CN102921015A - 透明质酸纳米硒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了透明质酸纳米硒及其制备方法和用途，属纳米医药材料技术领域。该发明以透明质酸为载体，亚硒酸钠为原料，在室温条件下采用抗坏血酸为还原剂制备得到红色球形的透明质酸纳米硒，粒径50-70nm。采用本发明方法制备的透明质酸纳米硒具有粒径小、粒径范围窄，分散性好等优点，在室温下一个月仍可以保持稳定，且反应条件温和，操作简单，是一种绿色环保的合成方法，克服了现有制备方法存在的一些不足，如粒径范围宽、分散性不良或稳定性差等。该透明质酸纳米硒对植入小鼠体内的HepG-2肝癌腹水瘤细胞的生长有显著抑制作用，可作为抗肿瘤辅助药物或提高机体免疫功能的保健品。
Description
技术领域
本发明涉及一种透明质酸纳米硒及其制备方法和用途，特指具有抗肿瘤作用的透明质酸纳米硒，属纳米医药材料技术领域。
背景技术
硒是生物体中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)、5-脱碘酶(ID)活性中心关键的组成元素，参与体内过氧物及碘的代谢，调节生物体内碘的水平及自由基水平。硒作为一种人体必需微量元素，具有清除自由基、防癌、抗衰老、保护肝脏、抗辐射、免疫调节、抗肿瘤等多方面活性，因此，硒在保健食品和医药领域中占有重要地位。然而，硒的营养剂量和毒性剂量之间范围较窄，因此开发高效低毒的硒制剂成为现代研究的热点课题之一。研究证实与无机硒和有机硒相比，纳米硒不仅更易被人体吸收和利用，而且生物毒性更低、安全性更高，具有更高的生物活性。
透明质酸是糖胺聚糖的一种，由β-N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸单糖的重复结构组成的线性多糖，是构成细胞外基质和细胞间质的主要成分，在维持细胞外基质的结构和调节细胞内活动等方面有着重要的作用。作为蛋白聚糖的核心，透明质酸的作用主要有：保护和润滑关节、促进血管生成及促进伤口愈合等，透明质酸在人体软组织中的生物相容性好。鉴于其黏弹性和生物相容性，透明质酸可作为一种载体与其他药物反应形成结合物，具有控释和靶向作用。
中国专利申请号201110084034.X公开了“一种硫酸软骨素纳米硒及其制备方法”，该发明以硫酸软骨素为载体，制备出粒径在30-200 nm的纳米硒颗粒；申请号201110151696.4 公开了“一种纳米硒颗粒及其制备方法”，采用血红蛋白、亚硒酸钠、辅酶Q10和玉米粉混合，反应得到粒径在50-100 nm的纳米硒颗粒，纳米硒颗粒中的硒的质量百分含量为1%-10%； 专利“液相维生素C复合的纳米单质硒及其制备与保存方法”（ 公开号为CN 100998603A）提供了一种不需要任何模板剂，仅需维生素C还原亚硒酸钠得到的液相维生素C复合的纳米单质硒，粒径26-93 nm，产物可以在2-10℃下在水溶液中以溶胶形态保存；周艳晖等以蔗糖作为表面修饰剂制备纳米硒溶胶，纳米硒在溶胶中的粒径分布在47-177 nm (暨南大学学报（自然科学版）,2010，31（1）:72-74)。然而上述专利和文献的制备方法仍存在一些不足，如粒径范围宽、分散性不良或稳定性差等。有关采用透明质酸为载体制备纳米硒的方法至今未见国内外报道，也未见相应专利公开。
发明内容
基于以上背景技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸纳米硒的制备方法，制备出粒径小、粒径范围窄，分散性好和稳定性好的球形透明质酸纳米硒，用于人们抗肿瘤的辅助治疗或营养保健。
针对上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种透明质酸纳米硒，是以透明质酸为载体，亚硒酸钠为原料，在室温条件下采用抗坏血酸为还原剂制备的红色纳米硒。
一种透明质酸纳米硒，以透明质酸为载体，抗坏血酸为还原剂，形成球状粒径在50-70nm的红色纳米硒，其中硒的质量分数在0.65%~2.2%。
上述一种透明质酸纳米硒的制备方法，包括以下步骤:
取 0.1%~1%（质量比）的透明质酸溶液和0.1mol/l亚硒酸钠溶液混合，在室温下磁力搅拌12 h，按亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比值为1:2~1:6缓慢滴加一定体积0.1 mol/l抗坏血酸溶液继续搅拌，溶液颜色由无色变为红色，直至颜色不再发生改变；在去离子水中透析48 h，真空冷冻干燥即得红色透明质酸纳米硒粉末。
其中透明质酸溶液和亚硒酸钠溶液的体积比为100：1。
上述一种透明质酸纳米硒的用途，用于治疗抗肿瘤药物。
采用本发明的方法可以制备出粒径小、粒径范围窄，分散性好的球形透明质酸纳米硒，在室温下一个月仍可以保持稳定，该反应条件温和，操作简单，是一种绿色环保的合成方法。
附图说明
图1为透明质酸纳米硒的扫描电镜分析结果；
图2和图3所示为透明质酸纳米硒溶液在透射电镜下的分析结果。
具体实施方式：
为了更清楚地说明本发明内容，用具体实施例说明如下，具体实施例不限定本发明内容范围。用电感耦合等离子发射光谱仪（ICP）测得透明质酸纳米硒中硒元素的含量。
透明质酸纳米硒的制备
实施例1
取100 ml 1%的透明质酸溶液（分子量为1.06×106 Da）和1 ml 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液，在室温下磁力搅拌12 h，缓慢滴加缓慢滴加12 ml 0.1mol/l抗坏血酸溶液继续搅拌，溶液颜色由无色变为红色，直至颜色不再发生改变。在去离子水中透析48 h，真空冷冻干燥得到红色透明质酸纳米硒粉末1.0590 g。由电感耦合等离子发射光谱仪（ICP）测得透明质酸纳米硒中硒元素的含量为1.4%。
实施例 2
取100 ml 0.25%的透明质酸溶液（分子量为1.06×106 Da）和1 ml 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液，在室温下磁力搅拌12 h，缓慢滴加缓慢滴加4 ml 0.1mol/l抗坏血酸溶液继续搅拌，溶液颜色由无色变为红色，直至颜色不再发生改变。在去离子水中透析48 h，真空冷冻干燥得到红色透明质酸纳米硒粉末0.2510 g。由电感耦合等离子发射光谱仪（ICP）测得透明质酸纳米硒中硒元素的含量为2.2%。
实施例3
取100 ml 0.1%的透明质酸溶液（分子量为1.06×106 Da）和1 ml 0.1 mol/l的亚硒酸钠溶液，在室温下磁力搅拌12 h，缓慢滴加2 ml 0.1mol/l抗坏血酸溶液继续搅拌，溶液颜色由无色变为红色，直至颜色不再发生改变。在去离子水中透析48 h，真空冷冻干燥得到红色透明质酸纳米硒粉末0.1013 g。由电感耦合等离子发射光谱仪（ICP）测得透明质酸纳米硒中硒元素的含量为0.65%。
对于所制备的透明质酸纳米硒，对其结构和抗肿瘤活性做进一步的介绍。
1. 透明质酸纳米硒的形态和粒径
图1为透明质酸纳米硒的扫描电镜分析结果，可以看出，采用透明质酸为载体，抗坏血酸为还原剂的方法产生了大量的透明质酸纳米硒颗粒，粒径小，分散性好。
如图2和图3所示为透明质酸纳米硒溶液在透射电镜下的分析结果，可见透明质酸纳米硒成规则的球形，粒径大小为50-70nm。
透明质酸纳米硒抗肿瘤活性试验：
1 材料与试剂
1.1 动物
ICR小鼠，雌性，体重20±2g，清洁级，购于扬州大学比较医学中心，合格证编号：SCXK(苏)2007-0001。实验前饲养3d，饲养温度为24±1℃，湿度为55 - 60%。
1.2 药品与试剂
透明质酸纳米硒：实验室自制（采用实施例2中制备的透明质酸纳米硒，经ICP-AES测定，硒元素的含量为2.2%）
5-氟尿嘧啶：天津金耀氨基酸有限公司 国药准字H12020959
生理盐水：湖南科伦制药有限公司，国药准字H51021158
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：南京建成生物工程研究所
1.3 统计方法
数据用SPSS16.0统计软件进行处理。结果用 ±s表示，多组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。P﹤0.05有统计学意义。
2 实验方法
2.1 小鼠HepG-2肝癌腹水瘤模型的建立
取体重20±2g的昆明小鼠2～3只，腹腔接种0.2 ml HepG-2腹水瘤瘤株，定期每7～9天传一代。取腹腔传代7天且生长良好的HepG-2腹水瘤小鼠，脱颈椎处死，75 %乙醇消毒动物皮肤，在无菌条件下，剪开小鼠腹腔，吸取生长良好的腹水，观察腹水颜色（腹水为乳白色无絮状沉淀物者为佳，血性腹水则不可用）并用台盼蓝染色法观察活细胞数（活细胞数>98 %）；腹水用生理盐水稀释，吹打混匀，细胞计数板计数，调整细胞数为2×107个活细胞/mL；取40只小鼠，右侧腋下接种HepG-2肿瘤细胞，建立小鼠HepG-2肝癌腹水瘤模型。
2.2 分组
取10只未造模的小鼠，为空白对照组，40只HepG-2肿瘤小鼠随机分组，每组10只，共4组：HepG-2肿瘤模型对照组、5-氟尿嘧啶阳性对照组、透明质酸纳米硒高剂量组、透明质酸纳米硒低剂量组。
2.3 给药剂量设计
表1 为各给药组的给药剂量，各组给药10天。
表1 给药剂量
| 组别 | 剂量（mg/kg） |
| 空白对照组 | 生理盐水 |
| HepG-2肿瘤模型对照组 | 生理盐水 |
| 5-氟尿嘧啶阳性对照组 | 25.00 |
| 透明质酸纳米硒高剂量组 | 86.45 |
| 透明质酸纳米硒低剂量组 | 4.32 |
2.4 检测指标
2.4.1 免疫器官重和抑瘤率
末次给药后次日，禁食8 h，称体重，摘眼球取血后脱颈椎处死；取出瘤块、胸腺、脾脏、肝、肾，经生理盐水洗涤后用滤纸吸干，称重。按下式计算抑瘤率：抑瘤率（%）=（C-T）/ C×100%，C为HepG-2肿瘤模型对照组中小鼠的平均瘤重，T为治疗组中小鼠的平均瘤重。
2.4.2 血液生化指标
眼球取血0.5-1ml，于3000 r/min 离心15 min，取上层血清测定谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Crea）。
2.4.3 超氧化物歧化酶SOD 含量的测定
取小鼠肝脏、肾脏制备成5%的组织匀浆，3000 rpm/min离心10min后，严格按照试剂盒操作说明测量超氧化物歧化酶SOD的含量
3 实验结果
3.1 小鼠瘤重及抑瘤率
表2为各组小鼠的瘤重及抑瘤率，从表中可知，透明质酸纳米硒高、低剂量对HepG-2肿瘤细胞的生长均有显著的抑制作用，且低剂量的透明质酸纳米硒抑瘤率达到49.13%。
表2 小鼠瘤重及抑瘤率
| 组别 | 瘤重（g） | 抑瘤率（%） |
| HepG-2肿瘤模型对照组 | 1.82±0.28 | |
| 5-氟尿嘧啶阳性对照组 | 0.82±0.53b | 61.71 |
| 透明质酸纳米硒高剂量组 | 1.14±0.45b | 46.92 |
| 透明质酸纳米硒低剂量组 | 1.09 ±0.73b | 49.13 |
bp<0.05 与HepG-2肿瘤模型对照组相比。
3.2小鼠免疫器官重量
表3为小鼠免疫器官胸腺和脾脏的重量。在透明质酸纳米硒高、低剂量组中，小鼠胸腺和脾脏重量与5-氟尿嘧啶阳性对照组相比均有显著增加，表明，透明质酸纳米硒的抗肿瘤活性可能与免疫系统有关，且与阳性药5-氟尿嘧啶相比具有较低的毒性。
表3 小鼠免疫器官重量
cp<0.05 与5-氟尿嘧啶阳性对照组相比。
3.3小鼠血液生化指标
表4为各组小鼠血液生化指标结果。在透明质酸纳米硒高、低剂量组中，小鼠血清中的AST、ALT、ALP和Crea 的含量与5-氟尿嘧啶阳性对照组相比均下降，其中透明质酸纳米硒低剂量组中AST、ALT和Crea含量最低，表明透明质酸纳米硒与抗肿瘤的阳性药5-氟尿嘧啶相比毒性明显降低。
表4 小鼠血液生化指标结果
| 组别 | AST | ALT | ALP | Crea |
| 空白对照组 | 213.50± 13.43c | 49.67±9.45 | 194.00±41.00 | 8.67±2.08 |
| HepG-2肿瘤模型对照组 | 643.00±12.73c | 59.33±8.73 | 56.50±14.80a | 6.67±2.51 |
| 5-氟尿嘧啶阳性对照组 | 1006.00±33.98 | 44.67±18.7 | 26.50±4.94a | 10.00±0.00 |
| 透明质酸纳米硒高剂量组 | 524.50±21.92c | 39.50±2.12 | 49.00±2.82a | 7.50±0.70 |
| 透明质酸纳米硒低剂量组 | 433.50±14.85c | 35.50±1.71 | 25.50±0.71a | 5.50±0.70 |
ap<0.05与空白对照组相比；cp<0.05 与5-氟尿嘧啶阳性对照组相比。
3.4 小鼠肝肾中超氧化物歧化酶SOD的含量
表5为各组小鼠肝脏和肾脏中超氧化物歧化酶SOD的含量。透明质酸纳米硒高、低剂量组中小鼠肝脏中的超氧化物歧化酶含量与HepG-2肿瘤模型对照组、5-氟尿嘧啶阳性对照组相比均具有显著性的增加，且透明质酸纳米硒低剂量组小鼠肝脏中的超氧化物歧化酶含量最高。小鼠肾脏中超氧化物歧化酶SOD的含量与与肿瘤模型组、5-氟尿嘧啶阳性对照组相比没有显著性变化。表明，透明质酸纳米硒可以提高小鼠肝脏清除氧自由基的活力，但在肾脏中清除氧自由基的活力没有得到增强。
表5 小鼠肝肾中超氧化物歧化酶SOD的含量
| 组别 | 肝脏(nmol/mgprot) | 肾脏(nmol/mgprot) |
| 空白对照组 | 423.1±36.9 | 207.36±7.40 |
| HepG-2肿瘤模型对照组 | 445.8±16.0 | 161.98±13.29 |
| 5-氟尿嘧啶阳性对照组 | 362.9±24.8b | 161.07±2.45 |
| 透明质酸纳米硒高剂量组 | 639.9±40.2abc | 137.48±0.43 |
| 透明质酸纳米硒低剂量组 | 659.9±60.5abc | 150.38±20.89 |
ap<0.05与空白对照组相比；bp<0.05 与HepG-2肿瘤模型对照组相比；cp<0.05 与5-氟尿嘧啶阳性对照组相比。
4 结论
透明质酸纳米硒对植入小鼠体内的HepG-2肝癌腹水瘤细胞的生长有显著抑制作用，与抗肿瘤阳性药5-氟尿嘧啶相比毒性明显降低，显著增加小鼠肝脏中超氧化物歧化酶SOD的含量，提高小鼠免疫器官胸腺、脾脏的重量。
Claims (4)
1.一种透明质酸纳米硒，其特征在于以透明质酸为载体，抗坏血酸为还原剂，形成球状粒径在50-70nm的红色纳米硒，其中硒的质量分数在0.65%~2.2%。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸纳米硒的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行:
取质量浓度0.1%~1%的透明质酸溶液和0.1mol/l亚硒酸钠溶液混合，在室温下磁力搅拌12 h，按亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比值为1:2~1:6缓慢滴加一定体积0.1 mol/l抗坏血酸溶液继续搅拌，溶液颜色由无色变为红色，直至颜色不再发生改变；在去离子水中透析48 h，真空冷冻干燥即得红色透明质酸纳米硒粉末。
3.根据权利要求2所述的一种透明质酸纳米硒的制备方法，其特征在于其中透明质酸溶液和亚硒酸钠溶液的体积比为100：1。
4.权利要求1所述的一种透明质酸纳米硒的用途，用于治疗抗肿瘤药物。
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