CN109432434A - 一种靶向复合外泌体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种靶向复合外泌体及其制备方法，属于医药技术领域。所述方法包括如下步骤：1)采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体；2)将膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液混合，在2～6℃下进行电穿孔处理后，在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。本发明制备得到的外泌体具有较高的主动靶向能力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种靶向复合外泌体及其制备方法。
背景技术
外泌体是由细胞的质膜经两次向内凹陷形成多泡体，再与细胞内膜融合，以胞吐的方式释放出来的直径在30-150nm的微囊泡。已被证明几乎所有的人体细胞均可分泌不同性质的外泌体，且广泛分布于各种体液。外泌体作为载体可携带治疗药物或生物活性物质到达病灶，发挥治疗作用。外泌体作为药物载体与传统的人工纳米载体相比，其优势在于：(1)免疫原性低，几乎不会引起免疫反应，更加安全；(2)体积很小，纳米级别的粒径，包载能力强，可以逃过网状内皮系统的捕捉，有效保护承载的药物；(3)具有较强的组织渗透性和穿透生理屏障的能力，能穿过血脑屏障。通过与目标细胞膜融合的方式，将药物释放到细胞质中。(4)外泌体负载药物后可以绕开P-糖蛋白，会显著降低药物进入细胞后的外排作用。
外泌体作为载体虽然有很多优点，但也有限制其应用的不足之处，比如：外泌体缺乏对肿瘤细胞或炎细胞的主动靶向能力，虽然纳米级的载体可以利用异常细胞的高通透性和滞留效应到达病灶部位，但是大多数载体需要通过主动靶向来提高病灶部位的摄取。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种靶向复合外泌体及其制备方法，能够提高外泌体的主动靶向能力。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种载有药物和纳米材料的外泌体及其制备方法，包括如下步骤：
1)采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体；
2)将所述步骤1)的膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液混合，在2～6℃下进行电穿孔处理后，将得到的靶向复合外泌体初体在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。
优选的，所述步骤1)中靶向修饰的方法包括以下步骤：
a、将PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，调整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震荡50～70min，得到第一反应体系；
所述PBS、NHS和4-戊炔酸的质量体积比为1mL:35mg:29mg；
b、将所述步骤a的第一反应体系与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，在2～6℃下震荡50～70min，得到第二反应体系；所述第二反应体系中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的终浓度为0.3mol/L；
c、将所述步骤b的第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液混合后，依次进行震荡、超滤，得到膜连接炔键的外泌体；
所述第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液的体积比为2：75；
d、在所述步骤c的膜连接炔键的外泌体中依次加入PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽，在20～25℃充氮振荡2.5～3.5h，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体。
优选的，所述步骤c中含有外泌体的PBS溶液中外泌体的质量与PBS溶液的体积比为16μg:15μL。
优选的，所述步骤c中震荡的时间为22～26h，震荡时的温度为18～22℃。
优选的，所述步骤c中超滤用膜的分子截留量为100KDa。
优选的，所述步骤d中膜连接炔键的外泌体、PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽的质量体积比为150～170μg：290～310μL：13～15μL：70～72uL：32～34μL：0.19～0.21mg。
优选的，所述步骤2)中膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液的质量体积比为900～1100μg：2900～3100μg：90～110μg：1～1.1mL。
优选的，所述步骤2)中电穿孔缓冲溶液为50mmol/L的海藻糖PBS溶液。
优选的，所述步骤2)中所述电穿孔处理的电压为390～410v，所述电穿孔处理的电容为140～160μF，所述电穿孔处理的放电时间为0.9～1.1ms。
本发明提供了一种上述方法制备得到的靶向复合外泌体。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
本发明提供了一种靶向复合外泌体及其制备方法，本发明通过修饰在外泌体膜上的RGE肽与胶质瘤细胞膜上高表达的NRP-1蛋白高效特异性结合，使制备得到的复合外泌体具有较高的主动靶向能力。实施例结果表明：本发明制备得到的靶向复合外泌体进入U251细胞的能力明显强于其他各非靶向组；在原位瘤模型鼠水平上，RGE-Exo较free-Exo更多地进入原位移植瘤区域，且滞留时间更长，而在肝脾等部位的聚集及存留时间减少。
附图说明
图1为将膜修饰有靶向多肽用绿色FITC标记的电镜图；
图2为将膜修饰有靶向多肽的外泌体用红色荧光染料CM-DiI标记的电镜图；
图3为CM-DiI及FITC的荧光分布显微图；
图4为FITC阳性细胞的比例图；其中图4-i为与RGE-Exo-SPION/Cur共孵育2h组；图4-ii为与点击化学反应时相同浓度的RGE肽和Exo-SPION/Cur物理混合后再与U251细胞共孵育2h组；图4-iii为未连接RGE肽的Exo-SPION/Cur与U251细胞共孵育2h组；图4-iv为空白对照(与PBS液共孵育2h的U251细胞)组；图4-v为阳性对照(与FITC共孵育2h的U251细胞)组；
图5为RGE-Exo-SPION/Cur电镜下的形貌变化图；
图6为共聚焦显微镜观察U251细胞与CM-DiI标记的Exo-SPION/Cur共孵育后荧光分布图；
图7为RGE-Exo-SPION/Cur在胶质瘤细胞水平和原位瘤模型鼠靶向性验证，其中7-(A)为共聚焦显微镜显示RGE-Exo-SPION/Cur进入靶细胞的能力；7-(B)为流式分析显示RGE-Exo-SPION/Cur进入细胞能力(CM-DiI阳性细胞比例)；7-(C)为RGE-Exo-SPION/Cur在脑胶质瘤原位移植瘤模型鼠体内的分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向复合外泌体的制备方法，包括如下步骤：
1)采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体；
2)将所述步骤1)的膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液混合，在2～6℃下进行电穿孔处理后，将得到的靶向复合外泌体初体在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。
本发明采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体。在本发明中，所述靶向修饰的方法优选包括以下步骤：
a、将PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，调整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震荡50～70min，得到第一反应体系；
所述PBS、NHS和4-戊炔酸的质量体积比为1mL:35mg:29mg；
b、将所述步骤a的第一反应体系与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，在2～6℃下震荡50～70min，得到第二反应体系；所述第二反应体系中EDC的终浓度为0.3mol/L；
c、将所述步骤b的第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液混合后，依次进行震荡、超滤，得到膜连接炔键的外泌体；
所述第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液的体积比为2：75；
d、在所述步骤c的膜连接炔键的外泌体中依次加入PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽，在20～25℃充氮振荡2.5～3.5h，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体。
在本发明中，优选将PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，调整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震荡50～70min，得到第一反应体系；所述PBS、NHS和4-戊炔酸的质量体积比为1mL:35mg:29mg。在本发明中，所述pH优选为7.4。所述调整pH用溶液优选为碳酸氢钠。在本发明中，所述震荡的温度优选为4℃；所述震荡的时间优选为60min；所述震荡的频率优选为100～200rpm，更优选为150rpm。
得到第一反应体系后，本发明优选将所述第一反应体系与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，在2～6℃下震荡50～70min，得到第二反应体系；所述第二反应体系中EDC的终浓度为0.3mol/L。
在本发明中，所述所述震荡的温度优选为4℃；所述震荡的时间优选为60min；所述震荡的频率优选为70～90次/min，更优选为80次/min。
得到第二反应体系后，本发明优选将所述第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液混合后，依次进行震荡、超滤，得到膜连接炔键的外泌体；所述第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液的体积比为2：75。在本发明中，所述含有外泌体的PBS溶液中外泌体的质量与PBS溶液的体积比优选为16μg:15μL。在本发明中，所述震荡的时间优选为22～26h，更优选为24h；所述震荡的温度为18～22℃，更优选为20℃；所述震荡的频率优选为70～90次/min，更优选为80次/min。在本发明中，所述超滤用膜的分子截留量优选为100KDa。
得到膜连接炔键的外泌体后，本发明优选在所述膜连接炔键的外泌体中依次加入PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽，在20～25℃充氮振荡2.5～3.5h，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体。在本发明中，所述无水硫酸铜的浓度优选为0.32mol/L。所述L-抗坏血酸的浓度优选为1.44mol/L。所述二水合红菲绕啉的浓度优选为0.27mol/L。所述含叠氮的多肽中叠氮的浓度为8.5mol/L。在本发明中，所述膜连接炔键的外泌体、PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽的质量体积比依次为150～170μg：290～310μL：13～15μL：70～72uL：32～34μL：0.19～0.21mg，更优选为160μg：300μL：14μL：71uL：32.8μL：0.2mg。在本发明中，所述充氮振荡时的温度优选为22℃；所述充氮振荡的时间优选为3h；所述充氮振荡时的频率优选为70～90次/min，更优选为80次/min；所述充氮振荡时的充氮量优选为1L/min。
本发明对所述含叠氮的多肽的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，本发明实施例中购买自浙江宁波康贝生化有限公司。
在本发明中，所述外泌体优选为小鼠巨噬细胞系Raw264.7分泌，采用文献(ThéryC,Amigorena S,Raposo G et al.Isolation and characterization of exosomes fromcell culture supernatants and biological fluids.Curr Protoc Cell Biol,2006,Chapter 3:Unit 3.22)所述方法进行分离纯化制备。
在本发明中，采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰时利用点击化学的原理，通过叠氮环加成反应将靶向多肽连接到外泌体膜表面。共两个步骤：①利用EDC-NHS缩合反应将炔键和外泌体膜表面的蛋白(或脂质磷脂酰乙醇胺)上的氨基连接；②通过点击化学反应，将带有叠氮基团的目的多肽和外泌体膜上的炔键通过三唑键连接，完成外泌体膜表面的多肽修饰。
得到膜修饰有靶向多肽的外泌体后，本发明将所述膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液混合，在2～6℃下进行电穿孔处理后，将得到的靶向复合外泌体初体在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。
在本发明中，所述膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液的质量体积比依次优选为900～1100μg：2900～3100μg：90～110μg：1～1.1mL，更优选为1000μg：3000μg：100μg：1mL。
在本发明中，所述纳米四氧化铁水溶液的浓度优选为3.5～4.5mg/mL，更优选为4mg/mL。本发明对所述纳米四氧化铁的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明实施例中购买自南京东纳生物科技有限公司。
本发明对所述药物的种类优选为需要满足有抗胶质瘤活性，无法或难以自行穿过血脑屏障的药物，更优选为姜黄素、阿霉素、紫杉醇，本发明实施例中的药物为姜黄素。
在本发明中，所述电穿孔缓冲溶液优选为40～60mmol/L的海藻糖PBS溶液，更优选为50mmol/L。
在本发明中，所述电穿孔处理时的温度为2～6℃，优选为4℃。所述电穿孔处理的条件优选包括：电压390～410v，电容140～160μF，放电时间0.9～1.1ms，更优选包括电压400v，电容150μF，放电时间1.0ms。在本发明中，所述放电处理后优选取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值，并与未穿孔的组做对比。RNA在260nm处有最大吸光值，穿孔后细胞膜破裂，RNA从细胞中逸出，溶液中RNA浓度增加，吸光值变大。本发明中，在260nm处的吸光值可以反映穿孔的成功与否。
得到靶向复合外泌体初体后，本发明将所述靶向复合外泌体初体在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃；所述孵育的时间优选为30min。在本发明中，所述孵育可以促进被穿破的外泌体膜修复。在本发明中，在孵育25～35min后优选还包括将孵育后得到的孵育液依次进行超滤、离心。在本发明中，所述超滤用膜的截留分子量优选为100KDa。在本发明中，所述离心的离心力优选为4500～5500g，更优选为5000g；所述离心的时间优选为25～35min，更优选为30min。本发明中所述超滤、离心的作用为除去游离的药物。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.制备膜修饰有靶向多肽的外泌体
在1mL PBS中加入35mg NHS、29mg 4-戊炔酸，用碳酸氢钠调整pH至7.4，放于冰上以80次/min的频率振荡1h，得到第一反应体系。
在第一反应体系中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，放于冰上以80次/min的频率振荡1h，得到第二反应体系(EDC的终浓度为0.3mmol)。取4μL第二反应体系加入到150μL含有160μg外泌体(蛋白计)的PBS中，常温(20℃)以80次/min的频率震荡24h后，采用100KDa膜超滤2次除杂，得到膜连接有炔键的外泌体。将得到的膜连接有炔键的外泌体与300μLPBS溶液混合，在该溶液中依次再加入浓度为0.32mol/L的无水硫酸铜14μL，浓度为1.44mol/L的L-抗坏血酸71μL，浓度为0.27mol/L二水合红菲绕啉32.8μL和含8.5mM叠氮的多肽0.2mg，组成反应溶液共425.8μL，置于小玻璃瓶中，在20℃以1L/min的充氮速度充氮振荡条件下反应3h后，将得到的溶液采用100KDa膜超滤，得到纯化的膜修饰有靶向多肽的外泌体。
2.检验是否得到膜修饰有靶向多肽的外泌体
将上述分离纯化的膜修饰有靶向多肽的外泌体混悬液滴于培养皿中(多肽预先用绿色FITC标记)，经超分辨率荧光显微镜观察荧光信号，具体如如1所示。由图1可见外泌体呈较均一的绿色荧光。
将膜修饰有靶向多肽的外泌体用红色荧光染料CM-DiI标记，一部分直接滴加在培养皿中，经超分辨率共聚焦显微镜观察，具体结果如图2所示。由图2可以看出：标记在外泌体膜上的红色荧光和多肽的绿色荧光较好地重叠在一起；另一部分与靶细胞共孵育2个小时，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞水平上CM-DiI及FITC的荧光分布情况，具体结果如图3所示。由图3可以看出，象征外泌体膜的红色荧光和象征多肽的绿色荧光在靶细胞内很好地重叠在一起。
将上述共孵育之后的另一部分细胞收集后经流式细胞分析(FCA)检测FITC阳性细胞的比例，同时，分别设置如下五组：1)靶向多肽(RGE)与外泌体(Exo)经点击化学反应后采用100KDa膜超滤所得外泌体孵育组；2)靶向多肽与外泌体物理混合3h后采用100KDa膜超滤所得外泌体孵育组；3)未连接、混合多肽的的外泌体孵育组；4)不含外泌体的PBS孵育组；5)FITC溶液孵育组。上述各组经流式细胞分析(FCA)检测FITC阳性细胞的比例。具体结果如图4所示。其中图4-i为与RGE-Exo共孵育2h组；图4-ii为与点击化学反应时相同浓度的RGE肽和Exo物理混合后再与U251细胞共孵育2h组；图4-iii为未连接RGE肽的Exo与U251细胞共孵育2h组；图4-iv为空白对照(与PBS液共孵育2h的U251细胞)组；图4-v为阳性对照(与FITC共孵育2h的U251细胞)组；由图4可以看出，与FITC直接标记细胞后的检测结果接近(94.88％VS 95.11％)，远高于靶肽与外泌体物理混合后共孵育细胞的阳性比例(35.61％)、裸外泌体孵育细胞组(14.70％)和单纯细胞组(0.35％)。实验结果表明：以上结果均提示多肽成功偶联至外泌体膜表面。
3.制备靶向复合外泌体
将待制备的药物3000μg、浓度为4mg/mL的纳米四氧化三铁水溶液25μL、外泌体混悬液100μL和电穿孔缓冲液(50mmol/L的海藻糖PBS溶液)1000μL振荡混合，在4℃下进行电穿孔处理(电压400v，电容150μF，放电时间1.0ms，放电处理后取100μL用可见分光光度计检测260nm处吸光值，并与未穿孔的组做对比，在穿孔前的吸光度值为0.1A，穿孔后的吸光度值为0.8A，得到靶向复合外泌体初体。将靶向复合外泌体初体在37℃下孵育30min，得到外靶向复合外泌体。采用分子截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤后，再以5000g的离心力离心30min，得到纯化的靶向复合外泌体(RGE-Exo-SPION/Cur)。利用电镜(4万倍：40K)观察靶向复合外泌体的大小、形态、完整性并观察超顺磁性纳米铁颗粒(SPIONs)和姜黄素(Cur)，具体结果如图5所示。由图5可以看出，电穿孔及偶联RGE肽前后，外泌体大小、形貌及完整性无明显变化，穿孔后电镜图可见外泌体膜内侧有直径约5nm的黑色颗粒，复合SPIONs电镜下表现，放置4周后外泌体及其内部SPIONs在电镜下表现无明显变化。
将各组Exos以100μLPBS重悬后，以50μL/孔加入含有贴壁生长胶质瘤细胞的六孔板中，37℃共孵育2h。观察共聚焦显微镜观察U251细胞与CM-DiI标记的Exo-SPION/Cur共孵育后荧光分布图，具体结果如图6所示。由图6-a可以看出，外泌体和细胞共孵育后，RGE肽(合成时偶联绿色荧光染料FITC)的绿色荧光较多地分布于细胞内(胞浆内)；由图6-b可以看出：代表外泌体膜(用红色荧光染料DiI染膜)的红色荧光也较多地分布于细胞内(胞浆内)；由图6-c可以看出：共聚焦显微镜merge后可以发现绿色荧光(RGE肽)和红色荧光(外泌体膜)很好地重合在一起(黄色荧光)，实验结果表明：RGE肽连接与外泌体膜上。
实施例2
分别从细胞和荷瘤鼠水平验证合成的靶向复合外泌体的靶向性，其中细胞水平采用共聚焦显微镜观察，具体方法为：
1)准备RGE-Exo-SPION/Cur 1000、free-Exos各1000ug(总蛋白)/1mL、100nM RGE肽溶液10mL，其中RGE-Exo-SPION/Cur和free-Exos按4.2.4.2步骤分别进行CM-DiI染膜，得CM-DiI标记的Exos；
2)选取对数生长期的靶细胞(U251)和非靶细胞(Bel-7404)分别接种于共聚焦培养皿中，保持良好的细胞状态和合适的细胞密度(约1×105/孔)，RGE肽溶液1nM(保证足量)与部分U251细胞室温孵育4h后，吸取未结合的肽，得到RGE封闭的U251细胞；
3)按如下分组分别与细胞共孵育：RGE-Exos-SPION/Cur+U251，RGE-Exos-SPION/Cur+Bel-7404，RGE-Exos-SPION/Cur+U251(pre-blocked)，Exos-SPION/Cur+U251，室温避光孵育4h后PBS清洗3遍；
4)共聚焦荧光显微镜下观察各组细胞中红色荧光(CM-DiI)分布情况。
原位瘤模型鼠水平用CM-DiI对Exo-SPION/Cur和Exo-SPION/Cur进行标记，然后按如下步骤进行：
1)分组(每组3只)进行裸鼠尾静脉注射(各组中保持CM-DiI浓度一致，均为20μM)：a.RGE-Exo-SPION/Cur；b.Exo-SPION/Cur；c.CM-DiI，100μL/只裸鼠。
2)分别于注射后0h、1h、2h、4h、6h、8h于小动物活体荧光成像仪中观察红色荧光(CM-DiI)信号分布的情况。
3)拍照、记录，图像处理、分析荧光信号。
具体结果如图7所示。由图7可以看出：在细胞水平上，通过共聚焦显微镜观察经红色荧光染料DiI染膜的外泌体进入细胞的多少及细胞流式分析检测DiI阳性细胞的比例，得出一致的结论：RGE-Exo进入U251细胞的能力明显强于其他各非靶向组；在原位瘤模型鼠水平上，RGE-Exo(RGE肽修饰的外泌体)较free-Exo(裸外泌体)更多地进入原位移植瘤区域，且滞留时间更长，而在肝脾等部位的聚集及存留时间减少。以上结果均表明：靶向复合外泌体对脑胶质瘤的良好的靶向性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向复合外泌体的制备方法，包括如下步骤：
1)采用靶向多肽对外泌体进行靶向修饰，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体；
2)将所述步骤1)的膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液混合，在2～6℃下进行电穿孔处理后，将得到的靶向复合外泌体初体在35～40℃下孵育25～35min，得到靶向复合外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中靶向修饰的方法包括以下步骤：
a、将PBS、NHS和4-戊炔酸混合后，调整pH至7.2～7.5，在2～6℃下震荡50～70min，得到第一反应体系；
所述PBS、NHS和4-戊炔酸的质量体积比为1mL:35mg:29mg；
b、将所述步骤a的第一反应体系与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐混合，在2～6℃下震荡50～70min，得到第二反应体系；所述第二反应体系中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的终浓度为0.3mol/L；
c、将所述步骤b的第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液混合后，依次进行震荡、超滤，得到膜连接炔键的外泌体；
所述第二反应体系与含有外泌体的PBS溶液的体积比为2：75；
d、在所述步骤c的膜连接炔键的外泌体中依次加入PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽，在20～25℃充氮振荡2.5～3.5h，得到膜修饰有靶向多肽的外泌体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中含有外泌体的PBS溶液中外泌体的质量与PBS溶液的体积比为16μg:15μL。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中震荡的时间为22～26h，震荡时的温度为18～22℃。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c中超滤用膜的截留分子量为100KDa。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d中膜连接炔键的外泌体、PBS溶液、无水硫酸铜溶液、L-抗坏血酸溶液、二水合红菲绕啉溶液和含叠氮的多肽的质量体积比为160μg～65μg：300μL～310μL：14μL～15μL：71～75μL：32.8～35μL：0.2～2.1mg。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中膜修饰有靶向多肽的外泌体、药物、纳米四氧化三铁水溶液和电穿孔缓冲液的质量体积比为900～1100μg：2900～3100μg：90～110μg：1～1.1mL。
8.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中电穿孔缓冲溶液为40～60mmol/L的海藻糖PBS溶液。
9.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述电穿孔处理的电压为390～410v，所述电穿孔处理的电容为140～160μF，所述电穿孔处理的放电时间为0.9～1.1ms。
10.权利要求1～9任意一项方法制备得到的靶向复合外泌体。
Priority Applications (1)
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| CN201811338234.1A CN109432434A (zh) | 2018-11-12 | 2018-11-12 | 一种靶向复合外泌体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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