CN114763533B

CN114763533B - 外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体

Info

Publication number: CN114763533B
Application number: CN202210539641.9A
Authority: CN
Inventors: 谭回; 魏炜; 王文婧; 马光辉; 李维平
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS; Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS; Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN114763533A

Abstract

本公开涉及一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体，所述方法包括如下步骤：(1)将外泌体与硒前驱体在溶剂中进行共孵育，然后除去溶剂，得到吸附有硒前驱体的外泌体；(2)吸附有硒前驱体的外泌体与还原剂进行还原反应，得到硒化外泌体。本公开提供的硒化外泌体不但保留了外泌体本身的生物学活性，更因为有原位生长的纳米硒而使外泌体具有纳米硒的功能。

Description

外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体

技术领域

本公开涉及功能材料技术领域，尤其涉及一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体。

背景技术

外泌体是一种由细胞分泌到胞外的膜性囊泡，直径为30-150nm，其携带母细胞的遗传物质、脂质和蛋白质，具有一定的生理功能，近年来在生物医学领域受到了研究者们的广泛关注。研究者们利用外泌体的生理活性，发展了基于外泌体的炎症疾病修复治疗，例如，采用间充质干细胞外泌体进行脑损伤的治疗，能够使小鼠损伤的神经血管在一定程度内得到重塑，神经、行为和认知功能得到一定改善。但是，仅仅使用外泌体进行修复治疗的效果是有限的，特别是针对炎症相关疾病，由炎症反应产生的大量自由基不仅会造成氧化损伤，还会加重炎症反应，造成自由基与炎症间的恶性循环。因此，在使用外泌体对炎症相关疾病进行修复治疗的同时，清除病灶内的自由基是至关重要的。

硒是人体必需的微量元素，是人体内谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化活性中心，发挥着调节人体免疫功能、缓解自由基氧化损伤的作用，因此，适量补充硒对于炎症相关疾病具有重要的修复治疗作用。近年来，纳米硒由于其具有更高的生物安全性、高的抗氧化活性，已成为新一代的补硒保健品。虽然纳米硒具有抗氧化功能，但是其在损伤修复治疗中面临着靶向效果差的问题，因此，提高纳米硒在损伤灶内的富集效率，是亟待解决的问题。外泌体由于具有母细胞的细胞膜标志物，因此具有独特的同源靶向或趋化靶向能力，如果能将外泌体的靶向能力与纳米硒结合，不仅能够解决纳米硒的靶向差问题，还能够丰富外泌体的功能性，实现外泌体与纳米硒对于炎症相关疾病的协同治疗功效。

因此，想要提供一种外泌体与纳米硒结合的方法以满足应用需求。

发明内容

为了解决上述技术问题，本公开提供了一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体。本公开提供的硒化外泌体不但保留了外泌体本身的生物学活性，更因为有原位生长的纳米硒而具有纳米硒的功能，例如抗氧化活性，因此对于例如炎症相关疾病的治疗具有良好的治疗效果。

第一方面，本公开提供了一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将外泌体与硒前驱体在溶剂中进行共孵育，然后除去溶剂，得到吸附有硒前驱体的外泌体；

(2)吸附有硒前驱体的外泌体与还原剂进行还原反应，得到硒化外泌体。

本公开以外泌体为主体结构，通过原位吸附硒前驱体，再利用还原剂还原，得到表面原位生长有纳米硒的外泌体，在本公开中称之为硒化外泌体，本公开提供的制备方法工艺操作简单，得到的硒化外泌体同时具有外泌体本身的生物学活性以及纳米硒的功能性。本公开所述的纳米硒的功能性示例性的列举抗氧化活性，并不代表纳米硒仅具有抗氧化活性，本公开提供的硒化外泌体具有多种应用，例如利用纳米硒的抗氧化活性能够用于炎症相关疾病的治疗，具有良好的治疗效果

作为本公开的一种优选技术方案，所述外泌体与硒前驱体的质量比为1:(0.005-0.6)，所述0.005-0.6可以为0.008、0.01、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5等。

本公开对于外泌体的具体种类等内容并不进行过多的限定，任何细胞分泌的外泌体均能够作为本公开的制备原料，不同的外泌体能够靶向不同的目标物，同时结合纳米硒的功能性，使得本公开提供的硒化外泌体具有不同的应用方向，例如利用纳米硒的抗氧化活性，能够将硒化外泌体用于炎症相关疾病的治疗，本公开示例性的列举如下外泌体，作为本公开的一种优选技术方案，所述外泌体可以是任何能够产生外泌体的细胞产生的外泌体，例如：神经干细胞外泌体、间充质干细胞外泌体、小胶质细胞外泌体、神经元外泌体、巨噬细胞外泌体、调节性T细胞外泌体、血管内皮细胞外泌体等等外泌体，但不局限于这几种细胞的任意一种或至少两种的组合。

作为本公开的一种优选技术方案，所述硒前驱体选自亚硒酸钠、硒酸钠、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸或海藻硒多糖中的任意一种或至少两种的组合，优选亚硒酸钠。

作为本公开的一种优选技术方案，所述溶剂选自生理盐水、磷酸缓冲溶液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液或5％葡萄糖溶液中的任意一种或至少两种的组合。

本公开并不限定溶剂、外泌体和硒前驱体的加入顺序，作为优选，可以先将外泌体溶解在溶剂中，然后再与硒前驱体混合。

作为本公开的一种优选技术方案，所述共孵育的温度为0-37℃，优选0-4℃，例如0.5℃、1℃、1.5℃、2℃、2.5℃、3℃、3.5℃等。

在本公开限定的温度下进行共孵育，优选的0-4℃低温条件能够使硒前驱体尽可能多的吸附在外泌体表面，若共孵育温度较高，则不利于吸附。

作为本公开的一种优选技术方案，所述共孵育的时间为1-3h，例如1.5h、2h、2.5h等。

作为本公开的一种优选技术方案，所述还原剂与所述硒前驱体中硒原子的摩尔比为(1-40):1，所述1-40可以是1、4、8、10、20、40等，优选(4-8):1。

作为本公开的一种优选技术方案，所述还原反应的温度为4-37℃，例如5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等。

作为本公开的一种优选技术方案，所述还原反应的时间为0.5-12h，例如1h、2h、4h、5h、6h、8h、10h等。

作为本公开的一种优选技术方案，所述除去溶剂的方法包括离心、超滤或透析。

作为本公开的一种优选技术方案，所述还原剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽、硼氢化钠或多酚。

作为本公开的一种优选技术方案，所述还原反应在缓冲液中进行，优选所述缓冲液的pH值为5.5-8.5，例如6、6.5、7、7.5、8等。

第二方面，本公开提供了第一方面所述的方法得到的硒化外泌体。

本公开提供的硒化外泌体同时具有外泌体的生物学活性和纳米硒的功能，以抗氧化活性为例，对炎症相关疾病具有良好的治疗效果；以神经损伤为例，使用本公开提供的硒化外泌体，抗炎因子表达明显上调，有利于缓解炎症，具有较好的治疗效果。

作为本公开的一种优选技术方案，所述硒化外泌体表面包括的纳米硒的粒径为3-10nm，优选3-6nm。

本公开所述粒径为平均粒径，所述粒径为3-10nm可以是4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm等。

本公开提供的制备方法制备得到的原位生长的纳米硒粒径极小，具有优异的纳米硒的功能，例如抗氧化效果。

本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

(1)本公开以外泌体为主体结构，通过原位吸附硒前驱体，再利用还原剂还原，得到表面原位生长有纳米硒的外泌体，制备方法简单、工艺操作简单易行；

(2)本公开提供的硒化外泌体不但保留了外泌体本身的生物学活性还具有纳米硒的功能，相比于传统文献报道的水相合成的纳米硒(20-400nm)具有更加突出的功能性，例如在抗氧化活性方面，本公开提供的硒化外泌体能够表现出对于炎症相关疾病具有更优异的治疗效果；

(3)本公开提供的制备方法不但丰富了功能化外泌体的制备方法，还为外泌体在纳米医学领域中的应用提供一定的理论基础和技术指导。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本公开实施例1得到的硒化外泌体的透射电镜图；

图2为硒化外泌体的元素分析谱图；

图3为HT22细胞内活性氧水平的表达共聚焦图片；

图4为脊髓损伤小鼠的脊髓离体荧光成像图；

图5为脊髓损伤小鼠经治疗后，疲劳仪运动学数据图一；

图6为脊髓损伤小鼠经治疗后，疲劳仪运动学数据图二；

其中，在图5-6中，从左到右依次为Sham假损伤组、脊髓损伤后PBS处理对照、传统80nm纳米硒(Se NPs)处理对照组、传统80nm纳米硒与神经干外泌体简单混合(SeNPs+nExo)处理对照组、硒化神经干细胞外泌体(nExo-Se)处理实验组。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本实施例提供了一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体。

(1)将神经干细胞外泌体溶解在pH＝6.5的磷酸缓冲溶液中，按照外泌体与硒前驱体的质量比为1:0.03加入亚硒酸钠，在0℃共孵育3h后，利用离心的方式除去溶剂(和游离的硒前驱体)，得到吸附有硒前驱体的外泌体；

(2)将吸附有硒前驱体的外泌体溶解在pH＝6.5的磷酸缓冲溶液中，按照还原剂与硒前驱体中硒原子的摩尔比为6:1加入抗坏血酸，在室温下进行还原反应12h，得到硒化外泌体。

性能测试1

(1)利用透射电镜观察硒化外泌体的微观形貌。

图1为实施例1得到的硒化外泌体的透射电镜图，其中内嵌图为纳米硒晶格，图2为硒化外泌体的元素分析谱图(箭头所指为硒元素的能谱位置)，由图1和图2可知，本公开提供的制备方法能够使外泌体表面成功原位生长纳米硒，即本公开制备得到的产物为表面原位生长有纳米硒的外泌体(硒化外泌体)，同时，由图可知，纳米硒的平均粒径在3.5nm左右。

实施例2-3

与实施例1的区别在于，在本实施例中，所述外泌体与硒前驱体的质量比为1:0.005(实施例2)、1:0.6(实施例3)。

实施例4

与实施例1的区别在于，在本实施例中，共孵育的温度为10℃。

实施例5

(1)将血管内皮细胞外泌体溶解在pH＝5.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，按照外泌体与硒前驱体的质量比为1:0.03加入硒代蛋氨酸，在4℃共孵育1h后，利用超滤的方式除去溶剂(和游离的硒前驱体)，得到吸附有硒前驱体的外泌体；

(2)将吸附有硒前驱体的外泌体溶解在pH＝5.5的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液中，按照还原剂与硒前驱体中硒原子的摩尔比为10:1加入谷胱甘肽，在室温下进行还原反应4h，得到硒化外泌体。

对比例1

本对比例提供了一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法及得到的硒化外泌体。

与实施例1的区别在于，在本对比例中，所述外泌体与硒前驱体的质量比为1:1。

对比例2

本对比例提供了一种神经干细胞外泌体(与实施例1使用的神经干细胞外泌体相同)。

对比例3

本对比例提供了一种纳米硒的制备方法及得到的纳米硒。

(1)在磷酸缓冲溶液中加入亚硒酸钠(与实施例1同质量)，在0℃放置3h后，按照还原剂与硒前驱体中硒原子的摩尔比为6:1加入抗坏血酸，在室温下进行还原反应12h，得到纳米硒。

对比例4

本对比例提供了一种纳米硒和外泌体的混合液。

将对比例1提供的神经干细胞外泌体与对比例2提供的纳米硒混合，得到本对比例提供的纳米硒和外泌体的混合液(其溶剂的使用量与实施例1相同)。

性能测试2

(1)硒化外泌体的抗氧化活性测试

以清除经典自由基DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)能力为代表测试：

将50μg/mL的硒化外泌体与0.5mmol/L的紫色自由基DPPH溶液反应，测试整个反应体系反应30min后在526nm处吸光度的变化，计算DPPH自由基的清除率，结果见表1：

表1

样品	清除率/％	样品	清除率/％
				实施例1	45.8	对比例1	30.1
实施例2	42.5	对比例2	0.5
				实施例3	44.5	对比例3	18.1
实施例4	40.3	对比例4	19.1
				实施例5	41.2	对照组1	0.5

注：对照组1为不处理对照组。

由表1可知，本公开提供的硒化外泌体具有优异的抗氧化活性。由实施例1-3和对比例1的对比可知，本公开中外泌体和硒前驱体的质量比需要在本公开的限定范围内，具有较优的效果；由实施例1和4的对比可知，本公开在0-4℃下共孵育，能够增加外泌体表面原位生长的纳米硒含量，进而增加抗氧化效果。由实施例1和对比例2-4的对比可知，本公开提供的制备方法能够得到具有优异抗氧化效果的硒化外泌体。

(2)硒化外泌体的自由基清除能力

将HT22细胞培养基中加入200μmol/L H₂O₂，对照组为加入等量的PBS处理组，实验组为加入50μg/mL的硒化外泌体组(实施例1提供)；3小时后，收集细胞，进行DCFHDA染色，共聚焦结果见图3；

图3为HT22细胞内活性氧水平的表达共聚焦图片，其中，阴性对照组为HT22细胞未经过H₂O₂处理、只加等量PBS溶液的阴性，过氧化氢组为HT22细胞经过氧化氢处理后、只加等量PBS溶液的阳性组，实验组为HT22细胞经过氧化氢处理后，又经硒化外泌体处理的实验组；由图3可知，本公开提供的硒化外泌体具有优异的清除活性氧效果。

(3)硒化外泌体的损伤灶内靶向能力

采用8周的c57BL/6小鼠构筑脊髓损伤模型，尾静脉注射DID标记的200μg硒化外泌体，24h后，牺牲小鼠，提取脊髓，进行荧光成像，结果见图4；

图4为脊髓损伤小鼠的脊髓离体荧光成像图，由图4可知，图中最亮位置为脊髓损伤的损伤点，且硒化外泌体富集最多，证明硒化外泌体具有良好的损伤灶富集能力。

(4)硒化外泌体的修复功能

采用8周的c57BL/6小鼠构筑脊髓损伤模型，模型构建完成3h内，尾静脉200μg硒化外泌体，以后每两天尾静脉注射一次，28天后，采用疲劳仪进行运动学功能统计；分组为Sham假损伤组，脊髓损伤后PBS处理对照、传统80nm纳米硒(Se NPs)处理对照组、传统80nm纳米硒与神经干外泌体简单混合(SeNPs+nExo)处理对照组以及硒化神经干细胞外泌体(nExo-Se)处理实验组。

图5-6为脊髓损伤小鼠经治疗后，疲劳仪运动学数据图，从疲劳仪上各组小鼠的运动时间和运动数据可以看出，硒化神经干细胞外泌体处理的小鼠运动功能恢复的更好。

(5)抗炎因子IL-10表达情况

采用8周的c57BL/6小鼠构筑脊髓损伤模型，模型构建完成3h内，尾静脉200μg硒化外泌体，以后每两天尾静脉注射一次，28天后，牺牲小鼠，提取脊髓，研磨组织得到提取液，进行炎症因子IL-10表达情况的测试，测试结果见表2：

表2

样品	IL-10(pg/mL)
		Sham	22.8
PBS	25.7
		Se NPs	32.4
Se NPs+nExo	40.0
		nExo-Se	52.8

注：分组为Sham假损伤组，脊髓损伤后PBS处理对照、传统80nm纳米硒(Se NPs)处理对照组、传统80nm纳米硒与神经干外泌体简单混合(SeNPs+nExo)处理对照组以及硒化神经干细胞外泌体(nExo-Se)处理实验组。

由表2可知，相比于未治疗组，采用本公开提供的硒化外泌体进行治疗，能够使抗炎因子IL-10表达具有明显上调。

由图5-6和表2可知，采用本公开提供的硒化外泌体进行治疗，对脊髓损伤鼠的运动功能具有一定恢复能力，抗炎因子水平有所增加，有利于缓解炎症，表明本公开提供的硒化外泌体在例如炎症疾病模型中的良好治疗效果。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种外泌体表面原位生长纳米硒的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）将外泌体与硒前驱体在溶剂中进行共孵育，然后除去溶剂，得到吸附有硒前驱体的外泌体；

（2）吸附有硒前驱体的外泌体与还原剂进行还原反应，得到硒化外泌体；

其中，得到的所述硒化外泌体表面包括的纳米硒的粒径为3-10 nm；

所述硒前驱体选自亚硒酸钠、硒酸钠、硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸或海藻硒多糖中的任意一种或至少两种的组合；

所述溶剂选自生理盐水、磷酸缓冲溶液、羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲溶液或5%葡萄糖溶液中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外泌体与硒前驱体的质量比为1:(0.005-0.6)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硒前驱体选自亚硒酸钠。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共孵育的温度为0-37℃；

和/或，所述共孵育的时间为1-3h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述共孵育的温度为0-4℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂与所述硒前驱体中硒原子的摩尔比为(1-40):1。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述还原剂与所述硒前驱体中硒原子的摩尔比为(4-8):1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原反应的温度为4-37℃；

和/或，所述还原反应的时间为0.5-12h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除去溶剂的方法包括离心、超滤或透析。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原剂选自抗坏血酸、谷胱甘肽、硼氢化钠或多酚；

和/或，所述还原反应在缓冲液中进行。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为5.5-8.5。

12.权利要求1-11中的任一项所述的方法得到的硒化外泌体，所述硒化外泌体表面包括的纳米硒的粒径为3-10 nm。

13.根据权利要求12所述的硒化外泌体，其特征在于，所述硒化外泌体表面包括的纳米硒的粒径为3-6 nm。