：取2mL吐温80，4mL司班80，共同放入烧杯中，加入液体石蜡定容到100mL，放在搅拌机下搅拌均匀，混匀后加入5mL 2wt％壳聚糖溶液，继续搅拌，搅拌至半透明，再加入1％三聚磷酸钠4mL，继续搅拌，搅拌至乳白色，最后加入1％京尼平3mL，调节pH值至5，继续搅拌5h；当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应，将溶液装入离心管中，调节转速1000r/min，离心10min；离心后将上层液体吸出，再加入石油醚清洗颗粒，清洗2遍；接着用无水乙醇清洗2遍；最后用PBS清洗2遍；离心后吸去上层液体，将得到的颗粒样品冷冻干燥后得到壳聚糖微球；
(3)髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备：将5mg壳聚糖微球放入含5×106髓核间充质干细胞的5mL完全培养基中交联3h、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球；
(4)纤维凝胶支架的制备：将50mg/mL纤维蛋白溶液和20U/mL凝血酶溶液在37℃中混合，得到25mg/mL纤维凝胶支架；
(5)髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备：将5mg髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球依次和50μL20U/mL凝血酶溶液、50μL50 mg/mL纤维蛋白溶液混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
实施例1
本例提供一种髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，包括：
(1)髓核间充质干细胞的培养：无菌条件下获取人退变节段髓核，将髓核组织剪碎并用Ⅱ型胶原酶消化，过滤去除组织残留碎块，离心后再用0.25％胰蛋白酶消化，加入MSC培养基终止消化，再次离心收集细胞，10％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基重悬细胞，传至第3代备用；
(2)壳聚糖微球的制备：取2mL吐温80，4mL司班80，共同放入烧杯中，加入液体石蜡定容到100mL，放在搅拌机下搅拌均匀，混匀后加入5mL 2wt％壳聚糖溶液，继续搅拌，搅拌至半透明，再加入1％三聚磷酸钠4mL，继续搅拌，搅拌至乳白色，最后加入1％京尼平3mL，调节pH值至5，继续搅拌5h；当溶液变成蓝色且杯底有沉淀颗粒时停止反应，将溶液装入离心管中，调节转速1000r/min，离心10min；离心后将上层液体吸出，再加入石油醚清洗颗粒，清洗2遍；接着用无水乙醇清洗2遍；最后用PBS清洗2遍；离心后吸去上层液体，将得到的颗粒样品冷冻干燥后得到壳聚糖微球；
(3)髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备：将5mg壳聚糖微球放入含5×106髓核间充质干细胞的5mL完全培养基中交联3h、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球；
(4)纤维凝胶支架的制备：将50mg/mL纤维蛋白溶液和20U/mL凝血酶溶液在37℃中混合，得到25mg/mL纤维凝胶支架；
(5)髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备：将5mg髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球依次和50μL20U/mL凝血酶溶液、50μL50 mg/mL纤维蛋白溶液混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
性能评价
1、支架结构：将实施例1提供的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法中制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球、纤维凝胶支架外形图和电镜图、髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的电镜图分别如图3、4、5、6所示，可发现纤维凝胶支架结构规整、均匀，且在髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的图6中，可观察到髓核间充质干细胞联合壳聚糖，如图6中标*所示。
2、营养缓释效果：将实施例1提供的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架制备得到的壳聚糖微球、纤维凝胶支架、髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架分别进行营养缓释性能测试：将5mg壳聚糖微球、100μL纤维蛋白支架、100μL复合纤维蛋白支架置入3个2mL的EP管内，然后向EP管中加入1mL的PBS(pH＝7.4)体外缓释液，置于37℃恒温箱内转速为1000r/min的摇床中，取每支EP管中不同时间段(1，6，12h和1，2，4，8，10，12，14d)上清液，每次取样500μL，同时补加等温、同体积的释药介质，即PBS溶液。用ELISA试剂盒测定样品浓度，每个样品重复测定3次，计算其平均值。根据结果，绘制缓释曲线，比较3种样品的缓释效果。如图7所示，可发现复合壳聚糖纤维蛋白支架组较另外两组营养缓释性能更好。
从上述测试结果可知，本发明提供的制备方法可制备得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架具有高的机械性能稳定性和植入相容性，且具有好的营养缓释性能，提供髓核间充质干细胞好的增殖、分化环境。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括：
将髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球和相容剂混合后，放入纤维凝胶支架中，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述相容剂包括纤维蛋白溶液和凝血酶溶液。
3.根据权利要求1所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的质量和相容剂的体积比为5mg：(50～150μL)。
4.根据权利要求1所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球的制备方法包括：将壳聚糖微球放入髓核间充质干细胞的完全培养基中交联、离心、冷冻干燥，得到髓核间充质干细胞联合壳聚糖微球。
5.根据权利要求4所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述髓核间充质干细胞的个数为4×106～6×106。
6.根据权利要求4所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖微球的制备方法包括：
将表面活性剂和溶剂混合，加入壳聚糖溶液，混合后，加入交联剂搅拌、离心、清洗、冷冻干燥，得到壳聚堂微球。
7.根据权利要求6所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自二价阳离子、京尼平、戊二醛、已二酸二酰肼、环氧氯丙烷、碳化二亚胺、氯化钙、三聚磷酸钠、聚磷酸钠中的一种或多种。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述纤维凝胶支架的制备方法包括：将纤维蛋白溶液和凝血酶溶液混合，得到纤维凝胶支架。
9.根据权利要求8所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法，其特征在于，所述纤维凝胶支架中，纤维蛋白的质量浓度为15～30mg/mL。
10.一种根据权利要求1～9任意一项所述的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架的制备方法制备得到的髓核间充质干细胞联合壳聚糖纤维凝胶支架。
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