CN113350295B - 一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法及其应用，包括：合成甲基丙烯酸酯‑κ‑卡拉胶，配制成溶液，与光引发剂混合作为流动相，在电场条件下，流动相液体在毛细管口分裂为微液滴；使用油性溶液作为收集相，在毛细管口下方收集微液滴，使用紫外灯照射微液滴，形成固化微粒，将固化微粒通过无水乙醇、磷酸缓冲液交替清洗，经冷冻干燥后得到多孔结构微粒；将多孔结构微粒置于生物活性药物溶液中浸泡，得到负载生物活性药物的载体微粒。本发明借助微流控技术，实现MA‑κ‑Ca多孔结构载药微粒的快速高效、高均一性制备，实现生物活性药物的负载和持续性温和释放，可应用于多种创面修复，如治疗糖尿病患者被细菌感染的创面等慢性难愈合创面。

Description

一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于在生物医用材料技术领域，具体涉及一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法及其应用。

背景技术

微流控电喷雾技术是一种先进的技术，通过微管道精确控制微流体的单分散性、大小和结构，因而广泛地应用于生物分析、药物递送和细胞包封等领域，用于不同的医疗目的。通过微流体技术产生的单液相乳液被用作形成单分散多孔水凝胶颗粒，可以一次性实现多孔结构载药微粒的批量生产。这项技术已经广泛用来负载药物，制备生物医学粒子、显微载药胶囊等。然而，这种方法很少被用于制造负载生物活性药物的微粒以达到促进伤口愈合的目的。

常见的药物载体多采用人工合成或者天然的材料制备，这些生物材料通常被用作基底膜，与创面形状的吻合性较差，透气性能差。此外，基底膜通常由人工材料制成，合成常需要复杂的化学工程步骤。一些研究也表明，很多开发合成的生物材料未能在足够的治疗期内保护如血管内皮生长因子(VEGF)等生物活性药物的活性。而天然材料如壳聚糖和透明质酸等常有力学性能差、溶胀和降解特性不可控等缺陷。因此，开发与创面吻合良好、生物相容性好、保水性能好、药物持续性温和释放、机械性能较好的新型生物材料仍有较好的前景。

药物缓释是指药物缓慢非恒速的释放，用阻滞释放的材料包裹药物以达到缓释的作用。与相应普通制剂比较，给药频率减少，且能显著增加患者的顺应性，降低药物的副作用。生长因子和抗菌肽等是在生物体中发现的生物活性分子，已被用作生物活性药物使用，抗菌肽有优良的广谱抗菌特性，且不易引起细菌抗性，而血管内皮生长因子可以促进细胞增殖、组织生成和组织重塑。生物活性药物往往由于直接暴露于环境中而发生失水失活，使用负载生物活性药物的材料对创面修复在创面治疗中十分有效，这点尤其体现在治疗糖尿病患者身上易被细菌感染的慢性难愈合伤口等方面。基于此，本发明提供一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法来制备具有良好生物相容性和较好机械性能的载体微粒。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，所制备的载体微球具有长期维持药物活性和持续性温和释放特性，可以作为优良的生物活性药物缓释载体；

本发明的第二目的是提供负载生物活性药物的载体微粒的制备方法在制备创面修复药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，包括以下步骤：

S1、将κ-卡拉胶（κ-Ca）与甲基丙烯酸酐反应合成甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶（MA-κ-Ca）；

S2、将S1所制备的甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶配置成溶液，与光引发剂混合形成混合溶液，作为微流控电喷雾装置内的流动相，在设置的电场条件下，流动相液体在毛细管口分裂为微液滴；

S3、使用油性溶液作为收集相，在S1中毛细管口下方收集微液滴，使用紫外灯照射微液滴，形成固化微粒，将固化微粒通过无水乙醇、磷酸缓冲液（PBS）交替清洗，经冷冻干燥后得到多孔结构微粒；

S4、将S2制备的多孔结构微粒置于生物活性药物溶液中浸泡，即可得到负载生物活性药物的载体微粒。

进一步的，S1中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶（MA-κ-Ca）的合成方法为：

S1.1、将κ-Ca与去离子水(diH2O)混合配置成κ-Ca溶液；

S1.2、将甲基丙烯酸酐加入κ-Ca溶液中，在50 ℃下反应6 h，并使用NaOH溶液定期调整反应溶液的pH值，使其保持为8.0；

S1.3、将反应后的溶液转移到透析袋(MWCO 14 kDa)，以去除游离的甲基丙烯酸酐，纯化后的MA-κ-Ca溶液在-80 ℃下冷冻干燥，获得的粉末在-20 ℃避光保存。

进一步的，κ-Ca溶液中，κ-Ca的质量体积浓度为1％；S1.2中，甲基丙烯酸酐与κ-Ca溶液的体积比为1:10。

进一步的，S2中，所述流动相中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶的质量体积浓度为2~10％。

进一步的，S2中，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮，流动相中，2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮的体积浓度为1%；微流控电喷雾装置的参数为：电场强度为4~10 kV，流动相液体流速为20~300 μL/min。

进一步的，S3中，所述收集相为葵花籽油或甲基硅油；收集相与毛细管口之间的收集距离为2~8 cm；所述紫外灯的功率为100 W，紫外光波长为365 nm，照射固化时间为1~10分钟。

进一步的，S3中，所述多孔结构微粒的粒径为100~1000 μm。

进一步的，S4中，所述生物活性药物为生长因子或者抗菌肽。

本发明还提供以上所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法在制备创面修复药物中的应用，具体的，可应用于糖尿病引发的细菌感染慢性难愈合创面的修复。

采用上述技术方案的积极效果：

（1）本发明所制备的负载生物活性药物的载体微粒具有良好的单分散性，可以完美贴合创面，而不影响伤口的透气性；

（2）本发明以微流控电喷雾技术为基础生产多孔结构载体微粒，方法简单、高效、操作方便、易学，且微球的大小和形态可控，经甲基丙烯酸酐修饰，在紫外线照射下产生了具有增强机械强度的生物相容性水凝胶；

（3）本发明使用的载体微粒可以同时负载多种生物活性药物，可以长期保持生物活性药物的生物活性并可实现其持续性温和释放，且拥有良好的生物相容性。

附图说明

图1：（a）本发明用于负载生物活性药物的载体微粒制备的单液相微流控电喷雾装置结构示意图，（b）本发明所制备的负载生物活性药物的载体微粒结构示意图；

图2：本发明实施例1所制备的多孔结构微粒的光学显微镜照片、尺寸分布范围和单个载体微粒的扫描电子显微镜图像；

图3：负载生物活性药物的多孔结构微粒的药物释放与时间的关系曲线图；

图4：载体微粒的生物相容性检测图；

图5：接受血管内皮生长因子和抗菌肽载药微粒治疗的大鼠和不接受治疗的大鼠的背部创面愈合情况随时间的变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1——多孔结构微粒的制备

本实施例提供了一种多孔结构微粒的制备方法，包括以下步骤：

S1、合成甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶（MA-κ-Ca），MA-κ-Ca是通过κ-卡拉胶（κ-Ca）与甲基丙烯酸酐反应合成的。首先将κ-Ca以1% (w/v)的比例与去离子水(diH2O)混合，在50 ℃下搅拌，直到固体完全溶解；将10 mL甲基丙烯酸酐加入100 mL的κ-Ca溶液中，在50 ℃下反应6 h，使用5.0 mol/mL NaOH溶液定期调整反应的pH值，使其保持为8.0；然后，将溶液转移到透析袋(MWCO 14 kDa)以去除游离的甲基丙烯酸酐，纯化后的MA-κ-Ca溶液在-80 ℃下冷冻干燥，获得的粉末在-20 ℃避光保存；

S2、搭载好微流控电喷雾装置后，称取S1所制备的MA-κ-Ca，配制浓度为5%（W/V）的MA-κ-Ca溶液，并加入相对于MA-κ-Ca溶液体积1%（V/V）的光引发剂，作为微流控系统的流动相，在电场条件下，流动相液体在毛细管口分裂为微液滴；

S3、以葵花籽油作为收集相，调整电场电压为4 kV, 收集距离5 cm，流动相流速为50 μL/min；打开微流控电喷装置之后，用葵花籽油在S1中毛细管口下方收集微液滴，持续收集5分钟后，打开紫外光灯照射微液滴，形成固化微粒；随后，将固化微粒用无水乙醇和磷酸缓冲液（PBS）交替清洗数次后冷冻干燥后得到多孔结构微粒，保存在-20℃下。多孔结构微粒结构如图2所示。

实施例2——多孔结构微粒的制备

本实施例2与实施例1制备方法大致相同，不同之处在于：

微流控系统的流动相中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶的质量体积浓度为2％。

实施例3——多孔结构微粒的制备

本实施例3与实施例1制备方法大致相同，不同之处在于：

微流控系统的流动相中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶的质量体积浓度为3％。

实施例4——负载生物活性药物的载体微粒的制备方法

取实施例1中所制备的多孔结构微粒，置于血管内皮生长因子和抗菌肽的混合溶液中浸泡24小时，生物活性药物经毛细现象被多孔结构微粒吸收进入微粒内部，与载体微粒发生静电吸附或形成氢键而被负载，即可得到负载生物活性药物的载体微粒。

试验例1——多孔结构微粒的生物活性药物缓释

本试验例的应用材料为实施例1~3中制备的多孔结构微粒。

将牛血清白蛋白-异硫氰酸荧光素（BSA-FITC）作为大分子蛋白类药物的模式药物，分别将一毫克实施例1~3中制备的多孔结构微粒置于BSA-FITC溶液中浸泡24小时以实现负载生物活性药物；

收集上述负载生物活性药物的微粒，温育到1 mL PBS（pH7 .4）溶液中，并以300r/min的速度在37℃下以预定的时间间隔摇动，每次取出100 μL PBS用于测定浓度，并在37℃下补充等量的PBS溶液，用酶标仪检测取出的PBS溶液的荧光强度以计算释放的蛋白质类药物的释放量，测量结果如图3所示。

从图3可以看出，本发明所制备的多孔结构微粒具有良好的生物药物活性缓释功能，并且随着甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶浓度的升高，生物活性药物的缓释曲线逐渐变缓，与相应普通制剂比较，给药频率减少，且能显著增加患者的顺应性，降低药物的副作用。

试验例2——多孔结构微粒的生物相容性测试

本试验例分为试验组和空白对照组。

试验组：将实施例1中制备的多孔结构微粒与细胞共同培养；

空白对照组：细胞单独培养。

具体操作方法：将NIH 3T3细胞接种于48孔板（每孔1 × 10⁵个细胞），与试验组中所制备的多孔结构微粒孵育3天。孔中加入50 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2 -基)-2,5-二苯基四溴唑(MTT)溶液孵育4 h，然后去除培养液，加入1000 μL二甲基亚砜(DMSO)，使形成的甲瓒晶体完全溶解。使用酶标仪记录每孔的吸光度，并以相对于第一天空白组的活细胞数量的百分比表示实验组的细胞活力。

测试结果如图4所示，其中其中，图a为细胞在第一天的荧光染色图像，图b为细胞在第二天的荧光染色图像，图c为细胞在第三天的荧光染色图像，图d为第一、二、三天试验组多孔结构微粒与细胞共同培养，细胞的存活率。

从图4可以看出，本发明所制备的多孔结构微粒具有良好的生物相容性。

试验例3——负载血管内皮生长因子和抗菌肽的载体微粒对于大鼠创面修复效果的试验

本试验例的应用材料为实施例4中制备的负载血管内皮生长因子和抗菌肽的载体微粒。

在大鼠背部制造直径为1厘米的圆形创面，并随机等分为两组。其中一组不做任何处理作为对照组，另一组接受实施例4中制备的负载血管内皮生长因子和抗菌肽的载体微粒的治疗，作为试验组。

接受试验组治疗的具体操作为：首先，使用喷枪将载体微粒均匀喷涂于伤口表面，记录第0、3、5、7、9天创面的恢复情况，如图5所示，可见接受负载血管内皮生长因子和抗菌肽的载体微粒治疗的大鼠恢复情况远远好于不做处理的大鼠。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将κ-卡拉胶与甲基丙烯酸酐反应合成甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶；

S2、将S1所制备的甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶配置成溶液，与光引发剂混合形成混合溶液，作为微流控电喷雾装置内的流动相，在设置的电场条件下，流动相液体在毛细管口分裂为微液滴；

S3、使用油性溶液作为收集相，在S1中毛细管口下方收集微液滴，使用紫外灯照射微液滴，形成固化微粒，将固化微粒通过无水乙醇、磷酸缓冲液交替清洗，经冷冻干燥后得到多孔结构微粒；

S4、将S2制备的多孔结构微粒置于生物活性药物溶液中浸泡，即可得到负载生物活性药物的载体微粒，所述生物活性药物为生长因子或者抗菌肽。

2.根据权利要求1所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S1中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶的合成方法为：

S1.1、将κ-卡拉胶与去离子水混合配置成κ-卡拉胶溶液；

S1.2、将甲基丙烯酸酐加入κ-卡拉胶溶液中，在50 ℃下反应6 h，并使用NaOH溶液定期调整反应溶液的pH值，使其保持为8.0；

S1.3、将反应后的溶液转移到透析袋，以去除游离的甲基丙烯酸酐，纯化后的甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶溶液在-80 ℃下冷冻干燥，获得的粉末在-20 ℃避光保存。

3.根据权利要求2所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S1.1中，κ-卡拉胶溶液中，κ-卡拉胶的质量体积浓度为1％；S1.2中，甲基丙烯酸酐与κ-卡拉胶溶液的体积比为1:10。

4.根据权利要求1所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S2中，所述流动相中，甲基丙烯酸酯-κ-卡拉胶的质量体积浓度为2~10％。

5.根据权利要求1所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S2中，所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮，流动相中，2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮的体积浓度为1%；微流控电喷雾装置的参数为：电场强度为4~10 kV，流动相液体流速为20~300 μL/min。

6.根据权利要求1所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S3中，所述收集相为葵花籽油或甲基硅油；收集相与毛细管口之间的收集距离为2~8 cm；所述紫外灯的功率为100 W，紫外光波长为365 nm，照射固化时间为1~10分钟。

7.根据权利要求1所述的负载生物活性药物的载体微粒的制备方法，其特征在于，S3中，所述多孔结构微粒的粒径为100~1000 μm。

8.权利要求1-7任一项所述制备方法所制备的负载生物活性药物的载体微粒在制备创面修复药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述创面为糖尿病引发的细菌感染慢性创面。

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