CN104257631A

CN104257631A - 一种磁性载体微囊化干细胞及其制备方法

Info

Publication number: CN104257631A
Application number: CN201410519201.2A
Authority: CN
Inventors: 周萱
Original assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Current assignee: JIANGSU STEM CELL OSDBIO Co Ltd
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2015-01-07

Abstract

本发明公开了一种磁性载体微囊化干细胞及其制备方法，一种磁性载体微囊化干细胞，包括功能性干细胞和包裹功能性干细胞的含有磁性物质的半透膜功能的小球囊组成，所述的磁性物质为亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒，所述的半透膜功能的小球囊是由壳聚糖和海藻酸钠制备而成。磁性载体微囊化干细胞可用于干细胞的异体移植治疗或靶向移植治疗，收集的磁性载体微囊化的干细胞经静脉或动脉移植至宿主体内，然后在外加磁场的作用下使干细胞高效率地定位至病变部位发挥作用，同时可利用磁性载体四氧化三铁纳米粒用作磁共振成像造影剂检测治疗效果。本发明有助于将干细胞疗法转化为有效的临床应用治疗。

Description

一种磁性载体微囊化干细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种磁性载体微囊化干细胞及其制备方法，属于生物化工和干细胞生物技术领域。

背景技术

随着对干细胞研究的深入，干细胞移植（stem cell transplantation，SCT）让人们看到新的希望，并取得不少进展。基础研究显示，干细胞具有分化为多种细胞的潜能，干细胞移植具有促进细胞因子分泌、改善微循环、对抗凋亡等作用。用干细胞技术来治疗各种组织损伤性疾病为克服传统治疗的不足提供了一种新的技术手段。近十年来细胞治疗发展迅速，国内外已有大量干细胞移植治疗终末期肝病、心肌梗死、扩张型心肌病、心功能衰竭、血液病、糖尿病、糖尿病足、进行性老年性痴呆、帕金森病等顽固重症的临床报道。因此，许多研究者致力于通过细胞移植来修复受损组织及功能，促进微循环建立，减少截肢或器官移植，改善患者预后。干细胞应用于疾病的治疗得到了越来越多研究的证实，基础研究及临床试验已取得令人鼓舞的研究成果。

干细胞移植常用的途径是静脉移植，其优点是创伤小、容易被患者所接受，经静脉移植避免损伤肌体组织，且可以通过反复多次移植来弥补到达病灶区干细胞少之不足。但经静脉进行干细胞移植的不利因素在于从外周静脉进入病灶区需经长时迁移，最后进入病灶内的细胞数量十分有限，从而影响移植效率。从理论上来讲，大量的移植细胞没有进入所希望治疗的病灶区域，而是在血液循环中消耗掉了，加大移植细胞的数量的话，理论上可能有足够数量的干细胞进入病灶区域发挥作用，但同时会使治疗成本升高。

其他途径有动脉移植、局部种植、腰穿途径和介入途径等，相比静脉移植风险较高，如立体定向颅内注射移植和脊髓局部注射移植等，但在一定程度上增加了细胞到达病灶区域的数量。以上几种干细胞移植途径均有优劣，移植途径受局部组织条件、安全性、技术水平等因素限制，我们应该在各种方法基础上进一步完善和改进。在干细胞移植时，使用创伤小、容易被患者所接受的移植方法，同时使干细胞高效率地进入病灶区域发挥作用，降低治疗成本，减少移植次数，达到最好的治疗效果。

在干细胞移植中，免疫排斥反应是一项重要的障碍，移植物与受体的组织相容性问题是临床医生欲成功进行细胞移植时不得不面对的主要问题。因此，解决异体移植的免疫排斥反应是干细胞治疗中的难点。

干细胞疗法在机体生长、发育及器官组织修复过程中已经表现出巨大的潜力，在临床应用上发展前景也十分广阔，因此，解决干细胞特别是异体干细胞在移植过程中的免疫排斥反应，同时使干细胞高效率地进入病灶区域发挥作用的问题很有必要，这将有助于将干细胞疗法转化为有效的临床应用治疗。

发明内容

本发明公开了一种磁性载体微囊化干细胞及其制备方法，磁性载体微囊化干细胞是利用含有磁性物质的半透膜功能的小球囊，将功能性干细胞包裹于此球囊内而成，可用于干细胞的异体移植治疗或靶向移植治疗，收集的磁性载体微囊化的干细胞经静脉或动脉移植至宿主体内，然后在外加磁场的作用下定位至病变部位发挥作用，同时可利用磁性载体可用作磁共振成像造影剂检测治疗效果。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种磁性载体微囊化干细胞，包括功能性干细胞和包裹功能性干细胞的含有磁性物质的半透膜功能的小球囊组成，所述的磁性物质为亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒，所述的半透膜功能的小球囊是由壳聚糖和海藻酸钠制备而成。

进一步的，所述的功能性干细胞包括可进行临床研究应用的干细胞，尤其是用于异体移植的干细胞。

进一步的，所述的一种磁性载体微囊化干细胞的移植注射时间是成囊后第4天。

进一步的，所述的一种磁性载体微囊化干细胞具有磁响应性，可在外加磁场作用下进行定位。

进一步的，所述的一种磁性载体微囊化干细胞可利用四氧化三铁纳米粒特性，具有造影成像功能。

一种磁性载体微囊化干细胞的制备方法，由下述步骤组成：

（1）制备无菌海藻酸钠、壳聚糖溶液：分别制备1.5%的海藻酸钠溶液和0.5%的壳聚糖溶液，然后使用于0.22μm滤膜过滤除菌备用；

（2）制备干细胞悬液：收集常规培养好的功能性干细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，再用PBS溶液制成浓度不小于10⁷个/ml的单细胞悬液；

（3）海藻酸钙微球的制备：称取经高压灭菌后的亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒与海藻酸钠溶液充分混合，使四氧化三铁纳米粒与海藻酸钠溶液的混合比例为2mg/mL，然后将干细胞以10⁶/mL的密度混入海藻酸钠溶液，在高频脉冲微胶囊成型仪通过静电法滴入质量浓度为1.1%氯化钙溶液中成囊，得到固定化干细胞的并含有磁性物质的海藻酸钙微球；

（4）将海藻酸钙微球置于壳聚糖溶液中成膜，按海藻酸钙凝胶珠与成膜溶液体积比为1:5~1:10进行成膜反应；再以质量浓度为3%的柠檬酸钠溶液中和成膜后的海藻酸钙微球即制备成磁性载体微囊化的干细胞。

本发明的有益效果是：

（1）本发明方法取材方便，方法简单，具有的选择性生物半透膜能保护干细胞免受各种免疫反应的干扰，并且抵抗外来的机械力及摩擦力等，给干细胞的生长提供了良好的生存微环境，可有利于干细胞的体外制备和提高干细胞移植后的生存期。

（2）本发明利用亲水性高分子材料与细胞混匀，在细胞移植后可以阻遏免疫细胞以及引起免疫排斥反应的大分子抗体，有效地避免异体移植过程中的免疫排斥反应。

（3）本发明制备的磁性载体微囊化干细胞通过通过体内移植后，在外加磁场的作用下定位至病变部位，大量聚集到达病变部位，增加到达病灶部位干细胞的浓度，直接作用于并修复病灶区病变细胞、组织和器官，发挥细胞移植效果，减少细胞移植次数，降低患者治疗成本。

（4）本发明在干细胞制备过程中加入了亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒，结合现代造影技术，可以实现干细胞治疗的靶向定位并能跟踪检测到干细胞的动态情况。

（5）本发明制备的微囊化干细胞，可以使移植的干细胞具有缓释性、控释型，制备的干细胞具有良好的物理性能、生物稳定性、适宜的渗透性、良好的组织相容性，无毒副作用，不会引起机体移植排斥反应。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是Fe3O4纳米粒电镜投射图；

图2是材料对细胞活性影响实验结果图；

图3是磁性载体微囊化的干细胞图，参照标尺为200μm；

图4是磁性载体微囊化的干细胞的磁响应性对比图。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

具体实施例1 亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒的制备

称取2.3gFeCl₃·6H₂O、0.25g铁粉溶于15g月桂胺、30mL正己烷与7mL油酸组成的混合溶剂中，混合均匀后投入高压釜180℃反应24h。反应完成后，将产物冷却至室温，乙醇清洗除去杂质，制得Fe₃O₄纳米粒。称取0.24g Fe₃O₄纳米粒溶于由25mL环己烷、17.5mL叔丁醇和15mL 5% K₂CO₃水溶液所组成的混合溶液中，搅拌20min，加入10mL Lemieux-von Rudloff试剂(0.09%KMnO₄、2.25%NaIO₄水溶液)，磁力搅拌，水浴40℃反应48h。所得产物加入丙酮超声分散，离心收集沉淀，真空干燥，即制得亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒，呈规则六边形，粒径分布在20~50 nm之间，粒径均一，如图1所示，经氧化亲水修饰后可在水相中均匀分布，在磁场作用下具备顺磁性性质，能够由磁场进行定向驱动。

具体实施例2 材料对细胞活性影响实验

1.细胞活性影响实验步骤如下:取以对数生长期的人骨髓干细胞，以0.25%胰酶消化、计数、接种于接种于96孔培养板，每孔加入100μl的细胞悬液，浓度为1×10⁴个/ml，每组重复接种5个孔，在空白对照孔加入培养基100μl，在96孔板的四周加PBS液100μl，以保持96孔板的湿度。在37℃恒温箱中培养，细胞贴壁后更换加入了相应浓度材料的培养基培养。培养48h后，每孔加入10μl的CCK-8染色试剂，在37℃恒温箱中继续孵育4h后，用酶标仪450nm波长检测各组的OD值，并取其5个孔的平均值。

2.检测结果：亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒不同浓度培养48h后对人骨髓干细胞活率影响的结果如图2A所示：亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒浓度低于2mg/mL时，细胞活率均大于90%；浓度为4mg/mL时，细胞活率在70%左右。壳聚糖不同浓度培养48h后对人骨髓干细胞活率影响的结果如图2B所示：壳聚糖浓度低于2.5mg/mL时，细胞活率均大于95%；浓度为5mg/mL时，细胞活率在65%左右。

具体实施例3 磁性载体微囊化干细胞的制备

1.磁性载体微囊化干细胞的制备步骤如下：

（1）制备无菌海藻酸钠、壳聚糖溶液：称取1.5g海藻酸钠，溶于100mL生理盐水中，搅拌1h，制备海藻酸钠溶液；称取1g壳聚糖，溶于200mL醋酸–醋酸钠缓冲溶液，搅拌1h，用2mol/L氢氧化钠调节溶液pH至6.0，制备壳聚糖溶液；均使用于0.22μm滤膜过滤除菌备用；

（2）制备干细胞悬液：收集常规培养好的功能性干细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，再用PBS溶液制成浓度为1×10⁷个/ml的单细胞悬液；

（3）海藻酸钙微球的制备：称取10mg经高压灭菌后的亲水性顺磁性物质四氧化三铁纳米粒与5mL海藻酸钠溶液充分混合，将干细胞以10⁶/mL的密度混入海藻酸钠溶液，在高频脉冲微胶囊成型仪(电压60、频率90、脉冲06)通过静电法滴入质量浓度为1.1%氯化钙溶液中成囊，得到固定化干细胞的并含有磁性物质的海藻酸钙微球；

2.磁性载体微囊化的干细胞形态表征：

在显微镜下，干细胞微胶囊呈球形、大小均一、直径在250~300μm之间，壁厚约5μm，微胶囊内所装载的干细胞分布均匀、生长状态良好、微胶囊囊壁完整，如图3所示。

具体实施例4 磁性载体微囊化干细胞的注射时间

将微囊置于37℃、5%CO₂培养箱中，每日于倒置荧光显微镜下观察微囊。微囊破裂时间的定义是大于10%微囊破裂的时间，于微囊破裂时间前2~3d注射为理想注射时间，微囊破裂时间为5~7d，所以微囊注射时间为成囊后第4天。

具体实施例5 磁性载体微囊化干细胞的磁响应性测试

实验方法：按具体实施例3方法制成非磁性载体微囊化干细胞和磁性载体微囊化干细胞。分别悬浮于1000mLpH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使溶液以2.0mL/min的速度流经一石英比色池，分别在有、无磁场作用下，用紫外-可见分光光度计检测比色池中透光度变化来判断微球的磁响应性。

实验结果：检测比色池中溶液透光率随时间的变化以考察微球的磁响应性和靶向给药能力，结果见图4。在无外界磁场作用时，溶液的透光率基本不变，当有磁场作用时，溶液的透光率明显降低，约2h后达到一定值，说明比色池中包药磁性微球的浓度达到最大，明显高于其它部位。可见壳聚糖包药磁性微球的磁响应性较强，作为靶向给药的载体是可行的。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种磁性载体微囊化干细胞，其特征在于，包括功能性干细胞和包裹功能性干细胞的含有磁性物质的半透膜功能的小球囊组成，所述的磁性物质为亲水性顺磁四氧化三铁纳米粒，所述的半透膜功能的小球囊是由壳聚糖和海藻酸钠制备而成。

2.根据权利要求1所述的一种磁性载体微囊化干细胞，其特征在于，所述的功能性干细胞包括可进行临床研究应用的干细胞，尤其是用于异体移植的干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种磁性载体微囊化干细胞，其特征在于，所述的一种磁性载体微囊化干细胞的移植注射时间是成囊后第4天。

4.根据权利要求1所述的一种磁性载体微囊化干细胞，其特征在于，所述的一种磁性载体微囊化干细胞具有磁响应性，可在外加磁场作用下进行定位。

5.根据权利要求1所述的一种磁性载体微囊化干细胞，其特征在于，所述的一种磁性载体微囊化干细胞可利用四氧化三铁纳米粒特性，具有造影成像功能。

6.一种磁性载体微囊化干细胞的制备方法，其特征在于，由下述步骤组成：

（4）将海藻酸钙微球置于壳聚糖溶液中成膜,按海藻酸钙凝胶珠与成膜溶液体积比为1:5~1:10进行成膜反应；再以质量浓度为3%的柠檬酸钠溶液中和成膜后的海藻酸钙微球即制备成磁性载体微囊化的干细胞。