CN108484715B - 一种蛋白结合型纳米硒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蛋白结合型纳米硒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种蛋白结合型纳米硒及其制备方法和应用。该制备方法是将含二硫键的蛋白或多肽在二硫键还原剂的还原作用下将其内部空间结构打开后，获得具有还原活性的巯基群，然后部分巯基还原硒化合物为单质硒，其余巯基重新形成分子内和分子间的二硫键，自组装成蛋白结合型纳米硒；大大改善纳米单质硒在溶液中的分散和稳定性。动物实验表明，这种活性红色单质硒生物利用度大而急性毒性很低。本发明方法制备的蛋白结合型纳米单质硒，可以发挥结合蛋白和纳米硒的双重作用，纳米粒径小，分布范围窄，可以液相保存，有利于口服、注射或喷雾使用。

Description

一种蛋白结合型纳米硒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白结合型纳米硒及其制备方法和应用。
背景技术
硒是人体必需微量元素。硒具有抗氧化、调节免疫、拮抗有害重金属等重要生物功能。缺硒与40多种疾病相关，特别严重的如AIDS、乙型肝炎、肝癌、克山病、大骨节病、心脑血管疾病等。适当补硒则可以有效防控有关的疾病。关于正常人群的硒摄入量标准，世界卫生组织(WHO)规定为40～100μg/d，中国营养学会推荐为60～200μg/d，加拿大规定为98～224μg/d。世界上40多个国家和地区缺硒或低硒，中国约72％的地区，2/3的人口居住在低硒或缺硒地区。中国13省市的营养调查结果表明，成人每天的摄取硒仅为26μg，严重处于缺硒状态。因此，中国居民是普遍缺硒。
1985年，Nuttal首次提出了胶体状态的红色单质硒具有生物学活性的假说，但一直缺研究证据。1998年，张劲松等人在蛋白质或多肽溶液体系中使用还原剂还原硒化合物得到分散在蛋白质或多肽中的纳米红色硒，经过分离和干燥得到纳米硒(CN1059638C)。试验研究表明，纳米硒的生物利用度更好，毒性更小，生物活性更高；如对抗CCL4诱发的急性肝损伤，显著抑制肿瘤体积、转移和提高免疫等；“硒旺”胶囊被国家卫生部批准为保健食品(卫食健字1998第134号)。2002年，张胜义等申请了褪黑素纳米硒及其制备方法(CN1415309)、葡苷聚糖纳米硒及其制备方法(CN1415241A)、甲壳素纳米硒及其制备方法(CN1415310)和氨基酸纳米硒及其制备方法(CN1415308A)的专利，其产品均是某种模板剂(如褪黑素、葡聚糖、甲壳素及混合氨基酸)和红色纳米硒组成的复合物，且产品必需以固体形式保存。2003年，郑文杰等采用维生素C直接还原法制备了可在液相中保存的溶胶状的纳米单质硒(CN100496484C)；2005年，郑文杰等用藻蓝蛋白自身的抗氧化性质还原+4价硒为0价硒形成复合型纳米硒(CN1947792B)；2007年，郑文杰等以氨基酸为模板构建了氨基酸和纳米单质硒复合物的制备(CN101040869A)。
以上有关发明专利所涉及的制备方法分二类，一类是以蛋白质、多肽、葡聚糖、褪黑素、甲壳素及混合氨基酸为模板获得复合纳米硒；另一类就是将具有抗氧化活性的藻蓝蛋白直接还原硒化合物获得复合纳米硒；从这些制备的工艺来说，均是以模板蛋白分子和还原剂同时与硒化合物进行反应获得，产生的硒纳米复合物为模板分子的表面吸附为主，相对容易聚集，影响纳米硒在溶液状态下的长期保存、温度限定和运输，因而限制了纳米硒的营养和医药推广价值。针对上述这些问题，如何改善纳米硒在溶液状态下的长期保存时间及温度的限定，是纳米硒迫切需要解决的科学问题。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的首要目的在于提供一种蛋白结合型纳米硒的制备方法，该方法操作简单，以在二硫键还原剂酶切开的蛋白内部二硫键得的巯基群为反应器和载体，介导硒化合物在蛋白内部还原成纳米硒，然后在过量巯基群的自组装下，获得尺寸均一，分散性好，保存温度范围广，保存时间长及及在胃酸、肠液和血浆中具有良好稳定性的新型蛋白结合型纳米硒制剂，大大改善纳米单质硒在溶液中的分散和稳定性。
本发明的另一个目的在于提供一种上述制备方法得到的蛋白结合型纳米硒，该蛋白结合型纳米硒富含巯基蛋白/多肽，易于常温保存。
本发明的再一目的在于提供一种上述蛋白结合型纳米硒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种蛋白结合型纳米单质硒的制备方法，该制备方法是将含二硫键的蛋白或多肽在二硫键还原剂的还原作用下将其内部空间结构打开后，然后与硒化合物进行混合，再透析分离，获得蛋白结合型纳米单质硒。
所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME)、三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)、半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)，更加优选为TCEP或GSH；
所述含二硫键的蛋白或多肽为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上，更加优选为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白或卵白蛋白；
所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。
上述的制备方法，具体包括如下步骤：
A、将含二硫键的蛋白或多肽的溶液，与二硫键还原剂溶液混合，进行反应，得到空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向步骤A得到的蛋白均质溶液中加入硒化合物的溶液，充分搅拌，得到蛋白结合型纳米单质硒的粗溶液；
C、将步骤B得到的粗溶液进行透析，得到蛋白结合型纳米单质硒纳米制剂。
步骤A所述含二硫键的蛋白或多肽的溶液浓度为0.01～200mg/mL，进一步优选为0.5～100mg/mL，更进一步优选为1～80mg/mL；
步骤A所述二硫键还原剂溶液是指二硫键还原剂的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0，其浓度为0.01～60mM，更优选为0.1-40mM；
步骤A所述反应的温度为10-60℃，反应的时间为10-300min；更优选地，反应的温度为20-40℃，反应的时间为30-200min。
步骤A所述空间结构展开的蛋白均质溶液中蛋白的终浓度为0.01～100mg/mL。
步骤B所述硒化合物的溶液的浓度为0.01～30mM；
步骤B所述向步骤A得到的蛋白均质溶液中加入硒化合物的溶液，获得蛋白溶液中蛋白的终浓度为0.01～100mg/mL；
步骤B所述充分搅拌是在0-40℃下搅拌0.1～24h。
步骤C所述透析是将粗溶液放入透析袋，并于0-20℃低温PBS溶液中透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000。
一种由上述的制备方法制备得到的蛋白结合型纳米单质硒。
所述蛋白结合型纳米单质硒中的硒与白蛋白的摩尔分子比为(1～30)：1，粒径分布范围为10～200nm，优选地，硒与白蛋白的摩尔分子比为(2～20)：1；粒径分布范围为10～100nm。
所述蛋白结合型纳米单质硒在0～10℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达12个月，在10～40℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达4个月。
所述蛋白结合型纳米单质硒在pH值1-3的胃蛋白酶溶液、pH值6.8的肠胰酶溶液，或替代血浆中以均一形式稳定存在。
上述的蛋白结合型纳米单质硒在制备缺硒或硒功能治疗药物中的应用。所述药物可以为口服制剂也可以为非口服制剂。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明采用具有可生物吸收降解、完全生物相容、良好溶解性、低维纳米尺寸、长半衰期的富含巯基蛋白为载体，在二硫键还原剂酶切作用下，获得蛋白内部二硫键暴露的巯基群为反应器，介导硒化合物在蛋白内部还原成纳米硒，然后在过量巯基群的自组装下，获得操作简单，尺寸均一，分散性好，保存温度范围广，保存时间长及在胃酸、肠液和血浆中具有良好稳定性的新型蛋白结合型纳米硒制剂，大大改善纳米单质硒在溶液中的分散和稳定性。同时，安全性实验表明，与亚硒酸钠比较，蛋白结合型纳米硒具有更好的安全性，高剂量的急性肝损伤和短期毒性均最小；与生物利用度好的硒蛋氨酸比较，蛋白结合型纳米硒的口服生物利用度更好。
附图说明
图1为蛋白结合型纳米单质硒的制备方法示意图。
图2为蛋白结合型纳米单质硒的DLS图。
图3为蛋白结合型纳米单质硒的TEM图。
具体实施方式
以下通过实施案例对本发明做进一步的阐述，但本发明不限于此。实验者可根据实际需要单独修饰靶向分子等，从而可以获得类似的蛋白结合型纳米硒制剂。
以下实施例使用的载体为优选的人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白BSA和转铁蛋白TF，示范为基本的HSA在二硫键还原后，获得富巯基的蛋白反应器，然后加入亚硒酸钠还原为零价硒，同时诱导过量的巯基靠近进行自组装成纳米颗粒。
实施例1蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的人血清白蛋白(HSA)溶解于10mM的GSH新鲜溶液(GSH的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应100min，搅拌，获得蛋白的终浓度为50mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入15mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为30mg/mL，4℃搅拌12h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与HSA的摩尔分子比为20:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀(见图2和图3)，平均粒径约30-40nm。
实施例2蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的人血清白蛋白溶解于20mM的GSH新鲜溶液(GSH的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在20℃条件下反应20min，搅拌，获得蛋白的终浓度为50mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入20mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为20mg/mL，20℃搅拌1h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与HSA的摩尔分子比为10:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约30-40nm。
实施例3蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的人血清白蛋白(HSA)溶解于10mM的TCEP新鲜溶液(TCEP的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应30min，搅拌，获得蛋白的终浓度为70mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入25mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为50mg/mL，4℃搅拌6h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与HSA的摩尔分子比为14:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约40-50nm。
实施例4蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的人血清白蛋白(HSA)溶解于5mM的TCEP新鲜溶液(TCEP的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应50min，搅拌，获得蛋白的终浓度为80mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入20mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为50mg/mL，4℃搅拌2h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与HSA的摩尔分子比为18:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约40-50nm。
实施例5蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的人血清白蛋白(HSA)溶解于6.5mM的DTT新鲜溶液(DTT的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应20min，搅拌，获得蛋白的终浓度为60mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入30mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为40mg/mL，4℃搅拌3h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与HSA的摩尔分子比为12:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约30-60nm。
实施例6蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的牛血清白蛋白(BSA)溶解于20mM的GSH新鲜溶液(GSH的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应70min，搅拌，获得蛋白的终浓度为80mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入25mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为60mg/mL，4℃搅拌4h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与BSA的摩尔分子比为10:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约20-40nm。
实施例7蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的牛血清白蛋白(BSA)溶解于8mM的TCEP新鲜溶液(TCEP的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在30℃条件下反应60min，搅拌，获得蛋白的终浓度为90mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入10mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为50mg/mL，4℃搅拌8h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与BSA的摩尔分子比为10:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约40-50nm。
实施例8蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的制备，如图1所示：
A、将浓度为0.01～100mg/mL范围内的转铁蛋白(TF)溶解于30mM的GSH新鲜溶液(GSH的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0)中，在20℃条件下反应90min，搅拌，获得蛋白的终浓度为90mg/mL的空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向空间结构展开的蛋白均质溶液中加入28mM的亚硒酸钠溶液，获得白蛋白溶液中蛋白的终浓度为50mg/mL，4℃搅拌8h，得淡红色的蛋白结合型纳米单质硒粗溶液；
C、将蛋白结合型纳米单质硒粗溶液放入透析袋，透析分子截留不低于1000，并于0-20℃低温PBS溶液透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物，获得蛋白结合型纳米单质硒。
将所得蛋白结合型纳米单质硒进行50％硝酸50-70℃消化，经过ICP-MS检测未载药的透析液，Se与TF的摩尔分子比为8:1。得到的蛋白结合型硒纳米颗粒PSe纳米尺寸均一，分布均匀，平均粒径约30-40nm。
实施例9蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的表征和鉴定：
针对前述实施例1和实施例2获得的蛋白结合型纳米单质硒(PSe)和人血清白蛋白(HSA)分别进行动态光散射(Dynamic Light Scattering)DLS测定白蛋白颗粒纳米尺寸的水合粒径，从DLS分析结果来看，HSA和PSe水合粒径大约为10nm和100nm左右，且分散性良好，PDI值均<0.3，具体如图2。同时，对实施例1获得的蛋白结合型纳米单质硒进行了透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope)TEM确证，扫描结果表明其干燥后的纳米尺寸约20nm左右，具体如图3。
实施例10蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的保存放置时间稳定性评价：
针对前述实施例1所制得的PSe在4，10，20和30℃条件下，放置不同时间，对其纳米的水合粒径和透明度进行考察，然后进行统计分析，发现其可以在不同温度条件下长期稳定保存(具体见表1和表2)。
表1不同温度和周期下的澄清透明度观察
Figure BDA0001584723760000081
表2不同温度和周期下的纳米粒径检测(平均值±SD)
Figure BDA0001584723760000082
Figure BDA0001584723760000091
实施例11蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的抗胃液、肠液和血浆中的稳定性评价：
参考中国药典，配置人工胃液，即取稀盐酸16.4ml，加水约800mL，再加入10g胃蛋白酶(活性效价不小于3000)，搅拌摇匀稀释至1000mL，得人工胃液缓冲液。
参考中国药典，配置人工肠液，即取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至6.8；另取胰酶pancreatin10g，加水适量溶解，然后将两液混合，加水稀释到1000mL，得人工肠液缓冲液。
实验所用血浆为临床所用的替代血浆样品。
针对前述实施例1所制得的PSe，分别取0.5mL稀释至2mL，加入截留分子量为3500的millipore透析管中，放入1L的模拟缓冲液中，37℃条件下，搅拌，分别在0，0.5，1，2，4，8和16小时下取样进行ICP-MS的含量分析，具体结果如下表3所示。结果表明，PSe在人工模拟液中稳定，对口服或注射具有非常好的科学支撑。
表3不同时间作用后检测的PSe浓度(平均值±SD)
Figure BDA0001584723760000092
实施例12蛋白结合型纳米单质硒(PSe)的小鼠生物利用度和体内活性评价：
采用本发明实施例1-8所得蛋白结合型纳米单质硒对小鼠的急性毒性进行测试，PSe的LD50为167.9mg Se/kg BW(body weight)；硒蛋氨酸的LD50为77.4mg Se/kg BW；而无机硒亚硒酸钠的LD50为16.5mg Se/kg BW；结果说明，蛋白结合型PSe硒比亚硒酸钠的急性毒性剂量低9倍多；比硒蛋氨酸也要更加安全。
对细胞活性的影响在强氧化剂H2O2诱导毒性时，PSe的细胞保护效应高于亚硒酸钠，在30ng/mL时与亚硒酸钠相比即具有显著意义。对人肝癌细胞株则表现出一定程度的生长抑制效应，而且PSe比亚硒酸钠的效应更为明显。
对细胞硒酶活性的影响PSe在高剂量时对GPx酶活性的增强作用比亚硒酸钠高，对TR的效应则低于亚硒酸钠。RT-PCR检测对硒酶GPx1，GPx4基因的表达影响，发现口服PSe对小鼠肝脏组织中的GPx1，GPx4基因具有显著上调作用，增加为2.5-3.1倍。
小鼠生物利用度评价发现，与硒蛋氨酸和非结合型纳米硒口服比较，PSe硒具有口服更好的生物利用度，分别高2.4～4.3倍。
小鼠不同组织器官中硒的含量，PSe硒对缺硒小鼠血及组织硒水平均具有明显提高作用，对小鼠肝、血和肾中硒水平的提高作用相对较快。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种蛋白结合型纳米单质硒的制备方法，其特征在于：该制备方法是将含二硫键的蛋白或多肽在二硫键还原剂的还原作用下将其内部空间结构打开后，然后与硒化合物进行混合，再透析分离，获得蛋白结合型纳米单质硒；具体按照以下步骤：
A、将含二硫键的蛋白或多肽的溶液，与二硫键还原剂溶液混合，进行反应10-300min，得到空间结构展开的蛋白均质溶液；
B、向步骤A得到的蛋白均质溶液中加入硒化合物的溶液，充分搅拌0.1～24h，得到蛋白结合型纳米单质硒的粗溶液；
C、将步骤B得到的粗溶液进行透析，得到蛋白结合型纳米单质硒纳米制剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述二硫键还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或谷胱甘肽；
所述含二硫键的蛋白或多肽为人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、驴血清白蛋白、转铁蛋白中的一种以上；
所述硒化合物为二氧化硒、亚硒酸盐或硒酸盐。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤A所述含二硫键的蛋白或多肽的溶液浓度为0.01～200mg/mL；所述二硫键还原剂溶液是指二硫键还原剂的磷酸盐缓冲液，pH值为5.0-9.0，其浓度为0.01～60mM；所述反应的温度为10-60℃；所述空间结构展开的蛋白均质溶液中蛋白的终浓度为0.01～100mg/mL。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤B所述硒化合物的溶液的浓度为0.01～30mM；所述向步骤A得到的蛋白均质溶液中加入硒化合物的溶液，获得蛋白溶液中蛋白的终浓度为0.01～100mg/mL；所述充分搅拌是在0-40℃下搅拌。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤C所述透析是将粗溶液放入透析袋，并于0-20℃低温PBS溶液中透析除去多余的二硫键还原剂和硒化合物及其副产物；透析分子截留不低于1000。
6.一种由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的蛋白结合型纳米单质硒，其特征在于：所述蛋白结合型纳米单质硒中的硒与白蛋白的摩尔分子比为(1～30)：1，粒径分布范围为10～200nm；所述蛋白结合型纳米单质硒在0～10℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达12个月，在10～40℃下的水溶液中以均一分散形式保存长达4个月；所述蛋白结合型纳米单质硒在pH值1-3的胃蛋白酶溶液、pH值6.8的肠胰酶溶液，或替代血浆中以均一形式稳定存在。
7.根据权利要求6所述的蛋白结合型纳米单质硒在制备缺硒或硒功能治疗药物中的应用。
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