CN110692651A - 一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于金属纳米材料技术领域，具体公开了一种抗菌纳米探针BSA@AuNc‑AMP‑Ce6及其制备方法和应用。通过Au‑S键将Ce6标记的抗菌肽连接到BSA@AuNc上，在多肽序列中PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断。引入光敏剂Ce6进行PDT抗菌，利用它在激光的照射下，产生活性氧(ROS)，导致微生物分子的氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用。本发明制备的抗菌纳米探针BSA@AuNc‑AMP‑Ce6具有较传统抗菌肽更优异的抗菌性能，并且生物相容性好，对机体细胞的正常生理活动干扰小，毒性低，安全性高。

Description

一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于金属纳米材料技术领域，具体涉及一种具有抗菌性能以及光动力治疗的新型纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用。
背景技术
近年来随着科技的发展，荧光纳米材料由于在量子尺寸效应、等离子共振效应及量子隧道效应等方面的特性，展现出与众不同的光学、化学、电学以及催化性能，使其在科学界备受关注。目前已研究发现的荧光纳米材料主要有:有机染料、碳量子点、聚合物点、半导体量子点、荧光金属纳米簇(FM NCs)等。目前，研究发现的荧光金属纳米簇已有多种，例如铂纳米簇、金纳米簇、银纳米簇、铜纳米簇以及各种合金纳米簇等。由于荧光金属纳米簇合成方法较为简单、荧光强度较强、同生物分子具有良好的相容性且稳定性较好，使其在环境监测、生物成像、疾病监测、催化、光电学等多个领域具有广阔的前景。因此，研发荧光性强、毒性小、合成简便经济的荧光金属纳米簇及其应用对快速发展的现代经济社会有着重要的意义。
抗菌肽(Antimicrobial Peptides AMPs)又称微生物肽或肽抗生素，被誉为天然抗生素，由多种组织及细胞产生，为大多数生物提供第一道防线。大部分AMPs一般由10～60个氨基酸残基组成，分子量在3～6KDa之间，显示出0至+7的不同净电荷，31％～70％之间的疏水百分比。如今世界各地的抗生素耐药性问题已日渐增长，人们对抗生素要求大大提升，然而细菌耐药性的发展速度远远超过对抗生素的研究，抗菌肽以它独有的优势脱颖而出。
光动力治疗是指在特定激发波长的照射下，光敏剂产生活性氧(ROS)，ROS会对生物分子(蛋白质、脂质和核酸)产生氧化作用，导致细胞死亡。光动力治疗产生作用主要基于以下三点：光敏剂(PS)、光和氧气，这三种组分的相互作用导致产生活性氧(ROS)。
随着科学技术的不断发展，制备纳米级光敏剂或者将光敏剂负载在纳米材料上进行杀菌，被称为纳米光动力杀菌技术，近年来受到了广泛的关注。但是，现有的光敏剂负载在纳米材料上，仅仅依靠光敏剂杀菌，杀菌效果不明显。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明将抗菌肽与光敏剂同时固定在纳米团簇上，提供一种BSA@AuNc-AMP-Ce6复合纳米抗菌材料，本发明制备的抗菌复合材料在抑菌、杀菌领域均有广泛的应用前景。
本发明的具体技术方案如下所述：
抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6由牛血清蛋白还原和保护的金纳米团簇(BSA@AuNc)、抗菌肽和光动力治疗分子组成。
制备抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6采用的金纳米团簇，由牛血清蛋白还原和保护，其最大发射为650nm，粒径约为13nm，电位约为-24mV。
抗菌肽GKRWWKWWRRPLGVRGC(简写AMP)，其中PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断。采用常规的固相Fmoc法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。
光动力治疗分子为光敏剂Ce6，Ce6标记抗菌肽(AMP-Ce6)的方法为：称取相当于带有多肽(序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC)的树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经过HPLC进行纯化，并通过质谱进行分析。
本发明抗菌纳米探针的制备方法为，通过Au-S键将Ce6标记的抗菌肽连接到BSA@AuNc上。具体为：将透析过的BSA@AuNc与Ce6标记的抗菌肽样品混合，放入摇床，250r，反应20小时，即取金簇样品(BSA@AuNc)400μL(4μM)，加入200μL(900μM)的AMP-Ce6混合。将反应后合成的样品进行透析处理24小时，样品最终分散在去离子水中。
其中，BSA@AuNc的合成方法为：将5ml BSA(50mg/ml)与5ml HAuCl4(10mM)分别37℃水浴10min，然后将HAuCl4滴加到BSA中，2min后，将500μL NaOH溶液(1M)滴加到上述溶液中，然后37℃下搅拌12h。将样品放入透析袋(12-14KD)，在水里透析20小时，最终将溶液分散在水中。
将Ce6连接到BSA@AuNc上之后，可以提高其光稳定性，从而增强了BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的光动力治疗的效果。
本发明抗菌纳米探针的粒径为116nm，电位为28mV，稳定性较好，连续监测7天，粒径基本不变。
本发明抗菌纳米探针中的BSA@AuNc作为荧光供体，而AMP-Ce6作为荧光受体，可通过毛细管电泳(CE-FL)观察到明显的FRET现象。AMP序列中的PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，可通过毛细管电泳(CE-FL)观察到明显的FRET消失现象。
本发明中引入光敏剂Ce6进行PDT抗菌，利用它在激光的照射下，产生活性氧(ROS)，导致微生物生物分子的氧化并导致细胞损伤和死亡，与抗菌肽(AMP)产生协同作用，使得BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针具有较传统抗菌肽更优异的抗菌性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
BSA@AuNc作为荧光供体，而AMP-Ce6作为荧光受体，可通过毛细管电泳(CE-FL)观察到明显的FRET现象。AMP序列中的PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，可通过毛细管电泳(CE-FL)观察到明显的FRET消失现象，用于特异性识别S.aureus菌。
本发明公开的方法制备得到的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米复合抗菌材料，具有较高的抗菌活性，可广泛应用于抑菌、杀菌领域中；本发明公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。
附图说明
图1为BSA@AuNc紫外吸收光谱图。
图2为BSA@AuNc的荧光光谱图。
图3为GKRWWKWWRRPLGVRGC的纯化图。
图4为Ce6-GKRWWKWWRRPLGVRGC的纯化图。
图5为Ce6-GKRWWKWWRRPLGVRGC的质谱分析图。
图6为BSA@AuNc-AMP-Ce6的水合粒径图。
图7为BSA@AuNc-AMP-Ce6的Zeta电位图。
图8为BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的粒径稳定性图。
图9为Ce6的标准曲线图。
图10为Ce6的光稳定性图。
图11为BSA@AuNc-AMP-Ce6的光稳定性图。
图12为BSA@AuNc-AMP-Ce6的紫外吸收光谱图。
图13为BSA@AuNc-AMP-Ce6的荧光光谱图。
图14为BSA@AuNc-AMP-Ce6的FRET效应图。
图15为孵育时间对BSA@AuNc-AMP-Ce6酶切效应的影响图。
图16为S.aureus菌浓度对BSA@AuNc-AMP-Ce6酶切效应的影响图。
图17为AMP-Ce6的浓度对S.aureus存活率影响的涂板结果图。
图18为AMP-Ce6的浓度对S.aureus存活率的影响(直方图)。
图19为BSA@AuNc-AMP-Ce6的浓度对S.aureus存活率影响的涂板结果图。
图20为BSA@AuNc-AMP-Ce6的浓度对S.aureus存活率的影响(直方图)。
图21为BSA@AuNc-AMP-Ce6对S.aureus细菌生长曲线的影响图。
图22为BSA@AuNc-AMP-Ce6对E.coli细菌生长曲线的影响图。
图23为DCFH-DA检测活性氧(ROS)的产生图。
图24为光照时间对活性氧产生的影响图。
图25为BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对S.aureus细菌的光动力杀伤作用图。
图26为BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对E.coli菌的光动力杀伤作用图。
图27为BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对S.aureus菌和E.coli菌的光动力杀伤作用图。
图28为E.coli对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针酶切效果的影响图。
图29为不同浓度的AMP-Ce6(Ce6-GKRWWKWWRRC)溶液中金黄色葡萄球菌的存活率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1
1、纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6(Ce6-GKRWWKWWRRPLGVRGC-BSA@AuNc)的合成及纯化
1)BSA@AuNc的合成及表征
将5ml BSA(50mg/ml)与5ml HAuCl4(10mM)分别37℃水浴10min，然后将HAuCl4滴加到BSA中，2min后，将500μL NaOH溶液(1M)滴加到上述溶液中，然后37℃下搅拌12h。将样品放入透析袋(12-14KD)，在水里透析20小时，最终将溶液分散在水中。注：所有的玻璃器皿都要洗干净，水都是超纯水。
将合成的BSA@AuNc经水系(0.22μ)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样平行测定三次，取平均值，用紫外分光光度计扫描合成BSA@AuNc的紫外吸收，扫描的范围为200nm～800nm，用荧光光谱仪测试BSA@AuNc的荧光，用的激发光为510nm，吸收光谱以及荧光光谱如附图1和附图2所示。
由图可知，BSA@AuNc在300-800nm没有明显的吸收，当用510nm的光激发时，发射在650nm。
2)合成多肽GKRWWKWWRRPLGVRGC
多肽是基于带有Fmoc保护基团的2-Chlorotrityl Chloride树脂，通过固相多肽合成法得到。具体为：分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT，溶于DMF中，加入DIEA耦合30min。然后加入20％哌啶反应30min脱去Fmoc保护基，重复此步骤直达合成所需的肽链。合成的肽链经HPLC纯化(附图3)。
由附图3的HPLC纯化结果可见，纯化后出现单独主峰，纯化效果较好。
3)光敏剂Ce6标记多肽(Ce6-GKRWWKWWRRPLGVRGC)
称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂)，和相当于树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于1mLDMF中，加入10μL DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，HPLC纯化(附图4)，分子量通过LC-MS确定(附图5)。
附图4为Ce6-AMP的HPLC纯化结果，由图可见，纯化后出现单独主峰，纯化效果较好。附图5为Ce6-AMP的质谱分析结果，分子量2806.45，与实验结果吻合，综上所述Ce6成功标记上了多肽。
4)BSA@AuNc-AMP-Ce6(Ce6-GKRWWKWWRRPLGVRGC-BSA@AuNc)的合成
将透析过的BSA@AuNc与标记的多肽样品混合，取金簇样品400μL(4μM)，加入200μL(900μM)的AMP-Ce6(BSA@AuNc与AMP-Ce6的体积比为2:1)，放入摇床，250r，反应20小时。将合成的样品进行透析处理24小时，样品最终分散在去离子水中。
2、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的表征
1)BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的水合粒径和Zeta电位的测定实验
分别取20μL合成好的BSA@AuNc、AMP-Ce6、Au-AMP-Ce6，用去离子水稀释至2mL。其中，1mL用于测水合粒径，1mL用于测Zeta电位。将样品3000r离心去除大分子杂质，并经过水系(0.22μ)滤膜过滤后用于实验测定，每组样品平行测定三次，并监测整个过程的变化。
根据测定BSA@AuNc、BSA@AuNc-AMP-Ce6的水合粒径和Zeta电位的变化情况，来判断每一步是否偶联成功。由附图6可以发现，从最初的BSA@AuNc到最终的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针，其水合粒径逐渐增大，证明了AMP-Ce6的成功偶联。附图7是Zeta电位的变化情况，Zeta电位的变化也证明了BSA@AuNc连接上了AMP-Ce6。最后得到的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的电位大约为28mV左右。
2)BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的粒径稳定性实验
为了探究BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的稳定性，每天取10μL的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针，用去离子水稀释至1mL，然后用动态光散射仪测定水合粒径，并且平行测定三次，连续测7天，监测BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的尺寸稳定性。
附图8是测得的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的粒径稳定性结果，由图可以看出BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的水合粒径在7天之内没有发生明显的变化，无聚集现象且分散性较好，粒径大约稳定在116nm左右，这说明了BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针具有较好的稳定性和分散性。
3)BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的浓度测定实验(以Ce6的浓度为标准)
分别配制浓度为1、3、5、7、9、11μg/mL的Ce6标准溶液，每组浓度配制3份，然后测定每组浓度在660nm处的吸光度值，取平均值，用平均吸光度值和浓度作图，并进行线性回归处理，就可建立Ce6的标准曲线。
测定配制的各浓度的Ce6溶液在660nm处的吸光度值，以每组的平均吸光度值对该组浓度作图，如附图9所示，并对该曲线进行线性回归，即可得到Ce6溶液在1～11μg/mL浓度范围内的标准方程，为y＝0.0648x+0.1872，R2＝0.9982，这样可认为Ce6在1～11μg/mL浓度范围内吸光度值和浓度呈线性关系。可以根据测得的吸光度，计算BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的浓度。
4)BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的光稳定性实验
分别配制10μg/mL的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针(以Ce6浓度为标准)和Ce6标准溶液各300μL，于离心管中，纳米探针和Ce6各五管，用660nm激光器去照射各样品，照射时间为10min。光照完之后，用酶标仪分别扫描每个样品在350-800nm处的吸光度。
单独的Ce6和BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的光稳定性研究结果如图所示，可以看到，经过激光照射之后，单独的Ce6在403nm和664nm处的吸光度值发生了显著的下降，说明Ce6在光照之后发生了明显的光漂白现象(附图10)。光漂白(Photobleaching)是染料或荧光团分子的光化学变化，使其永久不能发出荧光。这是由于共价键断裂或荧光团与周围分子之间的非特异性反应。而BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的吸光度值却下降得很少(附图11)，表明将Ce6连接到BSA@AuNc上之后，可以提高其光稳定性，从而增强了BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的光动力治疗的效果。
5)BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的紫外吸收光谱与荧光光谱
将合成的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针经水系(0.22μ)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样平行测定三次，取平均值，用紫外分光光度计扫描合成BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的紫外吸收，扫描的范围为300nm～800nm，用荧光光谱仪测试材料的荧光，用的激发光为470nm，对照组为BSA@AuNc、AMP-Ce6。
附图12为BSA@AuNc-AMP-Ce6的紫外吸收光谱图，由图可以看出300nm～800nm内BSA@AuNc没有明显吸收，偶联AMP-Ce6之后的BSA@AuNc-AMP-Ce6在403nm和660nm处出现了Ce6的特征峰，说明多肽的成功偶联。附图13为BSA@AuNc-AMP-Ce6的荧光光谱图，如图所示，BSA@AuNc的发射大约为650nm，AMP-Ce6的发射大约为667nm，两者偶联之后，BSA@AuNc作为供体荧光减弱，而AMP-Ce6作为受体荧光明显增强，表现出明显的FRET现象，也进一步说明BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的偶联。
3、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的FRET效应
为了探究BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的FRET效应，分别配置BSA@AuNc、Ce6-AMP和BSA@AuNc-AMP-Ce6样品，将样品使用CE-FL进行分析，样品选用420nm的波长激发，进样时间为20s，观察650nm以及667nm通道(对应BSA@AuNc和Ce6的发射波长)的电泳谱图。单独BSA@AuNc、Ce6-AMP的浓度与BSA@AuNc-AMP-Ce6中的浓度一致。
如附图14所示，在420nm的激发下，BSA@AuNc在650nm通道能观察到明显的荧光发射，而AMP-Ce6(667nm)在此波长下不能被激发，偶联后的BSA@AuNc-AMP-Ce6的纳米探针，650nm和667nm通道都出现了明显的荧光发射，与单独的BSA@AuNc相比，667nm通道的荧光明显增强，这是由于BSA@AuNc作为供体，将激发后的能量传递给了Ce6，使得作为受体的Ce6的荧光强度明显增强。
4、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的酶切效应实验
1)孵育时间的影响
为了探究S.aureus与BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针孵育时间对酶切效果的影响，将BSA@AuNc-AMP-Ce6与S.aureus共同孵育0h、0.5h、1h、2h、3h，将样品使用CE-FL进行分析，观察FRET的变化。样品选用420nm的波长激发，进样时间为20s，观察650nm以及667nm通道(对应BSA@AuNc和Ce6的发射波长)的电泳谱图。
如附图15所示，随着孵育时间的延长，S667/S650的值明显减小，FRET现象减弱，说明越来越多的AMP(GKRWWKWWRRPLGVRGC)被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，3小时时，667nm通道的荧光强度几乎与650nm通道的荧光强度重合，与单独的BSA@AuNc表现出相似的现象(附图14)，说明3小时时，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针几乎全部被切断。综上所述，S.aureus菌对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的酶切效果与共孵育时间呈正相关，孵育时间越长，酶切效果越好，并且3小时时酶切效果最好。
2)S.aureus菌浓度的影响
为了探究S.aureus菌浓度对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针酶切效果的影响，分别将不同浓度的S.aureus与BSA@AuNc-AMP-Ce6共同孵育3h，将样品使用CE-FL进行分析，观察FRET的变化。样品选用420nm的波长激发，进样时间为20s，观察650nm以及667nm通道(对应BSA@AuNc和Ce6的发射波长)的电泳谱图。
如附图16所示，培养时间一定的情况下，随着S.aureus菌浓度的增加，S667/S650的值明显减小，FRET现象减弱，说明越来越多的AMP(GKRWWKWWRRPLGVRGC)被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，当S.aureus菌浓度为108CFU/mL时，667nm通道的荧光强度几乎与650nm通道的荧光强度重合，与单独的BSA@AuNc表现出相似的现象(附图14)，说明S.aureus菌浓度为108CFU/mL时，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针几乎全部被切断，酶切效果最好。当S.aureus菌浓度为105CFU/mL时，几乎没有观察到FRET现象变化，说明菌浓度较低，酶切效果较差。综上所述，S.aureus菌对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的酶切效果与S.aureus菌的浓度呈正相关，菌浓度越高，酶切效果越好。
5、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的MIC90值测定
1)AMP-Ce6MIC90值测定
用无菌水配制15μM、30μM、45μM、60μM、75μM、90μM、105μM的AMP-Ce6，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱15小时，15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数。每个样平行测定三次。
如附图17的涂板结果所示，AMP-Ce6的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。当AMP-Ce6的浓度为18μM时，S.aureus的存活率仅为3％，即MIC90为18μM(附图18)。
2)BSA@AuNc-AMP-Ce6MIC90值测定
用无菌水配制10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM的BSA@AuNc-AMP-Ce6，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱15小时，15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数。每个样平行测定三次。
如附图19的涂板结果所示，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。当BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的浓度为18μM时，S.aureus的存活率仅为2.5％，即MIC90为18μM(附图20)。
6、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对细菌(S.aureus、E.coli)生长的影响
为了探究BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对细菌生长的影响，将过夜培养的S.aureus、E.coli细菌稀释至105CFU/mL，于96孔板中加入200μL的菌液，并加入10μL 100μM的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针，用660nm的激光器照射样10min，不经激光照射和水作为对照组，每组做三个平行样。通过酶标仪测600nm处的吸光度，连续测10小时，然后根据测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长情况。
附图21和附图22为BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对细菌(S.aureus、E.coli)生长的影响结果。由图可知，共同孵育4小时后，S.aureus对照组的OD600值已经达到1，而BSA@AuNc-AMP-Ce6加光照组的OD600值仅为对照组的1/3，大概为0.3左右(S.aureus，附图21)，BSA@AuNc-AMP-Ce6未光照组也表现出抑制作用，这是可能由于AMP的作用引起的。BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的光照组对E.coli生长曲线也有明显影响，相比S.aureus菌而言，效果较差(附图22)。
7、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针产生活性氧(ROS)
1)DCFH-DA检测活性氧(ROS)的产生
由于在660nm激光的照射下，Ce6能够产生单线态氧(1O2)，所以通过激光的照射来评价其光动力学性能。实验中利用荧光探针DCFH-DA来检测经过激光照射之后，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针产生1O2的情况。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
取105CFU/mL的S.aureus菌1mL，加入50μL样品，用660nm激光器照射10min，并加入1μL DCFH-DA(终浓度10mM)共孵育30min，离心，并用PBS洗3次。最终悬浮于PBS中，取200μL于96孔板中，488nm激发500-800nm扫描DCF的荧光发射。本实验的样品分为五组：1、单独Ce6加光照组2、BSA@AuNc-AMP-Ce6加光照组3、TSB加光照组4、单独Ce6不加光照组5、BSA@AuNc-AMP-Ce6不加光照组。
附图23是BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针经过激光照射之后的产生活性氧的结果，由图可以发现，经过激光照射之后，第一组和第二组在525nm处出现了很强DCF的荧光信号，而其他组只出现了微弱的荧光，这可能是细菌体内自带的活性氧引起的。由图可以看出BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针经激光照射之后可以产生大量的活性态氧，这是因为改材料成功接上了光敏剂Ce6。产生的单线态氧能够导致微生物生物分子的氧化并导致细胞损伤和死亡，具有很好的光动力学性能，为后面的PDT治疗奠定基础。
2)研究光照时间对活性氧产生的影响
取105CFU/mL的S.aureus菌1mL，加入50μL BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针，用660nm激光器照射0-14min，并加入1μL DCFH-DA(终浓度10mM)共孵育30min，离心，并用PBS洗3次。最终悬浮于PBS中，取200μL于96孔板中，488nm激发500-800nm扫描DCF的荧光发射。对照为单独的Ce6。
由附图24可知，与单独的Ce6相似，随着光照时间的延长，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针单线态氧的产生越多，并逐渐趋于平缓。当激光照射为0min时，DCF的荧光可能是细菌本身自带的单线态氧引起的。
8、BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针对细菌(S.aureus、E.coli)的光动力杀伤作用
1)用无菌水配制80μM的BSA@AuNc-AMP-Ce6，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品混合于37℃共同孵育1小时，并用660nm激光器照射5min或不光照，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱37℃培养15小时后，观察板上菌落的个数。
如附图25所示，加BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针后，S.aureus菌落明显的减少，这可能是AMP的作用引起的，加BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针并光照之后效果更好，这是由于激光照射后，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针产生大量的1O2，导致生物分子的氧化并导致细菌死亡，与AMP产生协同作用，抗菌效果较好，这与附图21生长曲线的结果相一致。
2)用无菌水配制200μM的BSA@AuNc-AMP-Ce6，取108CFU/mL的E.coli菌液1mL与250μL的样品混合于37℃共同孵育1小时，并用660nm激光器照射5min，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱37℃培养15小时。
如附图26所示，加BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针并光照之后，E.coli菌菌落明显的减少，但是加单独的BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的效果不佳，这与图22生长曲线的结果相一致。
3)取1mL108CFU/mL的S.aureus菌液与1mL108CFU/mL的E.coli菌液混合，然后取混合菌液1mL与250μL的BSA@AuNc-AMP-Ce6共同孵育1小时，并用660nm激光器照射5min或不照射，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱37℃培养15小时。(红色圈圈的是S.aureus菌菌落，蓝色圈圈的是E.coli菌菌落)
如图27所示，加BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针后，S.aureus菌落明显的减少，E.coli菌菌落没有明显变化，这可能是AMP的作用引起的，加BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针并光照之后，板上只剩下E.coli菌，并且E.coli菌的菌落数较Control组也明显减少，综上所述，BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针并光照之后，对S.aureus菌和E.coli菌都有明显的杀伤作用，其中S.aureus菌的效果更好。
对比实施例1
1、E.coli对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的酶切效果的影响
为了探究E.coli对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针的酶切效果的影响，将108CFU/mLE.coli与BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针共同孵育3h，对照为108CFU/mL E.coli与BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针共同孵育0h，将样品使用CE-FL进行分析，观察FRET的变化。样品选用420nm的波长激发，进样时间为20s，观察650nm以及667nm通道(对应BSA@AuNc和Ce6的发射波长)的电泳谱图。
如附图28所示，共孵育3小时后，108CFU/mL的E.coli菌对BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针几乎没有酶切效果，这是因为E.coli菌不能分泌明胶酶，不能切断BSA@AuNc-AMP-Ce6纳米探针中的酶切序列。
对比实施例2
AMP-Ce6(Ce6-GKRWWKWWRRC)的MIC90值测定
用无菌水配制10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM的AMP-Ce6，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱15小时，15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数。每个样平行测定三次。效果见附图29。

Claims (9)

1.一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6，其特征在于，所述的抗菌纳米探针由牛血清蛋白还原和保护的金纳米团簇、抗菌肽和光动力治疗分子组成。
2.根据权利要求1所述的抗菌纳米探针，其特征在于，所述牛血清蛋白还原和保护的金纳米团簇，发射为650nm，粒径为13nm，电位为-24mV。
3.根据权利要求1所述的抗菌纳米探针，其特征在于，所述抗菌肽序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC，其中PLGVRG为明胶酶酶切序列。
4.根据权利要求3所述的抗菌纳米探针，其特征在于，所述抗菌肽由固相合成法制得。
5.根据权利要求1所述的抗菌纳米探针，其特征在于，所述光动力治疗分子为Ce6，Ce6标记抗菌肽的方法为：称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的Ce6、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经过HPLC进行纯化，并通过质谱进行分析。
6.根据权利要求1所述的抗菌纳米探针，其特征在于，所述抗菌纳米探针的电位为28mV，连续监测七天，粒径稳定在116nm左右。
7.一种根据权利要求1所述的抗菌纳米探针的制备方法，其特征在于，通过Au-S键将Ce6标记的抗菌肽连接到BSA@AuNc上。
8.根据权利要求7所述的抗菌纳米探针的制备方法，其特征在于，所述将Ce6标记的抗菌肽连接到BSA@AuNc上的方法为，将透析过的牛血清蛋白还原和保护的金纳米团簇样品与Ce6标记的多肽样品混合，放入摇床，250r，反应20小时，其中，BSA@AuNc用量为400μL，加入200μL的AMP-Ce6。
9.一种根据权利要求1所述的抗菌纳米探针的应用，其特征在于，所述抗菌纳米探针用于识别S.aureus菌，以及抑菌、杀菌领域。
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