CN111632037A - 一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法和应用 - Google Patents

一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种海藻酸钠‑壳聚糖微球，海藻酸钠‑壳聚糖微球的制备方法包括以下步骤：(1)将海藻酸钠加入到生理盐水中，充分搅拌，形成质量浓度为1‑3％的海藻酸钠溶液；(2)将壳聚糖加入到浓度为5‑60％的乙酸溶液中，充分溶解，形成质量浓度为1‑3％的壳聚糖溶液；(3)将壳聚糖溶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌溶解，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；(4)使用喷雾干燥技术将壳聚糖/海藻酸钠分散液制成微球，即得微球；(5)将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联、洗涤、干燥，即得；本发明提供的海藻酸钠‑壳聚糖微球具有以下技术效果：(1)方法简单高效，易于批量生产；(2)本发明制备的微球粒径均匀可控，分散性好，具有良好的生物相容性。

Description

一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法 和应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法和应用。
背景技术
肺损伤是由多种化学、物理和生物等因素引起的肺部炎症、纤维化等,进而影响肺功能的一类疾病,严重的威胁着人类健康，在治疗肺损伤过程中，直接肺部给药，既能起到局部作用，也能起全身作用，而且吸收迅速，起效快，对身体其他部位副作用小，如今，生物降解的聚合物微球作为肺部给药载体得到广泛关注，气化微球在肺内沉积使药物能够缓慢释放，并且避免药物被酶水解。
间充质干细胞，是研究最为广泛，应用潜能最大的一类干细胞，具有向成骨、成软骨、成脂肪分化的潜能，同时还具有免疫调节和免疫抑制能力，可结合造血干细胞辅助移植治疗血液系统疾病，用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，以及各种自身免疫性疾病的治疗、术后保健等，间充质干细胞增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，有望成为最具临床应用前景的多能干细胞，干细胞治疗研究在不同肺损伤的多种动物模型中广泛开展，显示出利用干细胞治疗肺损伤的良好前景，然而，如何将干细胞直接运送到肺部是一个很大的挑战。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种海藻酸钠-壳聚糖微球、其包被的干细胞及其制剂、制法和应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种海藻酸钠-壳聚糖微球，该海藻酸钠-壳聚糖微球的直径为5-50μm，所述海藻酸钠-壳聚糖微球的制备方法包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠加入到生理盐水中，充分搅拌，形成质量浓度为1-3％的海藻酸钠溶液；
(2)将壳聚糖加入到浓度为5-60％的乙酸溶液中，充分溶解，形成质量浓度为1-3％的壳聚糖溶液；
(3)将壳聚糖溶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌溶解，所述壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液的体积比1:5-4:1，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；
(4)使用喷雾干燥技术将壳聚糖/海藻酸钠分散液制成微球，即得微球；
(5)将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联2-12h，所述微球在所述海藻酸钠溶液中的浓度为0.1-0.3g/ml，将交联后的微球洗涤、干燥，即得海藻酸钠-壳聚糖微球。
本发明通过先将壳聚糖与海藻酸钠制备成微球，再将该微球浸泡于海藻酸钠溶液中交联，使制得的微球表面更加均匀。
进一步地，步骤(1)所述的海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％。
进一步地，步骤(2)所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2％。
进一步地，步骤(3)所述的搅拌溶解时的搅拌速度为50-300rpm。
进一步地，步骤(4)所述的喷雾干燥的条件如下：进风温度为120-180℃，出风温度为50-80℃，进料速度为5-10mL/min。
本发明还提供了海藻酸钠-壳聚糖微球在制备包裹间充质干细胞的保护剂中的应用。
本发明还体用了海藻酸钠-壳聚糖微球在制备干细胞制剂的微球载体中的应用。
本发明还提供了海藻酸钠-壳聚糖微球在制备维持干细胞活性及多能性的产品中的应用。
本发明还提供了一种由海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞，该干细胞的制备方法包括以下步骤：
称量海藻酸钠-壳聚糖微球0.2-0.5g放入10-30ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，海藻酸钠-壳聚糖微球在培养基中的浓度为7-50g/L，将干细胞以密度1×106/mL-3×106/mL接种至上述微球上，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养5-7天。
本发明还提供了一种由干细胞制备的喷雾系统，该喷雾系统是将喷雾仪器与给药气管管路连接，所述给药气管管路的直径为2mm，长度为20-25cm，PU材质，所述给药气管管路的一端有微孔，另一端连接喷雾仪，喷雾仪里装入含有海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞的溶液，即得喷雾系统。
本发明通过雾化器的喷嘴将以上溶液全体雾化成小滴(50um-8mm水微滴)，与给药气管管路连接，管路另一端通过患者声门下给药，雾化器里装入5ml海藻酸钠-壳聚糖微球的溶液，打开喷雾开关，将喷出的携带有干细胞微球的气体，经口缓慢吸入，经以上方法可将剂量的70-90％吸入到肺部，本发明制备的海藻酸钠-壳聚糖微球能够通过喷雾的方式，利用海藻酸钠-壳聚糖微球作为载体运送到肺部，细胞存活率高，通过调节免疫炎症反应治疗肺损伤。
本发明提供的海藻酸钠-壳聚糖微球具有以下技术效果：(1)方法简单高效，易于批量生产，将海藻酸钠-壳聚糖分散液配制好后，可直接使用喷雾干燥技术大批量制备海藻酸钠-壳聚糖微球，一次性可以获得数十克海藻酸钠-壳聚糖微球；(2)本发明制备的微球粒径均匀可控，分散性好，具有良好的生物相容性，可以直接作为干细胞保护剂，接种干细胞后可应用于肺损伤的治疗。
具体实施方式
实施例1海藻酸钠-壳聚糖微球
本实施例提供了一种海藻酸钠-壳聚糖微球，该微球的制备方法包括以下步骤：
(1)将1g海藻酸钠加入到100g生理盐水中，充分搅拌5h，形成质量浓度为1％的海藻酸钠溶液；
(2)将1g壳聚糖加入到100g浓度为5％的乙酸水溶液中，充分溶解1h，形成质量浓度为1％的壳聚糖溶液；
(3)将10ml壳聚糖溶液加入到50ml海藻酸钠溶液中，以50rpm的速度搅拌，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；
(4)将壳聚糖/海藻酸钠分散液通过喷雾干燥技术制得微球；喷雾干燥条件为：进风温度120℃，出风温度为50℃，进料速度为5mL/min；
(5)将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联2h，所述微球在所述海藻酸钠溶液中的浓度为0.1g/ml，将交联后的微球洗涤、干燥，即得海藻酸钠-壳聚糖微球，本实施例所制得的微球重量为8克。
实施例2海藻酸钠-壳聚糖微球
本实施例提供了一种海藻酸钠-壳聚糖微球，该微球的制备方法包括以下步骤：
(1)将2g海藻酸钠加入到100g生理盐水中，搅拌5h，形成质量浓度为2％的海藻酸钠溶液；
(2)将2g壳聚糖加入到100g浓度为30％的乙酸水溶液中，搅拌1h，形成质量浓度为2％的壳聚糖溶液；
(3)将50ml壳聚糖溶液加入到50ml海藻酸钠溶液中，以185rpm的速度搅拌，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；
(4)将壳聚糖/海藻酸钠分散液通过喷雾干燥技术制得微球喷雾干燥条件为：进风温度150℃，出风温度为65℃，进料速度为7mL/min；
(5)收集微球，将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联7h，所述微球在所述海藻酸钠溶液中的浓度为0.2g/ml，将交联后的微球洗涤、干燥，即得海藻酸钠-壳聚糖微球，本实施例所制得的微球重量为15克。
实施例3海藻酸钠-壳聚糖微球
本实施例提供了一种海藻酸钠-壳聚糖微球，该微球的制备方法包括以下步骤：
(1)将3g海藻酸钠加入到100g生理盐水中，搅拌5h，形成质量浓度为3％的海藻酸钠溶液；
(2)将3g壳聚糖溶液加入到100g浓度为60％的乙酸水溶液中，搅拌1h，形成质量浓度为2％的壳聚糖溶液；
(3)将80ml壳聚糖加入到20ml海藻酸钠溶液中，以300rpm的速度搅拌，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；
(4)将壳聚糖/海藻酸钠分散液通过喷雾干燥技术制得微球喷雾干燥条件为：进风温度180℃，出风温度为80℃，进料速度为10mL/min；
(5)将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联12h，所述微球在所述海藻酸钠溶液中的浓度为0.3g/ml，将交联后的微球洗涤、干燥，即得海藻酸钠-壳聚糖微球，本实施例所制得的微球重量为20克。
实施例4
本实施例提供了一种由海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞，该干细胞的包被方法如下：
称量实施例2制备的海藻酸钠-壳聚糖微球0.2g放入10ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，将脐带间充质干细胞以密度1×106/mL接种至上述培养基，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养5天。
实施例5
本实施例提供了一种由海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞，该干细胞的包被方法如下：
称量实施例2制备的海藻酸钠-壳聚糖微球0.35g放入20ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，将脐带间充质干细胞以密度2×106/mL接种至上述培养基，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养6天。
实施例6
本实施例提供了一种由海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞，该干细胞的包被方法如下：
称量实施例2制备的海藻酸钠-壳聚糖微球0.5g放入30ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，将脐带间充质干细胞以密度3×106/mL接种至上述培养基，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养7天。
对照例1
本对照例提供了一种干细胞，该干细胞的包被方法如下：
称量无铜点击交联多聚糖微球0.5g放入30ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，将脐带间充质干细胞以密度3×106/mL接种至上述微球上，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养7天；
其中，无铜点击交联多聚糖微球的制备方法如下：
(1)室温下将0.12克壳聚糖和0.12克1-羟基苯并三唑溶于100毫升水中；
(2)室温下将0.8克环辛炔-3-乙醇酸溶于100毫升四氢呋喃/水(体积比1:3)的混合溶剂中；
(3)室温下将(1)和(2)所得两种溶液充分混合，加入0.25克二异丙基乙胺，在0℃条件下搅拌反应13小时，透析2.5天后冻干，得到环辛炔化壳聚糖；
(4)室温下将0.2克海藻酸钠和0.4克水溶性碳化二亚胺溶于100毫升水中，再加入0.5毫升11-叠氮-3,6,9-三乙醚-1-胺，室温搅拌反应25小时，透析2.5天后冻干，得到叠氮化海藻酸钠；
(5)分别配制质量浓度为1.0％的环辛炔化壳聚糖水溶液和叠氮化海藻酸钠水溶液，室温下各取2.5毫升等体积充分混合，再将该混合溶液加于40毫升含有乳化剂司班80的石蜡油中，其中司班80的体积3毫升，超声乳化3分钟得乳化液；
(6)将乳化液以1100rpm搅拌挥发过夜，然后将乳液倒入异丙醇中析出微球，随后用异丙醇、正己烷和丙酮分别清洗，最后冻干得到交联多聚糖微球。
试验例1
使用取实施例4-6和对照例1的方法制备干细胞作为试验1-3组和阳性对照组，将脐带间充质干细胞放置于以下培养基和培养调节下培养7天作为对照组，培养基为DF12:FBS＝9:1，添加EGF30ng/mL，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，分别在培养2、4、6天后通过CCK8染色检测各组干细胞的存活率，在培养第6天通过钙黄素AM-PI染色方法检测各组干细胞的存活率；
(1)通过CCK8染色检测细胞的存活率，CCK8染色的具体步骤为：取微球中生长的细胞制成单细胞悬液，每孔按4×103个细胞接种至96孔板中，设置3个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，每孔加入新鲜配制的含10μl的毒性检测液CCK8，置于培养箱中继续培养4h后，用酶标仪测波长为450nm的OD值。实验重复3次，取平均值作为最终实验结果，试验结果见表1。
表1.各组干细胞存活率测试结果.
Figure BDA0002460156720000091
由表1可知，实施例4-6组的干细胞在第2天，第4天和第6天细胞存活率分别高于80％、85％和90％，而阳性对照组在第2天，第4天和第6天细胞存活率分别为76％、79％、83％，说明本发明制备的海藻酸钠-壳聚糖微球具有很好的生物相容性；
(2)通过钙黄素AM-PI染色检测细胞的存活率，AM-PI染色的具体步骤为：收集在海藻酸钠-壳聚糖微球中生长的细胞，加入PBS制成单细胞悬液，将200μl细胞悬液移至小试管中，加入100μlCalcein-AM(2μmol/l)和PI(4μmol/l)染色溶液，在37℃下孵育15分钟，在荧光显微镜下，分别用490nm和545nm波长激发，观察活死细胞，试验结果为：在海藻酸钠-壳聚糖微球上生长的细胞保持良好的生物活性，培养6天后，细胞存活率高达90％以上，对照组的细胞存活率为76％，阳性对照组的细胞存活率为81％；
(3)诱导成骨分化试验方法：将接种在实施例4-6和阳性对照组的微球上的脂肪间充质干细胞进行传代培养，取第2代细胞进行诱导,诱导所用培养基的成分如下：在DF12培养基中添加成骨诱导剂地塞米松(0.02μM)、β-磷酸甘油钠(11mM)、2-磷酸抗坏血酸(55μM)和1,25-(OH)2VitD3(12mM)，培养条件为：37℃，5％CO2孵箱中，通过以下指标鉴定诱导细胞的成骨特性：碱性磷酸酶(AKP)定量检测，免疫荧光化学检测骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、Ⅰ型胶原表达，AlizarnRed染色检测钙结节形成，RT-PCR检测AKP和OPN表达；
试验结果为，免疫荧光检测OCN、OPN及Ⅰ型胶原表达阳性，AlizarnRed染色可见钙结节形成，RT-PCR检测诱导组AKP和OPN表达阳性，第2代脂肪干细胞诱导后AKP表达自第3天起各个检测点(第3、7、14、21天)的检测数值见表2：
表2.不同检测点AKP的表达结果.
Figure BDA0002460156720000101
由试验结果可知，诱导组与对照组差异皆具有统计学意义(P＜0.05)，本发明制备的海藻酸钠-壳聚糖微球能够维持脂肪间充质干细胞的活性，并能够维持细胞的干性，在成骨诱导剂的作用下，微球上收获的脂肪间充质干细胞能够分化为成骨细胞。
综上，仅为本发明之较佳实施例，不以此限定本发明的保护范围，凡依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆为本发明专利涵盖的范围之内。

Claims (10)

1.一种海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于，所述海藻酸钠-壳聚糖微球的直径为5-50μm，所述海藻酸钠-壳聚糖微球的制备方法包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠加入到生理盐水中，充分搅拌，形成质量浓度为1-3％的海藻酸钠溶液；
(2)将壳聚糖加入到浓度为5-60％的乙酸溶液中，充分溶解，形成质量浓度为1-3％的壳聚糖溶液；
(3)将壳聚糖溶液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌溶解，所述壳聚糖溶液与海藻酸钠溶液的体积比1:5-4:1，形成壳聚糖/海藻酸钠分散液；
(4)使用喷雾干燥技术将壳聚糖/海藻酸钠分散液制成微球，即得微球；
(5)将微球浸泡于浓度为0.1％的海藻酸钠溶液中交联2-12h，所述微球在所述海藻酸钠溶液中的浓度为0.1-0.3g/ml，将交联后的微球洗涤、干燥，即得海藻酸钠-壳聚糖微球。
2.如权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于，步骤(1)所述的海藻酸钠溶液中海藻酸钠的质量浓度为2％。
3.如权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于，步骤(2)所述的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量浓度为2％。
4.如权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于，步骤(3)所述的搅拌溶解时的搅拌速度为50-300rpm。
5.如权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球，其特征在于，步骤(4)所述的喷雾干燥的条件如下：进风温度为120-180℃，出风温度为50-80℃，进料速度为5-10mL/min。
6.权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球在制备包裹间充质干细胞的保护剂中的应用。
7.权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球在制备干细胞制剂的微球载体中的应用。
8.权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球在制备维持干细胞活性及多能性的产品中的应用。
9.一种由权利要求1所述的海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞，其特征在于，所述干细胞的制备方法包括以下步骤：
称量海藻酸钠-壳聚糖微球0.2-0.5g放入10-30ml添加10％胎牛血清的DMEM培养基中，海藻酸钠-壳聚糖微球在培养基中的浓度为7-50g/L，将干细胞以密度1×106/mL-3×106/mL接种至上述微球上，置于37℃，5％CO2孵箱中培养，隔天换液一次，第5天消化细胞后离心，添加10％胎牛血清的DMEM培养基，放置于孵箱中，在37℃，5％CO2条件下培养5-7天。
10.一种由权利要求9所述的干细胞制备的喷雾系统，其特征在于，所述喷雾系统是将喷雾仪器与给药气管管路连接，所述给药气管管路的直径为2mm，长度为20-25cm，PU材质，所述给药气管管路的一端有微孔，另一端连接喷雾仪，喷雾仪里装入含有海藻酸钠-壳聚糖微球包被的干细胞的溶液，即得喷雾系统。
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