CN110201166A - 一种抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用 - Google Patents

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Abstract

一种抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用，涉及医药领域，提供了一种工艺简单，抗菌、杀菌可靠的抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用。包括以下步骤：（1）将抗菌肽用磷酸或醋酸缓冲液溶解，加入锌盐搅拌反应，透析后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末。（2）抗菌肽锌粉末用水分散制成囊心溶液；将囊材和光敏剂混合，用溶剂溶解配成囊材溶液；将囊心与囊材混合，加入乳化剂，搅拌；透析后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。该纳米颗粒用作抗菌药物，可减少或避免细菌对抗菌肽的耐药性发生。

Description

一种抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用。
背景技术
抗菌肽是一类具有抗菌作用的小分子多肽，一般由12～50个氨基酸组成。目前已在自然界发现了两千多种抗菌肽。抗菌肽具有广谱抗菌性，可杀死革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等，因而成为重要的抗菌药物，应用于医药领域和动物养殖领域。
抗菌肽的作用机制是破环细菌或真菌细胞膜，抑制细胞呼吸，从而导致其死亡，所以人们通常认为，抗菌肽优先攻击细胞膜的特点使其不会引起广泛的耐药性。但实际上，随着抗菌肽的广泛应用，细菌已经产生了耐药性。主要机制在于细菌利用其分泌的多种蛋白酶以及细胞外结构对抗菌肽进行抵御，同时还能适应性地对细胞表面结构进行改性，从而阻碍抗菌肽对细菌的静电吸附与打孔（王雨霏，陈相书，张凌琳．细菌抗菌肽耐药机制研究进展．微生物学报，2019.1.9网络发表）。因此防止细菌对抗菌肽产生耐药性，对于保护抗菌肽的资源具有重要意义。
采用抗菌肽和锌反应，制成光响应纳米制剂，采用多种作用机制避免细菌产生耐药性发生，此种抗菌肽制剂及其制备方法未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明提供一种抗菌肽锌光响应纳米颗粒制备方法及产品和应用。
本发明技术方案为：
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将抗菌肽用其质量5～20倍的pH为4～6磷酸或醋酸缓冲液溶解，加入锌盐室温200～2000转/分钟搅拌反应12～24h，透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末。
（2）抗菌肽锌粉末用其质量3～6倍的水分散制成囊心溶液；将囊材和光敏剂脱镁叶绿酸或姜黄素或竹红菌素乙素混合，用囊材质量10～20倍的石油醚或二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将囊心与囊材按体积比1：2～5倍混合，加入乳化剂，搅拌；透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
步骤（1）中，所述锌盐为醋酸锌、氯化锌、碳酸锌中的一种，所述锌盐的用量为抗菌肽质量的0.5～5%。
步骤（2）中，所述的囊材为卵磷脂、聚乳酸乙醇酸、聚乙丙交酯50中的一种。
步骤（2）中，所述乳化剂为司盘60、单硬脂酸甘油酯或月桂酸单甘油酯中的一种及以上。
步骤（2）中，所述光敏剂加入量为囊材质量的0.1～1％，所述乳化剂加入量为囊材质量的0.5～3%。
步骤（2）中，搅拌的转速为500～5000转/分钟，搅拌时间为0.5～2h。
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法制备的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品。
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品用作抗菌药物的应用。
本发明的原理：抗菌肽与锌配位反应，获得抗菌肽锌，将其包裹在具有光敏剂的纳米囊中，获得光响应释放的纳米粒。由于光敏剂可在光照下产生单线态氧，破坏细菌分泌的蛋白酶和胞外结构改变细菌靶位，从而破坏了细菌对抗菌肽的耐药机制。同时在光照下释放抗菌肽锌，而抗菌肽锌可双靶位作用于细胞膜和细胞核DNA，因此具有更强的杀菌能力。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明制备的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒，易进入组织细胞，并在可见光照射下，靶向释放抗菌肽锌，实现多重抗菌作用，减少或避免细菌耐药性发生；
（2）本发明制备抗菌肽锌光响应性纳米颗粒，中药光敏剂位于外层，抗菌肽锌包在内层，可以提高抗菌肽的稳定性；
（3）制备工艺简单，适合工业化生产。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但实施例不构成对本发明权利要求保护范围的限定。本实施例中抗菌肽购自江苏昆山嘉隆生物科技有限公司，多肽含量99%。
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将抗菌肽用其质量5～20倍的pH为4～6磷酸或醋酸缓冲液溶解，加入锌盐室温200～2000转/分钟搅拌反应12～24h，透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末。
（2）抗菌肽锌粉末用其质量3～6倍的水分散制成囊心溶液；将囊材和光敏剂脱镁叶绿酸或姜黄素或竹红菌素乙素混合，用囊材质量10～20倍的石油醚或二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将囊心与囊材按体积比1：2～5倍混合，加入乳化剂，搅拌；透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
步骤（1）中，所述锌盐为醋酸锌、氯化锌、碳酸锌中的一种，所述锌盐的用量为抗菌肽质量的0.5～5%。
步骤（2）中，所述的囊材为卵磷脂、聚乳酸乙醇酸、聚乙丙交酯50中的一种。
步骤（2）中，所述乳化剂为司盘60、单硬脂酸甘油酯或月桂酸单甘油酯中的一种及以上。
步骤（2）中，所述光敏剂加入量为囊材质量的0.1～1％，所述乳化剂加入量为囊材质量的0.5～3%。
步骤（2）中，搅拌的转速为500～5000转/分钟，搅拌时间为0.5～2h。
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法制备的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品，包括含光敏剂的囊壳和含抗菌肽锌的囊心，在可见光照下可加速抗菌肽锌释放的纳米粒子。
一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品用作抗菌药物的应用，可减少或避免细菌对抗菌肽的耐药性发生。
实施例1
将1kg抗菌肽用5kg的pH为4醋酸缓冲液溶解，加入5g醋酸锌室温200转/分钟搅拌反应24h，透析24h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1002g。
取1kg抗菌肽锌粉末用3kg的水分散制成囊心溶液；将1kg卵磷脂加入1g脱镁叶绿酸混合，用10kg石油醚溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与2kg囊材溶液混合，加入5g司盘60，500转/分钟，搅拌2h；透析24h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例2
将1kg抗菌肽用20kg的pH为6磷酸缓冲液溶解，加入50g氯化锌室温2000转/分钟搅拌反应12h，透析48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1036g。
取1kg抗菌肽锌粉末用6kg的水分散制成囊心溶液；将1kg聚乳酸乙醇酸加入10g姜黄素混合，用20kg二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与5kg囊材溶液混合，加入30g单硬脂酸甘油酯，5000转/分钟，搅拌0.5h；透析48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例3
将1kg抗菌肽用10kg的pH为5醋酸缓冲液溶解，加入10g碳酸锌室温500转/分钟搅拌反应15h，透析30h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1007g。
取1kg抗菌肽锌粉末用4kg的水分散制成囊心溶液；将1kg聚乙丙交酯50，加入2g竹红菌素乙素混合，用15kg石油醚溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与3kg囊材溶液混合，加入10g月桂酸单甘油酯，1000转/分钟，搅拌1h；透析30h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例4
将1kg抗菌肽用15kg的pH为4.5醋酸缓冲液溶解，加入20g醋酸锌室温1500转/分钟搅拌反应20h，透析36h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1013g。
取1kg抗菌肽锌粉末用5kg的水分散制成囊心溶液；将1kg卵磷脂加入3g脱镁叶绿酸混合，用12kg二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与4kg囊材溶液混合，加入15g司盘60，3000转/分钟，搅拌1.5h；透析36h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例5
将1kg抗菌肽用8kg的pH为5.5磷酸缓冲液溶解，加入30g氯化锌室温800转/分钟搅拌反应16h，透析30h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1025g。
取1kg抗菌肽锌粉末用3.5kg的水分散制成囊心溶液；将1kg聚乳酸乙醇酸加入4g姜黄素混合，用12kg石油醚溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与2.5kg囊材溶液混合，加入25g单硬脂酸甘油酯，4000转/分钟，搅拌1h；透析48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例6
将1kg抗菌肽用16kg的pH为5醋酸缓冲液溶解，加入40g碳酸锌室温1600转/分钟搅拌反应16h，透析40h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末1029g。
取1kg抗菌肽锌粉末用5.5kg的水分散制成囊心溶液；将1kg聚乙丙交酯50，加入8g竹红菌素乙素混合，用18kg二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将1kg囊心溶液与2.5kg囊材溶液混合，加入25g月桂酸单甘油酯，4500转/分钟，搅拌1.5h；透析38h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
实施例1-6制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的粒径和包封率实验：
方法：采用2010年中国药典第二部附录IXE粒度和粒度分布测定方法第三法光散射法测定纳米粒径；采用高效液相法测定包封率，色谱柱Agilent Alltima C18(4.6 mm×250mm， 5μm)，流动相0.05% 三氟乙酸(TFA) 溶液-甲醇乙腈(体积比95∶2.5∶2.5)，检测波长275nm，流速1.0 mL/min，进样量10μL，柱温25℃。以抗菌肽含量Y (μg)为横坐标，峰面积X为纵坐标，制作标准曲线，得Y=4. 05×104X + 1.03×103， r=0.9995。以实施例1-6制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒加入流动相，超声20min，滤液进样，查标准曲线，可算得纳米粒中抗菌肽量，包封率＝纳米粒中的抗菌肽量/实验时加入的抗菌肽用量。测试结果见表1。
结果：抗菌肽锌光响应性纳米颗粒粒径范围在150～250nm之间，包封率在81～88％。这表明该采用实施例1～6法制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒粒径分布较均匀，具有较高的包封率。
表1 抗菌肽锌光响应性纳米颗粒粒径和包封率
测定项目 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 实施例6
平均粒径(nm) 190 215 226 186 160 245
包封率(%) 84.5％ 83.0％ 81.5% 87.3％ 86.2％ 88.0%
实施例1、2、5制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的光控释药实验：
实验方法：取2g实施例1、2、5制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒，加入到50mL pH=7.5磷酸缓冲液中，搅拌转速50rpm。每隔1小时取样1 mL，并补回1 mL pH =7.5磷酸缓冲液，直至12h。将样品进行高效液相色谱分析，分析条件同上。测定抗菌肽峰面积，计算累积释放率。同时测定实施例1、2、5制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒在30W白炽灯照射下的累积释放率。
实验结果：实施例1、2、5制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒在无光照下释药缓慢，8～12h后累计释药95％，但光照后，其在2～3h释药达90％，表明光照加速了药物释放。
实施例1、2、5制备的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的体内抗菌实验：
方法：将培养18 h的金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach）、绿脓杆菌（P.aeruginosa）培养液稀释至细菌浓度分别为108、107、106、105 cfu／mL，取0.5 mL 稀释液注入小鼠腹腔内，观察小鼠的感染情况。发现金黄色葡萄球菌在105 cfu／mL，绿脓杆菌在107cfu／mL时，小鼠第1天有30%的死亡，第4天有90%的小鼠死亡。因此将金黄色葡萄球菌稀释10-4倍，绿脓杆菌稀释10-2倍为感染浓度。
将小鼠160只随机分为空白对照组、实施例1、2、5制得的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒非光照组和光照组、抗菌肽组，每组20只。空白对照组用等量生理盐水尾静脉注射，抗菌肽锌光响应性纳米颗粒和阿莫西林组按每天50mg/kg剂量连续尾静脉给药3天，光照组在给药后全身用30W白炽灯光照1小时。在第4天时，腹腔给菌0.5 mL /只，观察7天内各组动物的死亡情况。测试结果见表2。
结果：抗菌肽组有较高的动物死亡率，表明细菌产生了耐药。抗菌肽锌光响应性纳米颗粒给药组金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌感染小鼠死亡率与空白对照组比，显著减少，光照组明显优于非光照组。说明抗菌肽锌光响应性纳米颗粒在光照下对耐药金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌感染小鼠有更好的抗菌和抗病作用。
表2 抗菌肽锌光响应性纳米颗粒对致病菌感染小鼠的作用实验
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将抗菌肽用其质量5～20倍的pH为4～6磷酸或醋酸缓冲液溶解，加入锌盐室温200～2000转/分钟搅拌反应12～24h，透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌粉末；
（2）抗菌肽锌粉末用其质量3～6倍的水分散制成囊心溶液；将囊材和光敏剂脱镁叶绿酸、姜黄素或竹红菌素乙素混合，用囊材质量10～20倍的石油醚或二氯甲烷溶解配成囊材溶液；将囊心与囊材按体积比1：2～5倍混合，加入乳化剂，搅拌；透析24～48h后冷冻干燥，得到抗菌肽锌光响应性纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述锌盐为醋酸锌、氯化锌、碳酸锌中的一种，所述锌盐的用量为抗菌肽质量的0.5～5%。
3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述囊材为卵磷脂、聚乳酸乙醇酸、聚乙丙交酯50中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述乳化剂为司盘60、单硬脂酸甘油酯或月桂酸单甘油酯中的一种及以上。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述光敏剂加入量为囊材质量的0.1～1％，所述乳化剂加入量为囊材质量的0.5～3%。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌肽锌光响应性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，搅拌的转速为500～5000转/分钟，搅拌时间为0.5～2h。
7.一种根据权利要求1所述方法制备的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品。
8.一种根据权利要求7所述的抗菌肽锌光响应性纳米颗粒产品用作抗菌药物的应用。
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