CN117547554A - 一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法，属于间充质干细胞制剂技术领域，所述制备方法由以下步骤组成：制备多功能载体，制备交联微球，制备外泌体，组合；所述制备多功能载体，由以下步骤组成：制备纤维蛋白原溶液，制备聚赖氨酸溶液，制备三(2‑羧乙基)膦盐酸盐溶液，负载；所述制备交联微球，由以下步骤组成：制备白蛋白‑壳聚糖微球，表面交联；所述组合，将外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶混合后，搅拌，得到间充质干细胞修复制剂；本发明制备的间充质干细胞修复制剂能够提高皮肤修复速度，在长期储存中不易失效，在使用时受微生物影响小。

Description

一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及间充质干细胞制剂技术领域，具体涉及一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞为一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用也最多，与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。当患者接受大剂量化疗后，将间充质干细胞与造血干细胞一同输入，可明显加速患者血细胞恢复时间，且安全无不良反应。
间充质干细胞是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，由于骨髓是其主要来源，因此统称为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具有以下特性：具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性；表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。
由于间充质干细胞所具备的上述特性，间充质干细胞在临床治疗中得到广泛应用，例如将间充质干细胞分化为骨、软骨、肌肉或肌腱，为临床治疗各种创伤提供细胞来源；将间充质干细胞分化为心肌组织，治疗心脏类疾病；将间充质干细胞分化为真皮组织，用于促进皮肤伤口愈合。
此外，间充质干细胞的外泌体在促进皮肤修复中还具有多重好处。第一，间充质干细胞分泌的外泌体能够刺激细胞再生；第二，间充质干细胞的外泌体能够降低受损皮肤的炎症反应，减轻受损皮肤周围组织的炎症程度，从而减少局部皮肤的肿胀和疼痛；第三，间充质干细胞的外泌体还具有免疫调节作用，有助于平衡免疫系统的功能，防止免疫过度活跃导致的瘢痕形成。因此，将间充质干细胞的外泌体制成间充质干细胞修复制剂，是皮肤修复制剂领域的重点研发方向。
但是目前在制备间充质干细胞修复制剂的过程中存在以下问题：间充质干细胞分泌的外泌体中的成分释放速度慢，从而导致使用初期对皮肤修复的提高效果不明显；间充质干细胞的外泌体的耐储存能力差，在长期储存中易失效；间充质干细胞的外泌体在使用时，易受微生物影响，导致间充质干细胞的外泌体的功能受到抑制。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种间充质干细胞修复制剂及其制备方法，制备的间充质干细胞修复制剂能够提高皮肤修复速度，在长期储存中不易失效，在使用时受微生物影响小。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案如下：
一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，由以下步骤组成：制备多功能载体，制备交联微球，制备外泌体，组合；
所述制备多功能载体，由以下步骤组成：制备纤维蛋白原溶液，制备聚赖氨酸溶液，制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，负载；
所述制备纤维蛋白原溶液，将纤维蛋白原加入去离子水中，搅拌均匀，得到纤维蛋白原溶液；
所述制备纤维蛋白原溶液中，纤维蛋白原与去离子水的质量体积比为3-4g:85-90mL；
所述制备聚赖氨酸溶液，将ε-聚赖氨酸加入去离子水中，搅拌均匀，得到聚赖氨酸溶液；
所述制备聚赖氨酸溶液中，ε-聚赖氨酸与去离子水的质量体积比为0.4-0.5g:8-9mL；
所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，将三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水中，搅拌均匀，加入氢氧化钠水溶液调节pH为4.5-5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；
所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液中，三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水的质量体积比为5-5.5g:90-100mL；
所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为10-11%；
所述负载，将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，搅拌均匀，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌，加入二氧化钛纳米管、海藻酸钠，继续搅拌，滴加氯化钙水溶液，滴加结束后继续搅拌，过滤，将滤渣冷冻干燥，得到多功能载体；
所述负载中，所述聚赖氨酸溶液中的ε-聚赖氨酸、所述纤维蛋白原溶液中的纤维蛋白原、所述三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液中的三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐、二氧化钛纳米管、海藻酸钠、氯化钙水溶液的质量体积比为0.4-0.5g:3-4g:5-5.5g:9-10g:5-6g:30-35mL；
所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；
所述氯化钙水溶液的质量浓度为5-6%，滴加速度为4-5g/min；
所述制备交联微球，由以下步骤组成：制备白蛋白-壳聚糖微球，表面交联；
所述制备白蛋白-壳聚糖微球，由以下步骤组成：制备白蛋白分散液，制备羟丙基壳聚糖溶液，混合交联；
所述制备白蛋白分散液，将牛血清白蛋白粉末加入去离子水中，搅拌，加入无水乙醇，继续搅拌，得到白蛋白分散液；
所述制备白蛋白分散液中，牛血清白蛋白粉末、去离子水、无水乙醇的质量体积比为0.25-0.3g:200-250mL:820-850mL；
所述制备羟丙基壳聚糖溶液，将羟丙基壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，得到羟丙基壳聚糖溶液；
所述制备羟丙基壳聚糖溶液中，羟丙基壳聚糖加入去离子水的质量体积比为2.3-2.5g:1000-1100mL；
所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；
所述混合交联，将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，搅拌，离心，冷冻干燥，得到白蛋白-壳聚糖微球；
所述混合交联中，所述白蛋白分散液中的牛血清白蛋白粉末与所述羟丙基壳聚糖溶液中的羟丙基壳聚糖的质量比为0.25-0.3:2.3-2.5；
所述表面交联，将大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸加入去离子水中，搅拌，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌，加入白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌，离心，冷冻干燥，得到交联微球；
所述表面交联中，大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸、去离子水、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、白蛋白-壳聚糖微球的质量体积比为0.35-0.4g:0.5-0.55g:0.65-0.7g:60-65mL:0.38-0.4g:0.2-0.22g:2.8-3g；
所述大分子透明质酸的分子量为180-200万道尔顿；
所述中分子透明质酸的分子量为100-120万道尔顿；
所述小分子透明质酸的分子量为2000-5000道尔顿；
所述制备外泌体，从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红DMEM培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到75-80%时，使用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，然后加入无酚红DMEM培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到90-95%时，对上清液进行离心，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体；
所述组合，将外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶混合后，搅拌，得到间充质干细胞修复制剂；
所述组合中，外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶的质量体积比为100-110mL:1-1.2g:2-2.5g:1.5-2g:0.5-0.6g:1-1.5g:0.1-0.2g。
一种间充质干细胞修复制剂，由前述的制备方法制得。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够提高皮肤修复速度，在用于大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够所有大鼠完全愈合，且无瘢痕；
（2）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够保证在长期储存中不易失效，在2℃下储存180d后再用于大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够保证80%以上的大鼠完全愈合，且无瘢痕；
（3）本发明制备的间充质干细胞修复制剂，能够保证在长期储存中不易失效，在用于受到金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的大鼠皮肤修复中后，在使用后第10天就能够保证80%以上的大鼠完全愈合，且无瘢痕。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现说明本发明的具体实施方式。
实施例1
一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，具体为：
1.制备多功能载体：
将3g纤维蛋白原加入85mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌1h，得到纤维蛋白原溶液；
将0.4gε-聚赖氨酸加入8mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌20min，得到聚赖氨酸溶液；
将5g三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入90mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌20min，加入质量浓度为10%的氢氧化钠水溶液调节pH为4.5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；
将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌20min，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌20min，加入9g二氧化钛纳米管、5g海藻酸钠，继续搅拌2h，滴加30mL质量浓度为5%的氯化钙水溶液，控制滴加速度为4mL/min，滴加结束后继续搅拌1h，过滤，将滤渣置于-50℃下冷冻干燥30h，得到多功能载体；
所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；
2.制备交联微球：
（1）制备白蛋白-壳聚糖微球：将0.25g牛血清白蛋白粉末加入200mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌30min，加入820mL无水乙醇，继续搅拌13h，得到白蛋白分散液；
将2.3g羟丙基壳聚糖加入1000mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌30min，得到羟丙基壳聚糖溶液；
所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；
将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌13-15h，离心，控制离心时的转速为8000rpm，时间为10min，离心结束后将沉淀物置于-50℃下冷冻干燥20h，得到白蛋白-壳聚糖微球；
（2）表面交联：将0.35g大分子透明质酸、0.5g中分子透明质酸、0.65g小分子透明质酸加入60mL去离子水中，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌30min，然后加入0.38g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、0.2g N-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌30min，加入2.8g白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌25min，离心，控制离心时的转速为8000rpm，时间为10min，离心结束后将沉淀物置于-50℃下冷冻干燥30h，得到交联微球；
所述大分子透明质酸的分子量为180万道尔顿；
所述中分子透明质酸的分子量为100万道尔顿；
所述小分子透明质酸的分子量为2000道尔顿；
3.制备外泌体：从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红DMEM培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为37℃，二氧化碳的体积浓度为5%，待生长密度达到75%时，使用PBS缓冲液清洗细胞2次，然后加入无酚红DMEM培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为37℃，二氧化碳的体积浓度为5%，待生长密度达到90%时，对上清液进行离心，控制离心速度为7000rpm，时间为6min，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体；
4.组合：将100mL外泌体、1g多功能载体、2g交联微球、1.5g羧甲基纤维素钠、0.5g聚乙烯醇2488、1g海藻酸钠、0.1g黄原胶混合后，在室温下以100rpm的搅拌速度搅拌40min，得到间充质干细胞修复制剂。
实施例2
一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，具体为：
1.制备多功能载体：
将3.5g纤维蛋白原加入88mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌1.2h，得到纤维蛋白原溶液；
将0.45gε-聚赖氨酸加入8mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌25min，得到聚赖氨酸溶液；
将5.2g三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入95mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌25min，加入质量浓度为10.5%的氢氧化钠水溶液调节pH为4.5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；
将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌25min，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌30min，加入9.5g二氧化钛纳米管、5.5g海藻酸钠，继续搅拌2.5h，滴加32mL质量浓度为5.5%的氯化钙水溶液，控制滴加速度为4.5mL/min，滴加结束后继续搅拌1.2h，过滤，将滤渣置于-45℃下冷冻干燥32h，得到多功能载体；
所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；
2.制备交联微球：
（1）制备白蛋白-壳聚糖微球：将0.28g牛血清白蛋白粉末加入220mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌40min，加入830mL无水乙醇，继续搅拌14h，得到白蛋白分散液；
将2.4g羟丙基壳聚糖加入1050mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌50min，得到羟丙基壳聚糖溶液；
所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；
将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌14h，离心，控制离心时的转速为8500rpm，时间为12min，离心结束后将沉淀物置于-45℃下冷冻干燥22h，得到白蛋白-壳聚糖微球；
（2）表面交联：将0.38g大分子透明质酸、0.52g中分子透明质酸、0.68g小分子透明质酸加入62mL去离子水中，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌40min，然后加入0.39g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、0.21g N-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌40min，加入2.9g白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌28min，离心，控制离心时的转速为8500rpm，时间为12min，离心结束后将沉淀物置于-45℃下冷冻干燥32h，得到交联微球；
所述大分子透明质酸的分子量为190万道尔顿；
所述中分子透明质酸的分子量为110万道尔顿；
所述小分子透明质酸的分子量为3000道尔顿；
3.制备外泌体：从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红DMEM培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为38℃，二氧化碳的体积浓度为5%，待生长密度达到75%时，使用PBS缓冲液清洗细胞2次，然后加入无酚红DMEM培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为38℃，二氧化碳的体积浓度为5.5%，待生长密度达到92%时，对上清液进行离心，控制离心速度为7500rpm，时间为6.5min，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体；
4.组合：将105mL外泌体、1.1g多功能载体、2.2g交联微球、1.8g羧甲基纤维素钠、0.55g聚乙烯醇2488、1.2g海藻酸钠、0.15g黄原胶混合后，在室温下以120rpm的搅拌速度搅拌50min，得到间充质干细胞修复制剂。
实施例3
一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，具体为：
1.制备多功能载体：
将4g纤维蛋白原加入90mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌1.5h，得到纤维蛋白原溶液；
将0.5gε-聚赖氨酸加入9mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌30min，得到聚赖氨酸溶液；
将5.5g三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入100mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌30min，加入质量浓度为11%的氢氧化钠水溶液调节pH为5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；
将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌30min，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌60min，加入10g二氧化钛纳米管、6g海藻酸钠，继续搅拌3h，滴加35mL质量浓度为6%的氯化钙水溶液，控制滴加速度为5mL/min，滴加结束后继续搅拌1.5h，过滤，将滤渣置于-40℃下冷冻干燥35h，得到多功能载体；
所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；
2.制备交联微球：
（1）制备白蛋白-壳聚糖微球：将0.3g牛血清白蛋白粉末加入250mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌60min，加入850mL无水乙醇，继续搅拌15h，得到白蛋白分散液；
将2.5g羟丙基壳聚糖加入1100mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌60min，得到羟丙基壳聚糖溶液；
所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；
将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌15h，离心，控制离心时的转速为9000rpm，时间为15min，离心结束后将沉淀物置于-40℃下冷冻干燥25h，得到白蛋白-壳聚糖微球；
（2）表面交联：将0.4g大分子透明质酸、0.55g中分子透明质酸、0.7g小分子透明质酸加入65mL去离子水中，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌60min，然后加入0.4g 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、0.22g N-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌60min，加入3g白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌30min，离心，控制离心时的转速为9000rpm，时间为15min，离心结束后将沉淀物置于-40℃下冷冻干燥35h，得到交联微球；
所述大分子透明质酸的分子量为200万道尔顿；
所述中分子透明质酸的分子量为120万道尔顿；
所述小分子透明质酸的分子量为5000道尔顿；
3.制备外泌体：从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红DMEM培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为39℃，二氧化碳的体积浓度为6%，待生长密度达到80%时，使用PBS缓冲液清洗细胞3次，然后加入无酚红DMEM培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为39℃，二氧化碳的体积浓度为6%，待生长密度达到95%时，对上清液进行离心，控制离心速度为8000rpm，时间为7min，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体；
4.组合：将110mL外泌体、1.2g多功能载体、2.5g交联微球、2g羧甲基纤维素钠、0.6g聚乙烯醇2488、1.5g海藻酸钠、0.2g黄原胶混合后，在室温下以150rpm的搅拌速度搅拌60min，得到间充质干细胞修复制剂。
对比例1
为了验证多功能载体的效果，将实施例1中的第1步制备多功能载体步骤省略，并在第3步混合步骤中省略多功能载体的加入，其余操作与实施例1相同。
对比例2
为了验证交联微球的效果，将实施例1中的第2步制备交联微球步骤省略，并在第3步混合步骤中省略交联微球的加入，其余操作与实施例1相同。
对比例3
为了验证间充质干细胞的外泌体的效果，将实施例1中的第3步制备外泌体步骤省略，并在第3步混合步骤中省略外泌体的加入，其余操作与实施例1相同。
试验例1
选择35只体重为200-250g的雄性SD大鼠，随机分为7组，每组5只，标为1-7组，分别对每只大鼠进行麻醉后，在无菌环境中，将大鼠背部的毛发脱除，使用直径为10mm的冲孔器在大鼠背部压出一个圆形，然后沿着圆形将皮肤剪去，深度达到筋膜，然后将所有大鼠进行单笼喂养；
分别使用实施例1-3和对比例1-3制备的间充质干细胞修复制剂对1-6组大鼠的伤口处进行涂抹处理，涂抹处理时，保证间充质干细胞修复制剂能够将伤口进行完全填充，然后使用灭菌纱布进行包扎，保证每只大鼠的包扎方式相同；将第7组大鼠作为空白对照，不做任何对比；
然后分别在第5天、第10天、第15天、第20天时观察伤口愈合情况，观察结果如下：
由上述结果可以看出，通过将交联微球加入间充质干细胞修复制剂中，能够提高提高皮肤修复速度；间充质干细胞的外泌体的加入能够提高皮肤修复速度，避免瘢痕的产生；
交联微球为以白蛋白与羟丙基壳聚糖形成的交联物为核，使用超分子透明质酸为壳的交联微球，白蛋白与羟丙基壳聚糖形成的交联物均具有抗菌性，且是多孔结构，能够提高皮肤损伤处的透气性；在交联微球与间充质干细胞的外泌体混合后，交联微球中的以白蛋白与羟丙基壳聚糖形成的交联物及超分子透明质酸还能够对外泌体起到促进释放的作用；将超分子透明质酸包覆至白蛋白与羟丙基壳聚糖形成的交联物表面，能够提高超分子透明质酸的分散性，超分子透明质酸的加入，能够起到保水和填充作用，还能够起到促进伤口愈合和避免炎症发生的作用，因此，交联微球的加入能够提高提高皮肤修复速度。
试验例2
选择35只体重为200-250g的雄性SD大鼠，随机分为7组，每组5只，标为1-7组，分别对每只大鼠进行麻醉后，在无菌环境中，将大鼠背部的毛发脱除，使用直径为10mm的冲孔器在大鼠背部压出一个圆形，然后沿着圆形将皮肤剪去，深度达到筋膜，然后将所有大鼠进行单笼喂养；
分别将在2℃下储存180d后的实施例1-3和对比例1-3制备的间充质干细胞修复制剂对1-6组大鼠的伤口处进行涂抹处理，涂抹处理时，保证间充质干细胞修复制剂能够将伤口进行完全填充，然后使用灭菌纱布进行包扎，保证每只大鼠的包扎方式相同；将第7组大鼠作为空白对照，不做任何对比；
然后分别在第5天、第10天、第15天、第20天时观察伤口愈合情况，观察结果如下：
试验例3
选择35只体重为200-250g的雄性SD大鼠，随机分为7组，每组5只，标为1-7组，分别对每只大鼠进行麻醉后，在无菌环境中，将大鼠背部的毛发脱除，使用直径为10mm的冲孔器在大鼠背部压出一个圆形，然后沿着圆形将皮肤剪去，深度达到筋膜，然后在每个大鼠的伤口处分别滴加100μL浓度为109CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液、100μL浓度为109CFU/mL的白色念珠菌后，将所有大鼠进行单笼喂养；
分别使用实施例1-3和对比例1-3制备的间充质干细胞修复制剂对1-6组大鼠的伤口处进行涂抹处理，涂抹处理时，保证间充质干细胞修复制剂能够将伤口进行完全填充，然后使用灭菌纱布进行包扎，保证每只大鼠的包扎方式相同；将第7组大鼠作为空白对照，不做任何对比；
然后分别在第5天、第10天、第15天、第20天时观察伤口愈合情况，观察结果如下：
由试验例2和试验例3的结果可以看出，多功能载体的加入能够起到提高在长期储存中不易失效，且还能够保证在使用时受微生物影响小；
多功能载体为纤维蛋白原与ε-聚赖氨酸的复合物，然后使用了二氧化钛纳米管进行负载后，通过海藻酸钠凝胶进行包覆；纤维蛋白原能够起到凝血作用，ε-聚赖氨酸能够起到抗菌作用，使用二氧化钛纳米管进行负载是为了能够将纤维蛋白原与ε-聚赖氨酸附着于皮肤表面，避免流失，在将多功能载体与间充质干细胞的外泌体混合后，海藻酸钠凝胶能够对外泌体进行吸附、保护的同时，能够将外泌体固定于皮肤表面，有利于外泌体持续发挥作用；多功能载体中的ε-聚赖氨酸能够避免微生物对外泌体的影响，海藻酸钠凝胶和二氧化钛纳米管能够对外泌体的有效成分进行固定和保护，避免长期储存中外泌体有效成分的失效。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：制备多功能载体，制备交联微球，制备外泌体，组合；
所述制备多功能载体，由以下步骤组成：制备纤维蛋白原溶液，制备聚赖氨酸溶液，制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，负载；
所述制备交联微球，由以下步骤组成：制备白蛋白-壳聚糖微球，表面交联；
所述制备白蛋白-壳聚糖微球，由以下步骤组成：制备白蛋白分散液，制备羟丙基壳聚糖溶液，混合交联；
所述组合，将外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶混合后，搅拌，得到间充质干细胞修复制剂。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述制备纤维蛋白原溶液，将纤维蛋白原加入去离子水中，搅拌均匀，得到纤维蛋白原溶液；
所述制备纤维蛋白原溶液中，纤维蛋白原与去离子水的质量体积比为3-4g:85-90mL；
所述制备聚赖氨酸溶液，将ε-聚赖氨酸加入去离子水中，搅拌均匀，得到聚赖氨酸溶液；
所述制备聚赖氨酸溶液中，ε-聚赖氨酸与去离子水的质量体积比为0.4-0.5g:8-9mL；
所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液，将三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水中，搅拌均匀，加入氢氧化钠水溶液调节pH为4.5-5，得到三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液；
所述制备三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶液中，三(2-羧乙基)膦盐酸盐加入去离子水的质量体积比为5-5.5g:90-100mL；
所述氢氧化钠水溶液的质量浓度为10-11%。
3.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述负载，将聚赖氨酸溶液加入纤维蛋白原溶液中，搅拌均匀，加入三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液，搅拌，加入二氧化钛纳米管、海藻酸钠，继续搅拌，滴加氯化钙水溶液，滴加结束后继续搅拌，过滤，将滤渣冷冻干燥，得到多功能载体；
所述负载中，所述聚赖氨酸溶液中的ε-聚赖氨酸、所述纤维蛋白原溶液中的纤维蛋白原、所述三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐溶液中的三(2-羧乙基)膦溶液盐酸盐、二氧化钛纳米管、海藻酸钠、氯化钙水溶液的质量体积比为0.4-0.5g:3-4g:5-5.5g:9-10g:5-6g:30-35mL；
所述二氧化钛纳米管的外径为15nm，内径为5nm，长度为1μm；
所述氯化钙水溶液的质量浓度为5-6%，滴加速度为4-5g/min。
4.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述制备白蛋白分散液，将牛血清白蛋白粉末加入去离子水中，搅拌，加入无水乙醇，继续搅拌，得到白蛋白分散液；
所述制备白蛋白分散液中，牛血清白蛋白粉末、去离子水、无水乙醇的质量体积比为0.25-0.3g:200-250mL:820-850mL；
所述制备羟丙基壳聚糖溶液，将羟丙基壳聚糖加入去离子水中，搅拌均匀，得到羟丙基壳聚糖溶液；
所述制备羟丙基壳聚糖溶液中，羟丙基壳聚糖加入去离子水的质量体积比为2.3-2.5g:1000-1100mL；
所述羟丙基壳聚糖的脱乙酰度为85%；
所述混合交联，将白蛋白分散液与羟丙基壳聚糖溶液混合后，搅拌，离心，冷冻干燥，得到白蛋白-壳聚糖微球；
所述混合交联中，所述白蛋白分散液中的牛血清白蛋白粉末与所述羟丙基壳聚糖溶液中的羟丙基壳聚糖的质量比为0.25-0.3:2.3-2.5。
5.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述表面交联，将大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸加入去离子水中，搅拌，然后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺，继续搅拌，加入白蛋白-壳聚糖微球，继续搅拌，离心，冷冻干燥，得到交联微球；
所述表面交联中，大分子透明质酸、中分子透明质酸、小分子透明质酸、去离子水、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺、白蛋白-壳聚糖微球的质量体积比为0.35-0.4g:0.5-0.55g:0.65-0.7g:60-65mL:0.38-0.4g:0.2-0.22g:2.8-3g；
所述大分子透明质酸的分子量为180-200万道尔顿；
所述中分子透明质酸的分子量为100-120万道尔顿；
所述小分子透明质酸的分子量为2000-5000道尔顿。
6.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述制备外泌体，从细胞库中挑选具有活性的人胎盘间充质干细胞，使用无酚红DMEM培养基进行一次培养，控制一次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到75-80%时，使用PBS缓冲液清洗细胞2-3次，然后加入无酚红DMEM培养基中进行二次培养，控制二次培养环境中的温度为37-39℃，二氧化碳的体积浓度为5-6%，待生长密度达到90-95%时，对上清液进行离心，然后使用孔径为0.22μm的滤膜对离心得到的上清液进行过滤，得到外泌体。
7.根据权利要求1所述的间充质干细胞修复制剂的制备方法，其特征在于，所述组合中，外泌体、多功能载体、交联微球、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇2488、海藻酸钠、黄原胶的质量体积比为100-110mL:1-1.2g:2-2.5g:1.5-2g:0.5-0.6g:1-1.5g:0.1-0.2g。
8.一种由权利要求1-7任一项所述的制备方法制备的间充质干细胞修复制剂。
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