CN104383543B - 手性纳米硒材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于肿瘤靶向成像技术领域，公开了手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其中手性纳米硒复合材料及其负载的MDR‑siRNA均具有抑制肿瘤的活性。本发明制备得到的功能化纳米硒既作为抑制肿瘤的活性成分，也作为负载MDR‑siRNA的载体，协同具有抑制多药耐药肿瘤细胞生长的MDR‑siRNA实现高效抗肿瘤的作用。且本发明采用的修饰剂能有效调控纳米硒的形貌及尺寸，有利于增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。同时，本发明制备的手性纳米硒复合材料负载siRNA具有荧光特性，可作为荧光纳米材料应用于靶向成像。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤靶向成像技术领域，特别涉及手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物及靶向成像中的应用。
背景技术
癌症已成为威胁人类健康和生命的头号杀手，其危险性不容小觑。而且近20年来癌症呈现年轻化及发病率和死亡率“三线”走高的趋势。开发高效、低毒、广谱、高选择性的抗癌药物一直是癌症治疗领域的重要课题也是广大科学家的努力方向。
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新的生物，常表现为局部肿块，它生长旺盛，常呈持续性生长。目前，联合化疗对恶性肿瘤患者的生存期有积极的临床意义，但肿瘤细胞产生的耐药性又是化疗失败最常见而又最难解决的问题之一。多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，肿瘤多药耐药已经成为肿瘤化疗失败的重要原因之一。因此，如何有效逆转多药耐药性已经成为当今科研面临的迫切问题之一。
化疗药物是临床上常用的抗癌药物，但是给药后化疗药物在杀死癌细胞的同时也将正常细胞一同杀害，这种“敌我不分”、“玉石俱焚”的治疗方法对机体的损伤非常大，不能达到病人延长寿命的健康需求。
面对目前癌症防治时所存在的局限：①癌症产生耐药性，②非特异性载药及药物的针对性差，③药物缺乏有效的示踪治疗手段等。纳米载药体系的发展及其具有载药靶向运输并能同时实现检测靶向运输和有效治疗的功能为实现癌症早期检测、诊断及治疗带来了新希望。在肿瘤治疗过程中，纳米粒给药系统可以形成载药纳米复合物，通过靶向分子与癌细胞表面受体的特异性结合，利用恶性肿瘤独特的病理生理学特征选择性地累积在肿瘤部位，实现安全有效的靶向药物运输和治疗。其中荧光纳米材料在传感、生物成像、疾病诊断以及标记示踪等领域更有不可替代的优势。
随着纳米技术的不断发展，纳米材料独特的结构和理化性质使其在癌症的治疗上取得了一定的进展。目前关于金属纳米颗粒作为基因载体的研究报道较多，主要有纳米金颗粒、锰锌铁氧体等。Sandhu等的研究显示，纳米金颗粒作为载体，表面修饰季铵盐后携带正电荷，其承载DNA的转染效率高。唐秋莎等以锰锌铁氧体(复合磁性纳米粒子)为载体，在外界磁场的作用下将pEGFP质粒DNA转入COS-1细胞，从而获得了靶基因的蛋白表达。
至今未发现有关手性纳米硒荧光复合材料负载siRNA用于制备抑制肿瘤药物的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明利用小干扰RNA(Smallinterference RNA)逆转肿瘤细胞多药耐药性的新策略，以及纳米药物高效、安全的载药功能，合成了具有荧光特性的钌配合物功能化纳米硒，并以此作为siRNA的载体。发挥MDR-siRNA对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用。所合成的钌功能化纳米硒既具有抑制肿瘤的活性，也作为负载MDR-siRNA的载体，实现化学药物与基因治疗协同抑制肿瘤的作用，同时利用钌配合物的荧光特性进行实时荧光成像，实现了对载药体系在活体内的定位与追踪。
本发明的另一目的在于提供上述手性纳米硒复合材料负载siRNA在靶向成像中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其中手性纳米硒复合材料既具有抑制肿瘤的活性，也作为负载siRNA的载体，所负载的siRNA同样具有抑制肿瘤的活性，所用的siRNA为具有抑制多药耐药肿瘤细胞生长的MDR-siRNA。上述两种材料复合，协同作用实现抗肿瘤的功效。
所述的手性纳米硒复合材料优选为手性钌配合物-X修饰的纳米硒，X为手性精氨酸、手性半胱氨酸、没食子酸、维甲酸或维生素C；
优选地，所述的手性钌配合物为[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4；
所述的siRNA为MDR-siRNA，其序列为：
Sense strand:5‘-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUdTdT-3’；
Antisense strand:5‘-dTdTUUCUUCCUUUUCUUUGGUUGA-3’。
所述手性纳米硒复合材料负载siRNA通过以下方法实现：把手性纳米硒复合材料溶于水中，搅拌下加入siRNA溶液，37℃，孵育0.5～1.5h，得到手性纳米硒复合材料负载siRNA。
所用手性纳米硒复合材料的量与siRNA的摩尔比为5:1～10:1。
所用siRNA溶液浓度为20～50μmol/L。
所述把手性纳米硒复合材料溶于水中得到溶液的浓度优选为0.5mmol/L。
上述孵育过程中体系pH值优选保持在9～11，优选通过滴加盐酸进行调节，更优选通过滴加0.1mol/L盐酸溶液进行调节。
所述的手性纳米硒复合材料，即手性钌配合物-X修饰的纳米硒，优选通过如下方法制备得到：
取Na2SeO3溶液、X溶液和水按1:1:8的体积比混合后，搅拌下滴加NaBH4溶液，持续搅拌，得到纳米溶胶，离心、洗涤、干燥，重悬于水中，得到纳米硒溶液，加入[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液，超声，离心、洗涤、干燥，得到手性纳米硒复合材料。
所用NaBH4的量与Na2SeO3的摩尔比为1:1～1:3。
所用[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4的量与纳米硒的摩尔比为1:10～1:20。
所述Na2SeO3溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
所述X溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
所述NaBH4溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
所述[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液的浓度为0.2～0.5mmol/L。
所述[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液的浓度为0.2～0.5mmol/L。
所述持续搅拌的时间优选为2～5h。
上述滴加NaBH4溶液过程中控制pH值为9～11，优选通过滴加盐酸进行调节，更优选通过滴加0.1mol/L盐酸溶液进行调节。
上述制备过程中得到的纳米溶胶可于4℃储存待使用。
上述制备得到的纳米溶胶离心前优选在室温下放置24h。
所述超声的时间优选为10～20min。
优选地，制备使用的玻璃仪器均用HNO3-HCl(3:1，v/v)清洗一次，再用超纯水彻底洗涤干净，干燥备用。
上述制备过程中的溶液均为水溶液。所用的水优选为Milli-Q系统制备的纯净水或超纯水。
上述制备过程中，所述的洗涤优选为使用PBS洗涤；所述的干燥的条件优选为60℃干燥2天。
本发明的手性纳米硒复合材料负载siRNA具有荧光特性，具有靶向成像的性能，因此可应用于靶向成像中。
本发明的机理为：
本发明利用小干扰RNA(Small interference RNA，siRNA)逆转肿瘤细胞多药耐药性的新策略，以及纳米药物高效、安全的载药功能，合成了具有荧光特性的手性钌配合物-X修饰的纳米硒，并以此作为siRNA的载体。发挥MDR-siRNA对多药耐药肿瘤细胞的抑制作用。所合成的手性钌配合物-X修饰的纳米硒既作为抑制肿瘤的药物，也作为负载MDR-siRNA的载体的协同作用，从而应用于制备抗肿瘤药物中，并可应用于靶向成像中。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明提供手手性纳米硒复合材料负载siRNA用于制备抑制肿瘤药物的应用。本发明得到的功能化纳米硒既作为抑制肿瘤的活性成分，也作为负载MDR-siRNA的载体，协同具有抑制多药耐药肿瘤细胞生长的MDR-siRNA实现高效抗肿瘤的作用。
(2)本发明制备的手性纳米硒复合材料负载siRNA为荧光纳米材料，制备过程无需添加其它辅助试剂、产物体系简单，产品的保存和使用方便快捷。
(3)本发明采用的修饰剂能有效调控纳米硒的形貌及尺寸，有利于增加细胞的药物摄取量，减少外排，从而保证细胞内药物维持在较高水平。
附图说明
图1是实施例1制备得到的Ru@L-SeNPs的透视电镜图。
图2是实施例2制备得到的Ru@D-SeNPs的透视电镜图。
图3是实施例3中Ru@L-SeNPs和Ru@D-SeNPs细胞毒性图。
图4是激光共聚焦检测药物在细胞内的定位图。
图5是Western blot检测Ru@L-SeNPs、Ru@D-SeNPs负载MDR-siRNA后的基因沉默效率图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所用原料的纯度只要达到分析纯以上即可，来源均可从市场购得。
实施例1：[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-L-精氨酸修饰的纳米硒(Ru@L-SeNPs)和[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-D-精氨酸修饰的纳米硒(Ru@D-SeNPs)的制备
(1)[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4和[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4的制备方法
①cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O的合成
称取RuCl3·nH2O(0.78g，3mmol)，邻菲罗啉(1.2g，6mmol)和氯化锂(0.84g，14mmol)于三颈瓶中，加入5mL DMSO，在氩气保护下140℃加热回流8小时。冷至室温后，加入25mL丙酮，摇匀并冷冻过夜。抽滤，用冰水、冷的丙酮分别洗涤3次，置于真空干燥器干燥，得紫黑色微晶。粗产品用乙醇和水(V/V＝1:1)重结晶，产率0.96g(67％，以邻菲罗啉计算)。
cis-[Ru(bpy)2Cl2]2·H2O的合成，合成方法同上，以联吡啶0.935g代替邻菲罗啉，产率61％。
②4,4-二(2-咪唑[5,6-d][1,10]菲罗啉)联苯(bpibp)的合成
取4,4-联苯二甲醛(0.63g，3mmol)，菲罗啉-5,6-二酮(1.26g，6mmol)，乙酸铵(9.25g，120mmol)，和冰乙酸(100mL)溶于圆底烧瓶中回流3小时，冷至室温后，用40mL水稀释，小心滴加浓氨水至近中性，析出大量淡黄色沉淀。抽滤，先后用水、乙醚洗涤数次，真空干燥即得粗产品。粗产品用DMF重结晶。产率：48％(以菲罗啉-5,6-二酮计算)。
③称取cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O(0.3g，0.58mmol)溶于30mL乙二醇中加热30min使其溶解充分，然后向三颈瓶中加入bpibp(0.17，0.29mmol)，继续回流12h，溶液呈暗红色，冷却至室温后加入60mL水稀释。逐滴加入饱和的NaClO4溶液，立即产生大量的红色沉淀。搅拌均匀后静置1h使沉淀充分析出，然后将该溶液进行抽滤，用蒸馏水，乙醚分别洗涤3次后，放置真空干燥中干燥。粗产品中用中性氧化铝(200目)柱。用V(甲苯):V(乙腈)＝1:4混合溶剂作为洗脱液过柱，收集暗红色带组分，减压蒸去溶剂，即得到暗红色晶体。
将上述方法③中的原料cis-[Ru(phen)2Cl2]·2H2O换为cis-[Ru(bpy)2Cl2]·2H2O，即可制备得到[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4。
(2)将钌配合物[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4和[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4分别溶解于纯净水中配制成0.2mmol/L的储备液，并储存在4℃备用；
(3)取L-精氨酸、D-精氨酸分别溶解于纯净水配制成0.1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(4)取NaBH4溶解于纯净水制成0.5mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(5)将Na2SeO3溶解于纯净水配制成0.1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(6)分别取1mL Na2SeO3溶液、2mL L-精氨酸溶液和7mL超纯水混合，得到溶液A；将1mL NaBH4溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为9～11；继续搅拌0.5～1h，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得红色的L-精氨酸修饰纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶(Ru@L-SeNPs)。滴一滴在铜网上，并通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图1所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径约为100±2nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
(7)分别取1mL Na2SeO3溶液、2mL D-精氨酸溶液和7mL超纯水混合，得到溶液A；将1mL NaBH4溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为9～11；继续搅拌0.5～1h，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得D-精氨酸修饰的纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL的[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶(Ru@D-SeNPs)。滴一滴在铜网上，并通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)观察，如图2所示。得到纳米粒子的分散体系，其粒径约90±5nm。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例2：[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-L-半胱氨酸修饰的纳米硒和[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-D-半胱氨酸修饰的纳米硒的制备
(1)钌配合物储备液、Na2SeO3溶液的制备及浓度同实施例1；
(2)取L-半胱氨酸、D-半胱氨酸分别溶解于纯净水配制成1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(3)分别取1mL Na2SeO3溶液和8mL超纯水混合，得到溶液A；将1mLL-半胱氨酸溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为9-11；继续搅拌10～30min，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得红色L-半胱氨酸修饰的纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL的[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶。滴一滴在铜网上，通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)可观察到粒径约80±5nm的球型纳米颗粒。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
(4)分别取1mL Na2SeO3溶液和8mL超纯水混合，得到溶液A；将1mLD-半胱氨酸溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为9-11；继续搅拌10～30min，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得红色L-半胱氨酸修饰的纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL的[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶。滴一滴在铜网上，通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)可观察到粒径约80±5nm的球型纳米颗粒。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例3：[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2]4+-L-抗坏血酸修饰的纳米硒和[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2]4+-D-抗坏血酸修饰的纳米硒的制备
(1)钌配合物储备液、Na2SeO3溶液的制备及浓度同实施例1；
(2)取L-抗坏血酸、D-抗坏血酸分别溶解于纯净水配制成1mol/L的溶液，并储存在4℃备用；
(3)分别取1mL Na2SeO3溶液和8mL超纯水混合，得到溶液A；将1mLL-抗坏血酸溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为3～5；继续搅拌10～30min，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得红色纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL的[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶。滴一滴在铜网上，通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)可观察到粒径约70±5nm的球型纳米颗粒。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
(4)分别取1mL Na2SeO3溶液和8mL超纯水混合，得到溶液A；将1mLD-抗坏血酸溶液在不断搅拌下滴加到溶液A中，过程中保持pH值为3～5；继续搅拌10～30min，得酒红色纳米溶胶；离心，弃上清液，洗涤，干燥，得红色纳米硒颗粒。对所得纳米硒进行重悬得到10mL浓度为1mM的纳米硒溶液，在不断搅拌下加入2mL的[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液，室温下超声15min，得到钌配合物功能化的纳米硒溶胶。滴一滴在铜网上，通过TEANAI-10型透射电子显微镜(TEM)可观察到粒径约70±5nm的球型纳米颗粒。该纳米粒子能在室温下稳定存在，容易保存。
实施例4：作为抗肿瘤药物的体外实验
本实验选择两种购自ATCC公司的肿瘤细胞株，为肺癌细胞(A549)和耐药肺癌细胞(A549R)。
(1)MTT检测功能化纳米硒
取处于对数生长期的肿瘤细胞，调整活细胞浓度为1×104/mL加于96孔培养板，每孔100μL，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待贴壁后，再分别加入不同浓度(10μM、20μM、40μM、80μM)上述实施例制备得到的手性纳米硒复合材料溶液100μL，对照为等体积PBS溶液，加样组和对照组均设5个复孔，置37℃，5％CO2培养72h，然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，4h后用移液枪移去上层清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL/孔，振荡10min左右，用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝加药孔的实际OD值/对照孔的OD值；
细胞抑制率(％)＝100％-细胞存活率。
实验结果见图3。由图可见，本发明的[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-L-精氨酸修饰的纳米硒(Ru@L-SeNPs)或[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2]4+-D-精氨酸修饰的纳米硒(Ru@D-SeNPs)具有脂溶性和水溶性，易为人体吸收，在MTT试验中两者对肿瘤细胞均显示出较强的抑制作用，且Ru@L-SeNPs的抗肿瘤效果更好。
(2)激光共聚焦扫描显微镜检测药物在细胞内摄取和释放
①取按照实施例1～2制备得到的钌配合物功能化的纳米硒溶液分别和荧光标记的MDR-siRNA(表示为MDR-siRNAFAM)溶液(购买于上海吉玛生物有限公司)的混合，制备得到手性纳米硒复合材料负载siRNA(Ru@L-SeNPs-siRNAFAM和Ru@D-SeNPs-siRNAFAM)；其中钌配合物含量和siRNAFAM的负载量可通过调节原溶液的浓度调整。
②取细胞浓度为1×104/mL的A549R细胞接种在直径为15mm的共聚焦培养皿中，每个皿加入300μL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。待贴壁后，每个皿中加入上述Ru@L-SeNPs-siRNAFAM，使体系中含20μM钌配合物和200nM的MDR-siRNAFAM，分别在37℃下孵育细胞不同时间间隔(2h，4h和6h)。弃去培养基，细胞用PBS冲洗3次，并用LysoTracker溶酶体荧光探针染色1h后，再次用PBS洗涤3次。使用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜(LeicaMicrosystems公司，韦茨拉尔，德国)对样品的荧光进行检测。钌配合物的荧光信号(蓝色)和MDR-siRNAFAM(绿色)的激发波长为488nm，并发射范围分别是560～615nm和490～510nm。溶酶体荧光探针的荧光信号(红)激发为577nm并在590nm处检测。
Ru@L-SeNPs-siRNAFAM在细胞内摄取和释放情况如图4所示。研究开发荧光特性的siRNA载体，对体内基因治疗具有重要意义，激光共聚焦成像原理比较广泛应用，只是传统的载体不具有荧光，或者仅通过荧光染料标记形成的荧光弱且不稳定。本发明基于钌配合物的荧光特性，以及荧光增强原理，利用激光共聚焦扫描显微镜和活体细胞成像工作站，对载药体系进行了实时观测，成功实现了亚细胞定位功能。证实了通过钌配合物修饰制备的纳米载体，可以获得稳定的荧光特性，并且直观的发现，Ru@L-SeNPs-siRNAFAM具有更强的细胞吸收能力。A549R细胞处理2h，Ru@L-SeNPs-siRNAFAM很好的穿过细胞膜，并且siRNA、钌配合物在细胞内共定位，4h后，siRNA从载体中释放。
(3)Western Blot检测
通过Western Blot法检测相关耐药蛋白P-gp、Mrp、MT等(购买于Gene Tex公司)的表达量。具体方法：以1×105/mL细胞密度接种于内置无菌盖玻片的六孔板中，约24小时后，待细胞覆盖率达30～50％，加入准备好的手性纳米硒复合材料负载siRNA复合物100μL。48h后，胰酶消化、收集RNA干扰后细胞PBS洗涤3次；加入含l％蛋白酶抑制剂(proteinaseinhibitor cocktail)的细胞蛋白裂解液50μL，振荡混匀，冰浴30min；4℃离心15min，然后将离心后的上清分装，-20℃保存，备用。蛋白分离采用Tricine-SDS-PAGE体系，每泳道以30～60μg蛋白上样(按结果信号强弱定)，电转至硝酸纤维膜1h，5％脱脂牛奶封闭1h后加入不同蛋白的特异性抗体(购自Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗(购买于Gene Tex公司)孵育2h，最后用Kodak X-ray化学发光检测仪显色。每次实验均以β-actin作为内参校正。
Ru@L-SeNPs-siRNA在细胞内对相关蛋白的沉默效率如图5所示，对照组中P-gp、Mrp、MT等耐药相关蛋白都具有很高的表达水平，加入Ru@L-SeNPs-siRNA处理后，与对照组相比P-gp的表达量明显下调。对Mrp、MT的表达也有一定的下调作用。图5的结果表明，本发明制备的手性纳米硒复合材料具有良好负载siRNA沉默特定基因的作用，说明本发明的手性纳米硒复合材料能够作为负载基因药物的载体。
实施例4：作为抗肿瘤药物的体内实验
裸鼠(暨南大学动物保护和利用委员会，NO.SCXK2008-0002)4～6周龄，体重在15～20g之间。裸鼠在屏蔽的动物隔离器饲养，温度控制在28℃左右，湿度在40％左右。A549R肿瘤裸鼠模型均通过相应的肿瘤细胞构建而成。具体方法：实验用的裸鼠在皮下注射约106个肿瘤细胞，完全按照裸鼠饲养条件进行饲养，明显可见肿瘤组织时用于实验。利用已经建立的移植了A549R肿瘤的裸鼠为模型，分为实验组及空白组，对实验组小鼠进行系统的治疗：每三天尾部注射钌配合物功能化纳米硒、钌配合物功能化纳米硒负载siRNA 10mg，空白组不做处理。28天后，最后一次给药后对实验组及空白组小鼠进行活体成像研究，分别在2h、4h、8h对两组小鼠体内荧光分布进行拍照研究。最后，为了对活体荧光成像结果的准确性进行证实，对裸鼠进行解剖，对解剖后的裸鼠进行荧光成像，最后取出其部分器官进行荧光成像。
Ru@L-SeNPs-siRNA在活体内的荧光成像，对小鼠给药后，肿瘤部位的钌配合物的荧光逐渐增强，说明Ru@L-SeNPs-siRNA具有良好的肿瘤靶向作用以及在或体内的稳定性。实验结果表明，本发明制备的钌配合物功能化纳米硒，具有良好的肿瘤靶向性以及荧光的稳定性。说明本发明的钌配合物功能化纳米硒能够作为活体内负载基因药物的载体。Ru@L-SeNPs-siRNA在活体内的肿瘤抑制效果与对照组相比，加药组的肿瘤体积减小40～60％，说明本发明制备的钌配合物功能化纳米硒协同siRNA共同作用，能有效的抑制体内肿瘤的生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：其中手性纳米硒复合材料及其负载的siRNA均具有抑制肿瘤的活性，所述的siRNA为MDR-siRNA；
所述的手性纳米硒复合材料为手性钌配合物-X修饰的纳米硒，X为手性精氨酸、手性半胱氨酸或维生素C；
所述的MDR-siRNA序列为：
Sense strand: 5‘-AAGAAGGAAAAGAAACCAACUdTdT-3’；
Antisense strand: 5‘-dTdTUUCUUCCUUUUCUUUG GUUGA-3’；
所述的手性纳米硒复合材料通过如下方法制备得到：取Na2SeO3溶液、X溶液和水按1:1:8的体积比混合后，搅拌下滴加NaBH4溶液，持续搅拌，得到纳米溶胶，离心、洗涤、干燥，重悬于水中，得到纳米硒溶液，加入[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液，超声，离心、洗涤、干燥，得到手性纳米硒复合材料。
2.根据权利要求1所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的手性钌配合物为[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4。
3.根据权利要求1所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述手性纳米硒复合材料负载siRNA通过以下方法实现：把手性纳米硒复合材料溶于水中，搅拌下加入siRNA溶液，37℃，孵育0.5~1.5 h，得到手性纳米硒复合材料负载siRNA。
4.根据权利要求3所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所用手性纳米硒复合材料的量与siRNA的摩尔比为5:1~10:1。
5.根据权利要求1所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所用NaBH4的量与Na2SeO3的摩尔比为1:1~1:3；所用[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4或[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4的量与纳米硒的摩尔比为1:10~1:20。
6.根据权利要求1所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述Na2SeO3溶液的浓度为0.1~0.5 mol/L；所述X溶液的浓度为0.1~0.5 mol/L；所述NaBH4溶液的浓度为0.1~0.5 mol/L；所述[(phen)2Ru(bpibp)Ru(phen)2](ClO4)4溶液的浓度为0.2~0.5 mmol/L；所述[(bpy)2Ru(bpibp)Ru(bpy)2](ClO4)4溶液的浓度为0.2~0.5mmol/L。
7.根据权利要求1所述的手性纳米硒复合材料负载siRNA在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述手性纳米硒复合材料负载siRNA具有荧光特性，应用于靶向成像中。
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