CN110478331B - 一种载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，具体涉及一种借助脂质体制备的载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，所述应用具体为在制备抗菌药物中的应用。本发明提供了一种制备含载药细菌外膜囊泡的制剂的方法，包括如下步骤：以含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂为原料，制备得到含载药细菌外膜囊泡的制剂。本发明还保护一种制备载药细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：以载药脂质体和细菌外膜囊泡为原料，制备得到载药细菌外膜囊泡。本发明还保护一种抗菌药物，含有所述含载药细菌外膜囊泡的制剂或所述载药细菌外膜囊泡。本发明在药物递送领域、抗菌药物开发领域均具有广阔的应用前景。

Description

一种载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，具体涉及一种借助脂质体制备的载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，所述应用具体为在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
进化保守的细菌外膜囊泡，是细菌向外界释放的纳米级结构功能性小泡，最早于1967年由Chatterjee等人在霍乱弧菌正常生长阶段发现，并被命名为细菌外膜囊泡(Outermembrane vesicle，OMV)。OMV的结构与脂质体类似，其直径通常在20-300nm之间，主体为磷脂双分子层，此外还包括细菌外膜和周质成分，如周质蛋白、外膜蛋白、胞浆蛋白、肽聚糖、脂多糖、DNA、RNA、与毒力有关的各种酶等。所有革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌均可产生OMV，OMV的产生并不破坏细菌细胞的完整性。OMV的释放是非常常见的现象，是细菌一种重要的分泌机制。
OMV有多种生物学功能，在细菌的生长、生存、细菌间信息交流、毒力因子传递、维持群体稳定等生理活动中扮演着多重角色，包括：(1)在细胞间传输生物分子；(2)将毒力因子等运送到异种细菌，从而竞争性杀灭异类细菌和其它微生物；(3)将毒力因子等运送到宿主细胞内，引起宿主细胞产生免疫应答；(4)对环境中的物理、化学压力做出反应；(5)为细菌细胞提供营养；(6)防御和抵抗异物。
OMV作为疫苗是近年来最主要的应用，且已受到越来越多的关注。在OMV表面表达异种抗原，使其既作为佐剂又作为疫苗的载体，极大地提高了其作为疫苗的潜能。然而，将OMV作为药物载体的研究还比较少。
人工合成的纳米材料载体(如脂质体、聚合物胶束、金属纳米粒子等)虽然被认为是高效的药物递送载体，但是这些载体并不能进行有效的细胞间相互作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，具体涉及一种借助脂质体制备的载药细菌外膜囊泡及其制备方法和应用，所述应用具体为在制备抗菌药物中的应用。
本发明提供了一种制备含载药细菌外膜囊泡的制剂的方法，包括如下步骤：以含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂为原料，制备得到含载药细菌外膜囊泡的制剂。
所述方法中，由含载药脂质体的制剂提供药物，由含细菌外膜囊泡的制剂提供细菌外膜囊泡；所述药物和所述细菌外膜囊泡的质量配比为2：2-4。所述药物和所述细菌外膜囊泡的质量配比具体可为2：3。所述细菌外膜囊泡的质量以蛋白质量计。所述细菌外膜囊泡的质量以膜蛋白质量计。
所述方法中，将含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂混合，然后采用过膜挤压的方法制备得到含载药细菌外膜囊泡的制剂。
所述方法中，将含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂混合，37℃孵育1h，然后用脂质体挤出器挤出，得到含载药细菌外膜囊泡的制剂。脂质体挤出器挤出的参数具体可为：挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次。
所述方法中，所述含载药细菌外膜囊泡的制剂可为液态。
所述方法中，含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂均为液态。所述方法中，含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂的体积配比可为1-20：20-1。所述方法中，含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂的体积配比具体可为1-2：2-5。所述方法中，含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂的体积配比更具体可为1：3。
所述方法中，所述含载药细菌外膜囊泡的制剂也可为固态，将液态制剂冻干即可。
所述含细菌外膜囊泡的制剂中，细菌外膜囊泡的浓度为0.8-1.5mg/mL，具体可为1-1.2mg/mL。所述细菌外膜囊泡的质量以蛋白质量计。所述细菌外膜囊泡的质量以膜蛋白质量计。
所述含载药脂质体的制剂中，药物浓度可为0.5-10mg/ml，具体可为1-5mg/ml，更具体可为2mg/ml。药物含量以制备时的加入量计。
本发明还保护一种制备载药细菌外膜囊泡的方法，包括如下步骤：以载药脂质体和细菌外膜囊泡为原料，制备得到载药细菌外膜囊泡。
以上任一所述方法中，所述载药脂质体和所述细菌外膜囊泡通过膜融合的方式形成载药细菌外膜囊泡。
以上任一所述细菌外膜囊泡获自革兰氏阴性细菌。示例性的，所述细菌外膜囊泡获自铜绿假单胞菌。
以上任一所述载药细菌外膜囊泡的粒径为80-200nm，具体可为80-120nm，更具体可为80-110nm。所述载药细菌外膜囊泡的PDI小于0.3，具体可为0.1-0.3。
以上任一所述细菌外膜囊泡的粒径可为20-400nm，具体可为30-200nm，更具体可为140-180nm。所述细菌外膜囊泡的PDI小于0.3，具体可为0.2-0.3。
以上任一所述载药脂质体的粒径为40-200nm，具体可为50-150nm，更具体可为90-130nm，例如90-110nm或110-130nm。所述载药脂质体的PDI小于0.3，更具体小于0.25，例如0.08-0.15或0.1-0.25。
以上任一所述载药脂质体为载药普通脂质体或载药醇质体。
以上任一所述载药脂质体为负载有药物的脂质体。
所述载药脂质体为载药醇质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备原料为：磷脂、药物和醇溶液。所述原料的配比可为20-400mg磷脂：1-500mg药物：10-1000ml醇溶液。所述原料的配比具体可为100mg磷脂：15-25mg药物：8-12ml醇溶液。所述原料的配比更具体可为100mg磷脂：20mg药物：10ml醇溶液。
所述载药脂质体为载药醇质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)取圆底烧瓶，加入磷脂和药物，然后加入有机溶剂(示例性的，所述有机溶剂可为三氯甲烷)进行溶解，然后在水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜；
(2)取完成步骤(1)的圆底烧瓶，加入醇溶液，水化，然后在冰水浴上超声处理，然后用脂质体挤出器挤出，得到含载药脂质体的制剂。
所述载药脂质体为载药醇质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备方法具体包括如下步骤：
(1)取圆底烧瓶，加入100mg大豆卵磷脂和20mg药物，然后加入10ml三氯甲烷，超声溶解，然后在30℃水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜；
(2)取完成步骤(1)的圆底烧瓶，加入10ml 40％(体积百分含量)乙醇水溶液，50℃水化3min，然后在冰水浴上超声处理，然后用脂质体挤出器挤出，得到10ml含载药脂质体的制剂。
所述载药脂质体为载药普通脂质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备原料为：磷脂、胆固醇、药物和缓冲液。所述缓冲液具体可为PBS缓冲液。示例性的，所述PBS缓冲液可为pH7.4的PBS缓冲液。所述原料的配比可为20-400mg磷脂：5-100mg胆固醇：1-500mg药物：10-1000ml缓冲液。所述原料的配比具体可为100mg磷脂：20-30mg胆固醇：15-25mg药物：8-12ml缓冲液。所述原料的配比更具体可为100mg磷脂：25mg胆固醇：20mg药物：10ml缓冲液。
所述载药脂质体为载药普通脂质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)取圆底烧瓶，加入大豆卵磷脂、胆固醇和药物，然后加入有机溶剂(示例性的，所述有机溶剂可为三氯甲烷)进行溶解，然后在水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜；
(2)取完成步骤(1)的圆底烧瓶，加入缓冲液，水化，然后在冰水浴上超声处理，然后用脂质体挤出器挤出，得到含载药脂质体的制剂。
所述载药脂质体为载药普通脂质体时，所述含载药脂质体的制剂的制备方法具体包括如下步骤：
(1)取圆底烧瓶，加入100mg大豆卵磷脂、25mg胆固醇和20mg药物，然后加入10ml三氯甲烷，超声溶解，然后在30℃水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜；
(2)取完成步骤(1)的圆底烧瓶，加入10ml PBS缓冲液，50℃水化3min，然后在冰水浴上超声处理，然后用脂质体挤出器挤出，得到10ml含载药脂质体的制剂。
以上任一所述超声处理的参数具体可为：300W；工作1s停1s，总时间为15min。
以上任一所述脂质体挤出器挤出的挤出压力可为0.2-0.4Mpa，具体可为0.3Mpa。以上任一所述脂质体挤出器挤出的膜孔径为100-400nm，具体可为200-400nm，更具体可为200nm。
以上任一所述脂质体挤出器挤出的参数具体可为：挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次。
以上任一所述含细菌外膜囊泡的制剂的制备方法包括如下步骤：培养细菌，培养过程中加入膜囊泡诱导剂，然后继续培养，培养结束后弃除菌体沉淀，收集上清液并进行硫酸铵沉淀，然后收集沉淀，将沉淀转移到透析袋进行透析。所述细菌可为革兰氏阴性细菌。示例性的，所述细菌可为铜绿假单胞菌。所述透析袋的规格为MWCO8000-14000。
所述含细菌外膜囊泡的制剂的制备方法具体包括如下步骤：
(1)铜绿假单胞菌接种于TSA培养基平板，37℃静置培养24h。
(2)完成步骤(1)后，用接种环挑取菌落接种至8mL LB肉汤培养基中，37℃、80rpm振荡培养24h。
(3)完成步骤(2)后，将整个培养体系转移至40mL LB肉汤培养基中，37℃、80rpm振荡培养180min。
(4)完成步骤(3)后，将整个培养体系转移至150mL LB肉汤培养基中，加入60mg D-环丝氨酸(膜囊泡诱导剂)，37℃、80rpm振荡培养24h。
(5)完成步骤(4)后，将培养体系分装至离心管中，10000g离心10min，弃除沉淀，收集上清液，合并上清液，使用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤并收集滤液，向滤液中加入90g硫酸铵，搅拌溶解后4℃静置12小时。
(6)完成步骤(5)后，分装至离心管中，10000g离心20min，弃除上清液，收集沉淀，合并沉淀，将沉淀重悬于灭菌的PBS缓冲液中，然后转移到MWCO 8000-14000规格的透析袋中，将透析袋置于PBS缓冲液中透析24小时，收集透析袋中的液相，即为含细菌外膜囊泡的制剂(又称OMV溶液)。
以上任一所述方法制备得到的含载药细菌外膜囊泡的制剂均属于本发明的保护范围。
以上任一所述方法制备得到的载药细菌外膜囊泡均属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种抗菌药物，含有所述含载药细菌外膜囊泡的制剂或所述载药细菌外膜囊泡。所述抗菌为抗细菌。示例性的，所述细菌可为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。
本发明还保护所述含载药细菌外膜囊泡的制剂或所述载药细菌外膜囊泡作为环境除菌剂的应用。所述除菌具体可为除细菌。示例性的，所述细菌可为金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌或肺炎克雷伯菌。
本发明还保护一种药物递送系统，包括药物、用于制备脂质体的原料和细菌外膜囊泡。所述脂质体为普通脂质体或醇质体。
所述药物递送系统中，药物和细菌外膜囊泡的质量配比为2：2-4。药物和细菌外膜囊泡的质量配比具体可为2：3。所述细菌外膜囊泡的质量以蛋白质量计。所述细菌外膜囊泡的质量以膜蛋白质量计。
所述细菌外膜囊泡获自革兰氏阴性细菌。示例性的，所述细菌外膜囊泡获自铜绿假单胞菌。
所述脂质体为醇质体时，用于制备脂质体的原料为：磷脂和醇溶液。磷脂和醇溶液的配比可为20-400mg磷脂：10-1000ml醇溶液。磷脂和醇溶液的配比具体可为100mg磷脂：8-12ml醇溶液。磷脂和醇溶液的配比更具体可为100mg磷脂：10ml醇溶液。
所述脂质体为醇质体时，用于制备脂质体的原料为：磷脂和醇溶液。药物、磷脂和醇溶液的配比可为1-500mg药物：20-400mg磷脂：10-1000ml醇溶液。药物、磷脂和醇溶液的配比具体可为15-25mg药物：100mg磷脂：8-12ml醇溶液。药物、磷脂和醇溶液的配比更具体可为20mg药物：100mg磷脂：10ml醇溶液。
所述脂质体为普通脂质体时，用于制备脂质体的原料为：磷脂、胆固醇和缓冲液。所述缓冲液具体可为PBS缓冲液。示例性的，所述PBS缓冲液可为pH7.4的PBS缓冲液。磷脂、胆固醇和缓冲液的配比可为20-400mg磷脂：5-100mg胆固醇：10-1000ml缓冲液。磷脂、胆固醇和缓冲液的配比具体可为100mg磷脂：20-30mg胆固醇：18-12ml缓冲液。磷脂、胆固醇和缓冲液的配比更具体可为100mg磷脂：25mg胆固醇：10ml缓冲液。
所述脂质体为普通脂质体时，用于制备脂质体的原料为：磷脂、胆固醇和缓冲液。所述缓冲液具体可为PBS缓冲液。示例性的，所述PBS缓冲液可为pH7.4的PBS缓冲液。药物、磷脂、胆固醇和缓冲液的配比可为1-500mg药物：20-400mg磷脂：5-100mg胆固醇：10-1000ml缓冲液。药物、磷脂、胆固醇和缓冲液的配比具体可为15-25mg药物：100mg磷脂：20-30mg胆固醇：8-12ml缓冲液。药物、磷脂、胆固醇和缓冲液的配比更具体可为20mg药物：100mg磷脂：25mg胆固醇：10ml缓冲液。
以上任一所述药物可为化合物药物。以上任一所述药物包括但不限于大环内酯类抗生素、头孢菌素类抗生素、喹诺酮类抗菌药。所述大环内酯类抗生素，选自克拉霉素、红霉素、阿奇霉素、罗红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素。所述头孢菌素类抗生素，选自头孢呋辛酯、头孢噻吩、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克罗、头孢孟多、头孢替安、头孢美唑、头孢西丁、头孢替坦、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他定、头孢三嗪、头孢米诺、头孢匹罗、头孢唑南。所述喹诺酮类抗菌药选自萘啶酸、吡咯酸、吡哌酸、西诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星、吉米沙星、西他沙星。以上任一所述药物为抗菌药物。以上任一所述药物为抗细菌药物。示例性的，所述药物为克拉霉素或头孢呋辛酯。
以上任一所述磷脂，选自下列中的一种或多种：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、肌酐、肌醇磷脂、溶血磷脂、磷脂酸(phosphatidic acid，PA)、磷脂酰甘油(phosphatidyglycerol，PPG)、硬脂酰胆碱、棕榈酰胆碱、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、硬脂酰乙醇胺、硬脂酰乙醇胺衍生物、棕榈酰乙醇胺、棕榈酰乙醇胺衍生物、油酰磷脂酰乙醇胺、油酰磷脂酰乙醇胺衍生物、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、氢化PC、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
以上任一所述醇可为乙醇、异丙醇、丙二醇、乙二醇、聚乙二醇等。所述聚乙二醇具体可为分子量为200-600的聚乙二醇。
以上任一所述醇溶液具体可为乙醇水溶液。所述乙醇水溶液具体可为5％-50％(体积百分含量)乙醇水溶液，更具体可为30％-50％(体积百分含量)乙醇水溶液，更具体可为40％(体积百分含量)乙醇水溶液。
与现有技术中通过化学致孔剂载药法制备载药细菌外膜囊泡相比，本发明借助脂质体与细菌外膜囊泡的膜融合作用制备载药细菌外膜囊泡。本发明提供的制备方法中，作为原料的脂质体与OMV外膜成分具有相似性，且制备脂质体的主要成分磷脂和胆固醇均为内源性物质，因此对OMV生物活性影响更小。OMV载体与其它传统药物载体相比，生物相容性更高，且具有传统药物载体不具有的一些生物活性。载药细菌外膜囊泡可以将OMV本身所具有的杀灭异类菌的功能与抗菌药物活性充分结合，共同发挥抗菌作用。目前没有任何研究表明某种细菌对异类细菌OMV存在有效的抵御机制。采用本发明提供的制备方法，载药细菌外膜囊泡具有更高的载药效率，从而具有更高的抗菌活性。
本发明在药物递送领域、抗菌药物开发领域均具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的OMV溶液电子显微镜下的照片。
图2为实施例1制备的OMV溶液电子显微镜下的照片。
图3为实施例2制备的克拉霉素醇质体OMV的粒径分布图。
图4为实施例2制备的头孢呋辛酯醇质体OMV的粒径分布图。
图5为实施例2中脂质体修饰OMV形成机理研究的荧光光谱测定图。
图6为载药脂质体修饰OMV形成机理的结构示意图。
图7为实施例4中体内抗菌活性试验的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明中所述的脂质体为广义脂质体，包括普通脂质体和醇质体。
PBS缓冲液(pH7.4)：含0.24g/L磷酸二氢钾、1.44g/L磷酸氢二钠、8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾，余量为水。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)：ATCC27853。
脂质体挤出器：安拓思纳米技术(苏州)有限公司，型号：EX-10ML。大豆卵磷脂：艾伟拓(上海)医药科技有限公司；http://www.avt-cn.com/ddlz/ddllz.shtml。胆固醇：Sigma Aldrich贸易有限公司，美国；CAS号为57-88-5。克拉霉素，CAS号为81103-11-9。头孢呋辛酯：CAS号为64544-07-6。
实施例中，采用Nano-ZS 90型激光粒度仪测定粒径及多分散系数(PDI)。
实施例中，采用BCA法测定蛋白浓度。
实施例1、细菌外膜囊泡(OMV)的制备及表征
一、制备
1、铜绿假单胞菌接种于TSA培养基平板，37℃静置培养24h。
2、完成步骤1后，用接种环挑取菌落接种至8mL LB肉汤培养基中，37℃、80rpm振荡培养24h。
3、完成步骤2后，将整个培养体系转移至40mL LB肉汤培养基中，37℃、80rpm振荡培养180min。
4、完成步骤3后，将整个培养体系转移至150mL LB肉汤培养基中，加入60mg D-环丝氨酸(膜囊泡诱导剂)，37℃、80rpm振荡培养24h。
5、完成步骤4后，将培养体系分装至离心管中，10000g离心10min，弃除沉淀，收集上清液，合并上清液，使用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤并收集滤液，向滤液中加入90g硫酸铵，搅拌溶解后4℃静置12小时。
6、完成步骤5后，分装至离心管中，10000g离心20min，弃除上清液，收集沉淀，合并沉淀，将沉淀重悬于灭菌的PBS缓冲液中，然后转移到MWCO 8000-14000规格的透析袋中，将透析袋置于PBS缓冲液中透析24小时，收集透析袋中的液相，即为细菌外膜囊泡溶液(又称OMV溶液)。4℃保存。
按照上述步骤制备三个批次的OMV溶液。
二、表征
取步骤一制备的OMV溶液，滴在透射电镜铜网上，放入通风橱中待液体挥干，滴加一滴2％磷钨酸溶液染色2min，用滤纸吸去多余液体，干燥后用透射电子显微镜观察其形态。电子显微镜下的照片见图1和图2。OMV的形态近似球形，大小均匀，分散性良好，未发生聚集。
取步骤一制备的OMV溶液，测定蛋白浓度(由于未进行破碎处理，该蛋白浓度理论上为细菌外膜囊泡的膜蛋白浓度)。
OMV的粒径、PDI以及OMV溶液的蛋白浓度见表1。
表1
第一个批次 第二个批次 第三个批次
粒径(nm) 161.5±15.4 163.2±8.7 166.1±9.8
PDI 0.207±0.065 0.281±0.134 0.267±0.172
蛋白浓度(mg/mL) 1.157±0.092 1.081±0.140 1.103±0.077
实施例2、载药醇质体OMV/载药普通脂质体OMV/载药OMV的制备
一、OMV的制备
同实施例1的步骤一的1至5。
6、完成步骤5后，分装至离心管中，10000g离心20min，弃除上清液，收集沉淀，合并沉淀，将沉淀重悬于灭菌的PBS缓冲液中，然后转移到MWCO 8000-14000规格的透析袋中，将透析袋置于PBS缓冲液中透析24小时，收集透析袋中的液相，用PBS缓冲液调整蛋白浓度以使蛋白浓度为1mg/ml，即为细菌外膜囊泡溶液(又称OMV溶液)。4℃保存。
二、载药醇质体OMV的制备
采用载药醇质体与OMV共混过膜挤压的方法。
1、取圆底烧瓶，加入100mg大豆卵磷脂和20mg药物(克拉霉素或头孢呋辛酯)，然后加入10ml三氯甲烷，超声溶解，然后在30℃水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜。
2、取完成步骤1的圆底烧瓶，加入10ml 40％(体积百分含量)乙醇水溶液，50℃水化3min，然后在冰水浴上超声处理(300W；工作1s停1s，总时间为15min)，然后用脂质体挤出器挤出(挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次)，得到10ml液态产品。
步骤2得到的液态产品中，药物含量为2mg/ml(药物含量以制备时的加入量计)。
药物采用克拉霉素时，步骤2得到的液态产品中含有克拉霉素醇质体，称为克拉霉素醇质体制剂。
药物采用头孢呋辛酯时，步骤2得到的液态产品中含有头孢呋辛酯醇质体，称为头孢呋辛酯醇质体制剂。
克拉霉素醇质体和头孢呋辛酯醇质体的粒径和PDI见表2。
表2
载药醇质体 粒径(nm) PDI
克拉霉素醇质体 106.1 0.147
头孢呋辛酯醇质体 94.1 0.090
3、将1体积份步骤2制备的液态产品和3体积份步骤一制备的OMV溶液混匀，37℃孵育1h，然后用脂质体挤出器挤出(挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次)，得到液态产品。
步骤3得到的液态产品中，药物含量为0.5mg/ml。
采用步骤2制备的含有克拉霉素醇质体的液态产品时，步骤3得到的液态产品中含有克拉霉素醇质体OMV，称为克拉霉素醇质体OMV制剂。
采用步骤2制备的含有头孢呋辛酯醇质体的液态产品时，步骤3得到的液态产品中含有头孢呋辛酯醇质体OMV，称为克拉霉素醇质体OMV制剂。
克拉霉素醇质体OMV的粒径分布图见图3。
头孢呋辛酯醇质体OMV的粒径分布图见图4。
三、载药普通脂质体OMV的制备
采用载药普通脂质体与OMV共混过膜挤压的方法。
1、取圆底烧瓶，加入100mg大豆卵磷脂、25mg胆固醇和20mg药物(克拉霉素或头孢呋辛酯)，然后加入10ml三氯甲烷，超声溶解，然后在30℃水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜。
2、取完成步骤1的圆底烧瓶，加入10ml PBS缓冲液，50℃水化3min，然后在冰水浴上超声处理(300W；工作1s停1s，总时间为15min)，然后用脂质体挤出器挤出(挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次)，得到10ml液态产品。
步骤2得到的液态产品中，药物含量为2mg/ml(药物含量以制备时的加入量计)。
药物采用克拉霉素时，步骤2得到的液态产品中含有克拉霉素普通脂质体，称为克拉霉素普通脂质体制剂。
药物采用头孢呋辛酯时，步骤2得到的液态产品中含有头孢呋辛酯普通脂质体，称为头孢呋辛酯普通脂质体制剂。
克拉霉素普通脂质体和头孢呋辛酯普通脂质体的粒径和PDI见表3。
表3
载药普通脂质体 粒径(nm) PDI
克拉霉素普通脂质体 119.4 0.245
头孢呋辛酯普通脂质体 127.0 0.118
3、将1体积份步骤2制备的液态产品和3体积份步骤一制备的OMV溶液混匀，37℃孵育1h，然后用脂质体挤出器挤出(挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为200nm，反复挤出10次)，得到液态产品。
步骤3得到的液态产品中，药物含量为0.5mg/ml。
采用步骤2制备的含有克拉霉素普通脂质体的液态产品时，步骤3得到的液态产品中含有克拉霉素普通脂质体OMV，称为克拉霉素普通脂质体OMV制剂。
采用步骤2制备的含有头孢呋辛酯普通脂质体的液态产品时，步骤3得到的液态产品中含有头孢呋辛酯普通脂质体OMV，称为头孢呋辛酯普通脂质体OMV制剂。
四、载药OMV的制备
采用游离药物与OMV进行37℃孵育的方法。
1、20mg药物(克拉霉素或头孢呋辛酯)溶于10mL 70％乙醇水溶液中，得到药物溶液。
2、将1体积份药物溶液和3体积份步骤一制备的OMV溶液混匀，37℃孵育10h，得到液态产品。
步骤2得到的液态产品中，药物含量为0.5mg/ml。
药物采用克拉霉素时，步骤2得到的液态产品中含有克拉霉素OMV，称为克拉霉素OMV制剂。
药物采用头孢呋辛酯时，步骤2得到的液态产品中含有头孢呋辛酯OMV，称为头孢呋辛酯OMV制剂。
五、载药醇质体OMV/载药普通脂质体OMV/载药OMV的性能比较
采用高效液相色谱法测定步骤二的3得到的液态产品、步骤三的3得到的液态产品和步骤四的2得到的液态产品中的游离药物的浓度。总投药量-游离药物量＝OMV中的药物量。载药效率＝OMV中的药物量÷总投药量×100％。
采用高效液相色谱法测定液态产品中的游离克拉霉素的浓度的方法：
色谱仪：超高压液相色谱仪(型号：LC 2040 3D，产地：日本岛津公司)；
色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18(2.1mm*50mm，2μm)；
流动相：磷酸盐缓冲溶液：乙腈＝60:40(体积比)(磷酸盐缓冲溶液的配制方法：称取磷酸二氢钾9.11g，加水至1000mL，超声搅拌至充分溶解，加入三乙胺2mL，再用磷酸调节pH值至5.5)；
流速：0.3ml/min；检测波长：210nm；柱温：45℃；进样体积：5μL；
(1)采用克拉霉素制备不同浓度的标准品溶液，在上述参数下进行高效液相色谱法，制作标准曲线方程；方程为：A＝875.93C+9551.35(R2＝0.9999)；A为峰面积；C为克拉霉素浓度，单位为μg/mL；
(2)将待测液态产品在上述参数下进行高效液相色谱法，根据标准品位置比对目标峰，根据目标峰的峰面积，按标准曲线方程计算液态产品中的游离克拉霉素的浓度。
采用高效液相色谱法测定液态产品中的游离头孢呋辛酯的浓度的方法：
色谱仪：超高压液相色谱仪(型号：LC 2040 3D，产地：日本岛津公司)；
色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18(2.1mm*50mm，2μm)；
流动相：甲醇:乙酸铵缓冲液＝30：70(体积比)(乙酸铵缓冲液：0.1mol/L乙酸铵溶液，用乙酸调节pH值为4.51)；
流速：0.3ml/min；检测波长：278nm；柱温：35℃；进样体积：5μL；
(1)采用头孢呋辛酯制备不同浓度的标准品溶液，在上述参数下进行高效液相色谱法，制作标准曲线方程；方程为：A＝16878.3C-24275.2(R2＝0.9999)；A为峰面积；C为头孢呋辛酯浓度，单位为μg/ml。
(2)将待测液态产品在上述参数下进行高效液相色谱法，根据标准品位置比对目标峰，根据目标峰的峰面积，按标准曲线方程计算液态产品中的游离头孢呋辛酯的浓度。
克拉霉素醇质体OMV、头孢呋辛酯醇质体OMV、克拉霉素普通脂质体OMV、头孢呋辛酯普通脂质体OMV、克拉霉素OMV和头孢呋辛酯OMV的粒径、PDI和载药效率见表4。
表4
样品 粒径(nm) PDI 载药效率(％)
克拉霉素醇质体OMV 99.9 0.135 20.8
头孢呋辛酯醇质体OMV 105.7 0.259 18.4
克拉霉素普通脂质体OMV 91.2 0.248 14.5
头孢呋辛酯普通脂质体OMV 89.5 0.252 13.8
克拉霉素OMV -- -- 4.2
头孢呋辛酯OMV -- -- 3.7
以上结果表明，与步骤四的方法相比，步骤二的方法和步骤三的方法显著提高了克拉霉素和头孢呋辛酯的载药效率，其中步骤二的方法略优于步骤三的方法。
六、脂质体修饰OMV形成机理研究
为确认脂质体与OMV之间是否发生了膜融合的相互作用，采用荧光共振能量转移技术(FRET)进行测定。分别选择荧光染料5-十二烷酰氨基荧光素(DAF)和尼罗红(NR)为供体和受体。采用薄膜分散法制备单包载DAF脂质体(DAF-Lip)、单包载NR脂质体(NR-Lip)以及双包载DAF和NR脂质体(DAF/NR-Lip)。采用过膜挤出工艺，用双包载脂质体对OMV进行修饰。
1、制备脂质体
载荧光探针脂质体的制备：称取大豆卵磷脂40mg、胆固醇10mg和适量的荧光染料，用氯仿溶解，然后在30℃水浴中进行旋转蒸发以挥干溶剂并成膜，然后加入1.5mL蒸馏水40℃水化10min，然后采用超声波探头进行超声处理(150W；工作1s停1s，总时间为10min)，得到脂质体溶液。荧光染料采用DAF时，得到的脂质体溶液命名为DAF-Lip溶液，DAF-Lip溶液中DAF的浓度为1×10-5mol/L(DAF含量以制备时的加入量计)。荧光染料采用NR时，得到的脂质体溶液命名为NR-Lip溶液，NR-Lip溶液中NR的浓度为1×10-5mol/L(NR含量以制备时的加入量计)。荧光染料采用DAF和NR时，得到的脂质体溶液命名为DAF/NR-Lip溶液,DAF/NR-Lip溶液中DAF和NR的浓度均为1×10-5mol/L(DAF和NR含量均以制备时的加入量计)。
2、制备脂质体修饰OMV
取步骤一制备的OMV溶液，与DAF/NR-Lip溶液等体积混合，室温下用脂质体挤出器挤出(挤出压力为0.3Mpa，滤膜孔径为0.45μm，反复挤出10次)，得到脂质体修饰OMV，命名为DAF/NR-Lip-OMV。
3、荧光光谱测定
分别将适量DAF和NR溶于氯仿，使用荧光分光光度计进行荧光扫描，确定DAF和NR的最大激发波长和最大发射波长。
DAF-Lip、NR-Lip、DAF/NR-Lip和DAF/NR-Lip-OMV，分别使用荧光分光光度计进行荧光扫描。
结果见图5。DAF-Lip在520nm波长处产生最强荧光，在620nm波长处荧光强度非常弱。NR-Lip在620nm波长处产生最强荧光。DAF/NR-Lip，在620nm波长处荧光强度增加，表明在脂质体内，DAF将能量转移给NR，导致620nm荧光强度增加。DAF/NR-Lip-OMV，620nm波长处荧光强度明显降低，表明OMV与脂质体发生了相互作用，导致DAF与NR距离加大，破坏了共振能量转移。以上结果表明：脂质体与OMV之间发生了相互作用，其作用机制为膜融合作用。
载药脂质体修饰OMV形成机理的结构示意图见图6。
实施例3、体外抗菌活性试验
供试物分别为：实施例2制备的克拉霉素醇质体OMV制剂(标记为Lip-OMV-CLA)、实施例2制备的克拉霉素OMV制剂(标记为OMV-CLA)和克拉霉素(标记为Free CLA)。
供试菌分别为：金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、粪肠球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603)。供试菌用MH液体培养基悬浮，得到供试菌菌悬液。
熔融状态的MH固体培养基自然冷却，快要凝固时加入供试物(供试物提供克拉霉素，克拉霉素在体系中的浓度分别为512μg/mL-1/8μg/mL,2倍梯度)，然后倒平板。将供试菌以点接种的方式接种至平板上，接种量为104CFU/点。37℃静置培养24小时，然后观察。无菌生长的平板中含药物最小的浓度即为最低抑菌浓度(Minimal InhibitoryConcentration，MIC)。
MIC(单位为μg/mL)结果见表5。
表5
样品 金黄色葡萄球菌 粪肠球菌 大肠杆菌 肺炎克雷伯菌
Free CLA 0.125 64 128 64
OMV-CLA 0.125 8 8 32
Lip-OMV-CLA 0.063 4 4 32
克拉霉素醇质体OMV制剂对粪肠球菌的抗菌活性显著高于克拉霉素OMV制剂，更加显著的高于游离克拉霉素。克拉霉素醇质体OMV制剂对大肠杆菌的抗菌活性显著高于克拉霉素OMV制剂，更加显著的高于游离克拉霉素。克拉霉素醇质体OMV制剂对金黄色葡萄球菌的抗菌活性显著高于克拉霉素OMV制剂和游离克拉霉素。克拉霉素醇质体OMV制剂和克拉霉素OMV制剂对肺炎克雷伯菌的抗菌活性显著高于游离克拉霉素。
实施例4、体内抗菌活性试验
具体以大肠杆菌构建小鼠皮肤脓肿模型，使用组织匀浆平板计数法，考察样品的体内抗菌活性。
一、大肠杆菌悬液的制备
采用MH液体培养基悬浮大肠杆菌(ATCC25922)，得到菌浓度为1×108CFU/mL的大肠杆菌菌悬液。
二、小鼠皮肤脓肿模型的建立
将ICR小鼠(25g-30g，雌雄各半)在25℃、相对湿度为40％-60％的环境中正常饲养7天，然后称量并记录体重，然后通过腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL大肠杆菌菌悬液，然后继续正常饲养24小时，然后观察小鼠的进食、饮水情况以及精神状态，再次称量并记录体重，将右上肢皮肤表面的毛发剪去观察皮肤病变情况。
注射大肠杆菌菌悬液24小时后，所有小鼠均出现如下症状：右上肢皮肤均出现轻微隆起的脓肿现象，进食和饮水均有所减少，活动量下降，精神状态不佳。注射大肠杆菌菌悬液24小时后，部分小鼠出现轻微的腹泻现象，体重下降。症状表明，成功建立了小鼠皮肤脓肿模型。
三、分组给药
将50只小鼠皮肤脓肿模型随机分为5组(每组10只)，Free CLA组、OMV-CLA组、Lip-OMV-CLA组、OMV组和Control组。
Free CLA组：腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL克拉霉素溶液(溶剂为MH液体培养基，克拉霉素浓度为512μg/ml)，然后继续正常饲养24小时。
OMV-CLA组：腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL实施例2制备的克拉霉素OMV制剂(用MH液体培养基稀释，使克拉霉素浓度为512μg/ml)，然后继续正常饲养24小时。
Lip-OMV-CLA组：腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL实施例2制备的克拉霉素醇质体OMV制剂(用MH液体培养基稀释，使克拉霉素浓度为512μg/ml)，然后继续正常饲养24小时。
OMV组：腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL实施例2制备的OMV溶液，然后继续正常饲养24小时。
Control组：腹腔注射20％无菌乌来糖溶液(20μL/只)进行麻醉，然后使用无菌注射器向小鼠右上肢皮下注射500μL生理盐水，然后继续正常饲养24小时。
四、皮肤组织的采集
完成步骤三后，颈椎脱臼法处死小鼠，使用酒精棉球擦拭小鼠右上肢脓肿部位，使用无菌手术器械剪取约1cm2的病变皮肤，备用。
将采集的皮肤组织放入无菌试管，加入4mL无菌PBS缓冲液，使用匀浆机将组织制成匀浆，每一份组织样品均取100μL涂布于TSA培养基平板，37℃培养24h，统计菌落形成单位(CFU)。
结果见图7。OMV-CLA组和Lip-OMV-CLA组的组织样品的脓肿部位菌落形成单位显著低于另外三组，其中Lip-OMV-CLA组最低。结果表明，以脂质体修饰OMV为载体，包载抗菌药物所构成的脂质体修饰载药OMV递送系统，其体内抗菌效果优于相应的游离药物，而且优于未经脂质体修饰的OMV直接载药所构成的载药OMV递送系统。

Claims (5)

1.一种制备含载药细菌外膜囊泡的制剂的方法，包括如下步骤：以含载药脂质体的制剂和含细菌外膜囊泡的制剂为原料，制备得到含载药细菌外膜囊泡的制剂；所述方法中，由所述含载药脂质体的制剂提供药物，由所述含细菌外膜囊泡的制剂提供所述细菌外膜囊泡；所述药物为克拉霉素，所述含细菌外膜囊泡的制剂不负载药物；所述载药脂质体和所述细菌外膜囊泡通过膜融合的方式形成含载药细菌外膜囊泡的制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述药物和所述细菌外膜囊泡的质量配比为2：2-4。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述载药脂质体为载药普通脂质体或载药醇质体。
4.权利要求1-3中任一所述方法制备得到的含载药细菌外膜囊泡的制剂。
5.一种抗菌药物，其特征在于：所述抗菌药物含有权利要求4所述的含载药细菌外膜囊泡的制剂。
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