CN107179403B - 一种功能化纳米硒探针及其制备方法和在制备诊断并治疗细菌感染药物中的应用 - Google Patents
一种功能化纳米硒探针及其制备方法和在制备诊断并治疗细菌感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于纳米硒抗菌材料制备技术领域，公开了一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针及其制备方法和在制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中的应用。本发明方法先通过向亚硒酸盐和谷胱甘肽的氧化还原系统中加入牛血清白蛋白制备得到纳米硒，再将抗菌肽片段PEP和钌配合物修饰在硒纳米表面上，得到功能化复合纳米探针Se@PEP‑Ru NPs。本发明探针具有高效的抗菌效果、稳定的荧光性能，及良好的生物相容性以及稳定性，而且可通过协同作用，增强抗菌活性；其充分利用抗菌肽、钌配合物及纳米硒三者特性，使其快速靶向并特异性分布，从而达到快速准确的诊断治疗细菌感染的目的，可应用于制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中。
Description
技术领域
本发明属于纳米硒抗菌材料制备技术领域，特别涉及一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针及其制备方法和在制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中的应用。
背景技术
细菌感染一直是人类健康的威胁，因此广泛使用抗生素来杀害及抑制细菌生长是消灭细菌感染的重要手段。但如果没有对细菌感染进行早期诊断而进行不恰当的抗生素治疗，不仅不能有效治疗细菌感染，还会导致更严重的细菌耐药性。因此对细菌感染进行早期诊断及治疗更是亟待解决的一大问题。
纳米载药技术的快速发展及其具有靶向给药、成像诊断、高效杀菌等联合治疗的潜能，可以极大地提高治疗效率，使正常组织受损最小化的功能为实现高效诊断治疗细菌感染带来了新希望。在细菌感染治疗的过程中，所制备的纳米给药系统可形成载药纳米复合物，通过靶向分子特异性靶向细菌细胞膜，从而选择性地在细菌感染部位累积，实现安全有效的识别诊断和靶向药物治疗。
现有技术中有关于纳米硒抗菌材料的制备，如一种功能化纳米硒，优选为槲皮素修饰的纳米硒、氯化乙酰胆碱修饰的纳米硒和槲皮素-氯化乙酰胆碱修饰的纳米硒中的至少一种，其可应用于制备抑菌、杀菌药物中。但是其仅仅可以用于抑制细菌及杀害细菌，却没有对细菌感染进行早期诊断，如果没有对细菌感染进行早期诊断而进行不恰当的治疗，不仅不能有效治疗细菌感染，还会导致更严重的细菌耐药性，治疗需要对症下药。导致上述缺点的原因是上述合成的功能化纳米硒中没有可以靶向到细菌感染部位的成分，也没有可以显示其靶向部位的荧光材料，因此只具有杀菌作用却不能诊断细菌感染。
纳米抗菌材料，例如银，氧化铜，氧化锌等纳米颗粒已经成为治疗细菌感染的潜在替代品，但是在很多纳米因为作用机制的不明确尚处于研究阶段，而纳米硒是被公认的安全有益的纳米。硒(Se)元素在人体内不可或缺，许多研究也表明硒的补充剂具有预防癌症和减少癌症发生概率的作用。然而，无机硒的生物利用度较低，因此合成纳米硒，使其不仅同时具有纳米材料与补充体内硒的优良性能，而且有着良好的生物相容性和低毒性。目前，关于硒纳米材料抗菌活性的报道并不多。
钌类配合物具有很高的发光效率和强度，因而被广泛应用于抗肿瘤等疾病的成像检测中，是一种良好的荧光探针。在许多研究中发现抗菌肽具有靶向细菌以及细菌引起的感染部位的作用。但是它们通常对于人体细胞和红细胞有毒性，而且在体内容易被分解，因此限制了它们的应用。
本发明提供一种功能化纳米硒复合材料其既可以用于识别诊断细菌感染并且具有高效治疗作用，可以用于制备抑菌和杀菌药物中。至今未发现有关功能化纳米硒负载抗菌肽和钌配合物用于制备具有识别诊断并高效治疗细菌感染药物的报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法。本发明方法通过向亚硒酸盐和谷胱甘肽的氧化还原系统中加入牛血清白蛋白制备新型纳米硒，这种包有牛血清蛋白的纳米硒不仅降低了复合纳米的尺寸而且可以增加其稳定性和生物相容性；然后将抗菌肽片段PEP和钌配合物修饰在硒纳米表面上合成功能化复合纳米探针Se@PEP-Ru NPs，充分利用三者特性使其快速靶向并特异性分布，从而达到快速准确的诊断治疗细菌感染的目的。
本发明另一目的在于提供上述方法制备的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针。
本发明再一目的在于提供上述负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针在制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，包括以下步骤：先通过向亚硒酸盐和谷胱甘肽的氧化还原系统中加入牛血清白蛋白(BSA) 制备得到纳米硒，再将抗菌肽片段PEP和钌配合物修饰在硒纳米表面上，得到功能化复合纳米探针Se@PEP-RuNPs。
进一步地，具体包括以下步骤：
(1)纳米硒(Se@BSA NPs，简写为Se NPs)的制备：将亚硒酸盐、谷胱甘肽及牛血清白蛋白于水中混合，利用碱液调节pH至中性，离心，得到红色沉淀纳米硒(Se NPs)。
(2)负载抗菌肽片段PEP的纳米硒(Se@PEP NPs)：将步骤(1)得到的纳米硒利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，再加入抗菌肽片段PEP搅拌反应，分离，得到Se@PEP NPs。
(3)负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针(Se@PEP-Ru NPs)：将钌配合物溶液加入到Se@PEP NPs水溶液中，碱性条件下搅拌反应，分离得到负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针。
本发明制备方法中所用亚硒酸盐、谷胱甘肽的摩尔比为1:3～1:5。
本发明制备方法中所用BSA的量与谷胱甘肽的质量比为5:1～5:3。
本发明制备方法所述的亚硒酸盐可为亚硒酸钠等。
本发明制备方法中所用PEP与纳米硒的摩尔比为1:4～1:6。
本发明制备方法中所述抗菌肽片段PEP为抗菌肽片段UBI29-41，其序列为TGRAKRRMQYNRR。
本发明制备方法中所用钌配合物与纳米硒的摩尔比为2:3～2:5。
本发明制备方法中所用钌配合物为Δ/Λ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O(Δ/Λ-OH)，分别命名为Ru1(Δ-OH)和Ru2(Λ-OH)。
本发明制备方法中制备时可采用Ru1或Ru2，分别得到Se@PEP-Ru1NPs 和Se@PEP-Ru2NPs。
本发明制备方法中所用钌配合物优选为Ru2。
步骤(1)中所述离心优选在12000～16000rpm离心10～15min。
步骤(1)中所述得到的红色沉淀优选使用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗涤多次。
步骤(1)中所述调节pH至中性优选pH为7.2。
步骤(2)中所用Se NPs、EDC、NHS的摩尔比为1:1.2:1.2～1:1.6:1.6。
步骤(2)中所述活化的时间优选为3～5h。
步骤(2)中所述活化优选在水溶液中进行。
步骤(2)中所述搅拌反应的时间优选为8～12h。
步骤(2)中所述分离优选在12000～16000rpm离心10～15min。
步骤(2)中所述得到的Se@PEP NPs优选使用PBS(0.01mol/L，pH 7.4) 洗涤多次。
步骤(3)中所述碱性条件至pH为9～11。
步骤(3)中所述搅拌反应的时间为2～5h。
步骤(3)中所述搅拌反应后得到液体溶胶，可于4℃储存备用；或放置 24小时以上，离心、洗涤、干燥，得到负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针颗粒。
步骤(3)中所述钌配合物使用前优选配置为2mM的储备液，并储存在4℃备用。
本发明方法制备得到的探针中采用抗菌性能优异的手性钌配合物，其同时具备稳定高效的荧光性能；负载的负载抗菌肽片段UBI29-41(PEP)是一个具有靶向细菌和真菌感染并且特异性在细菌内部积累功效的人工合成抗微生物肽片段，因此将其与钌配合物结合可以作为一个具有抗菌效果的靶向荧光探针。同时，为了解决靶向荧光探针的毒性以及不稳定性等问题，本发明将其共轭新型纳米硒颗粒，制备得到功能化复合纳米探针，该探针不仅具有良好的生物相容性以及稳定性，而且也可以起协同作用，增强抗菌活性。
本发明采用新方法获得新型的纳米硒，这种包有牛血清蛋白的纳米硒不仅降低了复合纳米的尺寸而且可以增加其稳定性和生物相容性。
本发明负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针充分利用三者特性使其快速靶向并特异性分布，从而达到快速准确的诊断治疗细菌感染的目的，可应用于制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中。
和现有技术相比，本发明的优点是能够对细菌感染部位具有特异性识别作用，从而达到诊断区分细菌感染的功能，并且表现出高效治疗细菌感染的效果。其中识别诊断体内细菌感染是因为本发明采用了具有识别作用的抗菌肽以及含有荧光及抗菌作用的钌配合物，形成了靶向荧光探针，此外，纳米硒可以与钌配合物起到协同抗菌作用，从而使得最终合成的功能化纳米硒治疗诊断平台不仅可以特异性靶向到体内细菌感染的部位，而且可以达到高效治疗细菌感染的效果。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明提供了一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针，其不仅具有杀死细菌及抑制细菌生长的作用，而且具有特异性识别诊断细菌感染的作用，适用于制备诊断治疗细菌感染药物。
(2)本发明首先制备得到一种新型的纳米硒，其不仅降低了复合纳米的尺寸而且可以增加其稳定性和生物相容性，还可以与钌配合物起到协同抗菌作用。
(3)本发明制备的新型纳米硒、抗菌肽修饰的纳米硒和抗菌肽-钌配合物修饰的纳米硒，直接将抗菌肽或钌配合物与新型纳米硒耦合，制备过程及产物体系简单，产品可直接保存和使用，且制备方法简便。
(4)本发明制备的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针添加具有荧光作用的钌配合物以及具有靶向作用的抗菌肽，具有良好的光稳定性和靶向性，可以靶向到细菌的细胞膜，从而增加与细菌的相互作用，从而达到更高的抗菌活性。本发明与现有技术相比，在技术上有检测其光稳定性以及靶向性。
附图说明
图1是钌配合物抗菌活性筛选以及所选的手性钌配合物结构图。其中，A 中的字母分别代表的钌配合物：a：Ru(phen)2(tip)](ClO4)2；b：Ru(bpy)2(tip)； c：[Ru(phen)2(py)2]Cl2；d：Δ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O(Δ-OH)；e：Λ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O(Λ-OH)；f：[Ru(bpy)2(5-idip)]2+；g： [Ru(phen)2(5-idip)]2+；h：[Ru(phen)2(p-MOPIP)](PF6)2·2H2O；B为配合物d和e 的结构式。
图2是三种功能性纳米硒(Se NPs、Se@PEP NPs和Se@PEP-Ru2NPs) 的透视电镜图。
图3是样品的体外抗菌实验MIC值图
图4和图5是样品的体外抗菌实验MTT图。
图6是样品的体外抗菌实验平板图。其中字母分别代表的样品为：a：Ru1； b：Ru2；c：Se@PEP-Ru1NPs；d：Se@PEP-Ru2NPs；e：不含NPs；f：Se NPs； g：Se@PEP NPs；h：Se@PEP-Ru2NPs。
图7是样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用效果(SEM)图。
图8和图9是功能化纳米硒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的识别诊断效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中涉及的物料均可从商业渠道获得。
抗菌肽片段PEP购买自南京莱昂生物科技有限公司。
钌配合物Δ/Λ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O(Δ/Λ-OH)参照硕士论文(杨喜成，手性钌(Ⅱ)配合物与人端粒序列G-4DNA的相互作用及对端粒酶活性的影响，《暨南大学》，2011)制备得到。
选择多种购自广东省菌种保藏中心的菌株，包括大肠杆菌(ATCC8739)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、枯草芽孢杆菌(ATCC6633)、绿脓杆菌 (ATCC27853)。
实施例1
(1)Se NPs的合成方法：1mL的亚硒酸钠(Na2SeO3)(25mM)与含有 20mg BSA的4mL谷胱甘肽(25mM)水溶液混合，常温下搅拌并用1.0mol 的氢氧化钠(NaOH)调节pH至7.2，则立即形成红色溶液，12000rpm离心 10min，收集红色沉淀。红色沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗3次，即得到Se@BSA NPs，简写为Se NPs。
(2)Se@PEP NPs的合成方法：上述得到的5mL浓度为25mM的Se NPs 水溶液在室温下用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(Se NPs：NHS：EDC的摩尔比是1:1.5:1.5)活化4h，把 28.17μL抗菌肽片段(UBI29-41)(5mM)加入活化的Se NPs水溶液中并在室温下搅拌12h，12000rpm离心10min，收集红色沉淀。红色沉淀用PBS(0.01mol/L， pH 7.4)洗3次，即得到Se@PEP NPs。
(3)Se@PEP-Ru NPs的合成方法：
根据文献制备得到钌配合物，并通过平板抗菌试验来进行钌配合物的筛选，结果见图1。筛选出抗菌效果最好的，最终综合比较选择抗菌效果较好的手性钌配合物d和e：Δ/Λ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O(Δ/Λ-OH)，分别简称为Ru1(d：Δ-OH)和Ru2(e：Λ-OH)。将Ru1和Ru2分别溶解于纯净水中配制成2mM的储备液，并储存在4℃备用。
分别取12.5μL两种手性钌配合物(2mM)储备液在不断搅拌下滴加到上述得到的5mL浓度为5mM的Se@PEP NPs水溶液中，过程中保持pH值为9～ 11；继续搅拌2～5小时，得到两种酒红色纳米溶胶(Se@PEP-Ru1NPs和 Se@PEP-Ru2NPs)。4℃下储存液体溶胶；或室温放置24小时，离心弃上清液，洗涤，干燥，得红色钌配合物功能化纳米硒颗粒。
对上述制备得到的Se NPs、Se@PEP NPs和Se@PEP-Ru2NPs进行透视电镜观察，结果见图2。
实施例2：功能化纳米硒作为抗菌药物的体外实验
(1)最低抗菌浓度(MIC)实验
对实施例1制备得到的Se NPs、Se@PEP NPs、Se@PEP-Ru1NPs、 Se@PEP-Ru2NPs及两个钌配合物Ru1、Ru2进行试验。
取对数期生长的细菌，将细菌稀释浓度约1×106CFU/mL。然后将上述六种样品稀释成一系列浓度分别加入到含菌培养基中，置37℃共同孵育8h。通过酶标仪测定600nm处的光密度值进行评估(OD600值)。在受试样品中浊度最接近对照组浊度的最低浓度即为最小抑菌浓度，每个实验平行三个，结果见图3。
实验结果：最低抑制浓度(MIC)值是评价给定抗菌剂的细菌易感性的重要参数。MIC越低，细菌易感性越高，因此抗菌活性越强。Se NPs，Se@PEP NPs，Ru1，Se@PEP-Ru1NPs，Ru2和Se@PEP-Ru2NPs对两种革兰氏阳性菌 (金黄色葡萄球菌和枯草杆菌)和两种革兰氏阴性菌(绿脓杆菌和大肠杆菌) 的MIC被测定。不同样品对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为184、64、13、6、 8.5和4μg/mL。不同样品对枯草杆菌的MIC值分别为156、84、12、7、8和 4.5μg/mL。不同样品对铜绿假单胞菌的MIC值分别为256、128、32、16、14 和7μg/mL，不同样品对大肠杆菌的MIC值分别为240、116、28、12、9和5μg/mL。从中可以看出，纳米硒对革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度(MIC)较低，说明对其抗菌效果比较明显。其中，Se@PEP-Ru2NPs显示出最好的有效抗菌活性。
(2)MTT测试方法
取处于对数生长期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌(S.aureus和E.coli)分别在LB培养基中在37℃下在摇床上以200rpm培养6小时。然后将细菌用 LB培养基稀释至浓度为106CFU/mL。向96孔板的每个孔中加入被稀释后的细菌(10μL，106CFU/mL)。再分别加入不同浓度10μL六种样品溶液(Se NPs，Se@PEP NPs，Ru1，Se@PEP-Ru1NPs，Ru2和Se@PEP-Ru2NPs)，阴性对照为等体积PBS缓冲液，加样组和对照组均设4个复孔置于37℃，培养24h，然后加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，在空气振荡培养箱中继续培养4h，然后加入三联溶液100μL孔，采用振荡器使其混合均匀，然后继续在37℃下培养，放置过夜。用酶标仪在570nm波长下测定OD值。计算细胞存活率，结果见图4和图5。
细菌存活率(％)＝加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；
细菌抑制率(％)＝100％-细胞存活率。
实验结果：MTT实验结果表明，随着浓度的增加，S.aureus和E.coli的存活度明显降低，说明其具有浓度依赖性，在浓度为16μg/mL时，Se@PEP-Ru1 NPs和Se@PEP-Ru2NPs分别能杀死80％和90％以上的细菌，表明浓度为 16μg/mL时细菌存活率最低，为最适宜抑制浓度。
(3)平板稀释法抑制细菌生长实验
利用抑菌圈的大小直观的观察Ru1，Ru2，Se@PEP-Ru1NPs，Se@PEP-Ru2 NPs和SeNPs，Se@PEP NPs，Se@PEP-Ru2NPs的抑菌效果。在没有NPs的情况下进行的测定用作对照。取对数期(OD600nm 0.5)的细菌，用LB培养基稀释至1.0×107CFU/mL。取20μL稀释后的菌液加入到LB培养基中，然后均匀的铺在平板上等培养基凝固后，再将浸泡不同样品(浓度为16μg/mL)的纸片放在培养基上，在37℃下培养过夜(每组至少三次重复)。通过观察抑菌圈大小来判断抗菌活性。观察实验结果见图6。
实验结果：平板实验结果表明Se@PEP-Ru1NPs和Se@PEP-Ru2NPs有明显的抑菌效果，而Se@PEP-Ru2NPs的效果最好。细菌生长的抑制取决于所治疗的药物，Se@PEP-Ru2NPs抑菌效果比单独的Ru2以及Se@PEP NPs更好，表明其有很好的协同抗菌的能力，而且Se@PEP-Ru2NPs对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)显示出比革兰氏阴性菌(大肠杆菌)有效的抑制能力，
实施例3：功能化纳米硒破坏细菌细胞膜实验
将对数期的细菌收集，并用PBS洗涤两次，然后分别加入20μL浓度为16μg/mL的SeNPs、Se@PEP NPs和Se@PEP-Ru2NPs(16μg/mL)在37℃下在摇床上以200rpm共同孵育2小时。在5000rpm离心5分钟收集细菌，用PBS 洗涤3次，然后在4℃下用2.5％戊二醛溶液固定2小时。将样品脱水，依次用 50、70、85、90和100％乙醇处理10分钟，镀金，用扫描电子显微镜(SEM) 观察细菌形态的变化，结果见图7。
实验结果：SEM结果显示，对照组S.aureus和E.coli的具有平滑和完整的细胞壁的球形形态，并没有太大的变化。分别加入三种样品处理后，可以看到 S.aureus和E.coli的形态发生不同的变化，加入Se NPs和Se@PEP NPs后，两种细菌出现凹陷和萎缩；而加入Se@PEP-Ru2NPs孵育2小时后，细菌的细胞壁变皱和损伤，细胞的形状和尺寸也发生了巨大的变化。此外，对于大多数细菌细胞，可以观察到细胞内内容物的渗漏。这证实Se@PEP-Ru2NPs与革兰氏阳性细菌以及革兰氏阴性细菌细胞膜强烈相互作用，先破坏细菌细胞壁后再严重破坏细菌细胞膜和细胞质膜完整性从而杀死细菌。
实施例4：功能化纳米硒识别诊断细菌感染
为了研究功能性纳米硒Se@PEP-Ru2NPs的靶向能力，建立了单一感染小鼠模型：将金黄色葡萄球菌或大肠杆菌(107～109CFUs)在250mL盐水中的悬浮液注射到右腋窝(注射深度5mm)中。1天后，通过尾静脉给小鼠注射 Se@PEP-Ru2NPs(16.0μg/mL)。小鼠注射Se@PEP-Ru2NP后48小时内，分别在预定时间(0小时，0.5小时，2小时，4小时，6小时，8小时，12小时，24小时和48小时)采用IVISLumina成像系统(Xenogen(Caliper Life Sciences)，Hopkinton，MA，USA)捕获荧光图像，荧光信号通过横向位置470nm下激发滤波器和DsRed发射滤波器获得。为了进一步比较针对细菌的探针的靶向能力，在不同的时间用Scion Image软件ROI函数计算不同情况下(细菌感染正常组织、炎症感染正常组织、癌症正常组织)不同对比度，背景荧光的测量是将注射后的荧光减去注射前的荧光。结果见图8和图9。
实验结果：图8是在该小鼠模型上细菌感染的体内成像的示意图。如图所示，在单一感染小鼠模型48h内获得的荧光图像中可以看出，Se@PEP-Ru2NPs 纳米探针在注射0.5h内迅速分布在小鼠身体各个部位，在注射4h后可以清楚地检测到感染部位的明显的荧光，在注射8h后感染部位荧光强度达到最高，而此时肝脏和肾脏部位的荧光逐渐减弱，感染部位的荧光信号高对比度的维持到48h，并且纳米颗粒大部分都已经通过肝肾部位排除体外。图9是小鼠感染组织与正常组织比例随时间的关系图，表明感染的组织与正常组织在感染后 8h产生最大的感染正常比例，并且高对比度的持续了48h，很好的与图8结果相符合。表明了Se@PEP-Ru2NPs可以敏感的反映小鼠体内两种细菌的感染，也说明其具有很好的识别诊断细菌感染的能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 一种功能化纳米硒探针及其制备方法和在制备诊断并治疗细菌感染药物中的
应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗菌肽片段UBI29-41的序列
<400> 1
Thr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Met Gln Tyr Asn Arg Arg
1 5 10
Claims (8)
1.一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：先通过向亚硒酸盐和谷胱甘肽的氧化还原系统中加入牛血清白蛋白制备得到纳米硒，再将抗菌肽片段PEP和钌配合物修饰在硒纳米表面上，得到功能化复合纳米探针Se@PEP-Ru NPs；
具体包括以下步骤：
(1)纳米硒的制备：将亚硒酸盐、谷胱甘肽及牛血清白蛋白于水中混合，利用碱液调节pH至中性，离心，得到红色沉淀纳米硒；
(2)负载抗菌肽片段PEP的纳米硒：将步骤(1)得到的纳米硒利用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加入抗菌肽片段PEP搅拌反应，分离，得到负载抗菌肽片段PEP的纳米硒；
(3)负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针：将钌配合物溶液加入到负载抗菌肽片段PEP的纳米硒水溶液中，碱性条件下搅拌反应，分离得到负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针；
所用亚硒酸盐、谷胱甘肽的摩尔比为1:3～1:5；所用牛血清白蛋白与谷胱甘肽的质量比为5:1～5:3；
所述抗菌肽片段PEP为抗菌肽片段UBI29-41，其序列为TGRAKRRMQYNRR；
所述钌配合物为Δ/Λ-[Ru(phen)2(p-HPIP)](ClO4)2·2H2O，Δ/Λ-OH，分别命名Δ-OH为Ru1和Λ-OH为Ru2。
2.根据权利要求1所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于：所用PEP与纳米硒的摩尔比为1:4～1:6；所用钌配合物与纳米硒的摩尔比为2:3～2:5。
3.根据权利要求1所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于：所述的亚硒酸盐为亚硒酸钠。
4.根据权利要求1所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述离心为在12000～16000rpm离心10～15min；所述调节pH至中性指pH为7.2。
5.根据权利要求1所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所用纳米硒、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.2:1.2～1:1.6:1.6；所述活化的时间为3～5h；所述搅拌反应的时间为8～12h；所述分离为在12000～16000rpm离心10～15min。
6.根据权利要求1所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述碱性条件指pH为9～11；所述搅拌反应的时间为2～5h。
7.一种负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针，其特征在于根据权利要求1所述的制备方法得到。
8.权利要求7所述的负载抗菌肽和钌配合物的功能化纳米硒探针在制备具有识别诊断并治疗细菌感染药物中的应用。
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