CN102188379A

CN102188379A - 载药脂质体的制备方法

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Publication number: CN102188379A
Application number: CN2010101313397A
Authority: CN
Inventors: 鲁翠涛; 赵应征
Original assignee: 鲁翠涛
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-03-18
Filing date: 2010-03-18
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2030-03-18
Also published as: CN102188379B

Abstract

本发明涉及一种载药脂质体的制备方法。该方法将采用二次冷冻干燥法制备包载水溶性药物脂质体，第一次冷冻干燥是在水相体系中进行，第二次冷冻干燥在有机相体系中进行，通用二次冷冻干燥法实现水溶性药物均匀包载于脂质体中，提高药物包封率，减少包载水溶性药物脂质体的突释效应。本发明的脂质体适于包裹各种水溶性药物，并且适用剂型范围广。

Description

载药脂质体的制备方法

【技术领域】

本发明属于药物制剂学领域，更具体地说，本发明涉及一种载药脂质体的制备方法。

【背景技术】

脂质体(liposomes)是一种由排列有序的脂质双分子层组成的单层或多层微囊。脂质体属于胶体系统，具有类似细胞的结构，与细胞膜亲和力强，可以增加被包封药物透过细胞膜的能力。脂质体生物相容性好，可实现药物体内靶向递送，具有延长药物作用时间、增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性，增强药理作用等诸多优点。

制备脂质体的方法很多，有薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、注入法、超声波分散法等。目前脂质体用于包载脂溶性药物较好，而包载水溶性药物时脂质体包封率较低，通常达不到80％包封率的最低要求。尽管有报道利用逆相蒸发法等制备包载水溶性药物脂质体的方法，但该方法药物突释效应明显，不能满足药典相应的规定。

采用pH梯度法等主动载药技术可以提高脂质体对于水溶性药物包载量，但是主动载药技术操作较为繁琐，重现性差，很难工业化批量制备。

此外，大多数制备方法得到的脂质体一般是呈液体状态，其保存、运输等均比较困难，易受环境条件变化的影响而出现絮凝、聚团、沉淀、药物渗漏等问题，且在体内作用时间较短，影响制剂的有效、安全和稳定。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是针对现有制备包载水溶性药物的脂质体的不足之处，提供一种解决方案。

我们在制备包载水溶性药物的脂质体实验中发现，水溶性药物很难溶解或均匀分散于中等极性或弱极性有机溶剂中，因此不能与磷脂材料共同分散于有机相体系中制备脂质体。但是有一些两亲性高分子材料如聚乙二醇、泊洛沙姆、聚维酮等，很容易分散于水和中等极性甚至弱极性有机溶剂中。因此我们将水溶性药物与两亲性高分子材料先溶解于水相体系中，进行第一次冷冻干燥处理，然后将包含水溶性药物的冻干粉末与脂质体成膜材料均匀分散于有机相体系中进行第二次冷冻干燥处理，实现水溶性药物均匀包载于脂质体中，提高药物在脂质体的包封率，减少包载水溶性药物脂质体的突释效应。

经过多次试验，为提高载药脂质体制备效率，本发明采用了以下的技术方案：

本发明的一种载药脂质体的制备方法，是将水溶性药物与两亲性高分子材料溶解于水相体系中，进行第一次冷冻干燥处理，然后将包含水溶性药物的冻干粉与脂质体成膜材料均匀分散于有机相体系中，进行第二次冷冻干燥方法，制成包载水溶性药物脂质体，实现水溶性药物均匀包载在于脂质体中，提高药物在脂质体的包封率，减少包载水溶性药物脂质体的突释效应。

上述的水溶性药物是指不溶于中等或弱极性有机溶剂的亲水性强的药物，包括发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的中药有效成分、化学药物、氨基酸、多肽或蛋白药物。

上述的两亲性高分子材料是指药学上公认的天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料，包括聚乙二醇、泊洛沙姆、聚维酮和聚乙烯醇。

上述的脂质体成膜材料包括氢化磷脂、合成磷脂、胆固醇和表面活性剂，氢化磷脂包括：氢化蛋黄磷脂和/或氢化大豆磷脂；合成磷脂是指药学已公知的合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物，包括：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸其中一种或几种以及它们的聚乙二醇修饰衍生物；表面活性剂包括：吐温系列、司盘系列、油酸、十六醇、十八醇、甘油、丙二醇。

上述的有机相是指碳数在10以内的直链、支链的醇，优选叔丁醇。

上述的水相体系和有机相体系中可以含有药学公知的表面活性剂、多元醇或糖类、高分子骨架支持剂、抗氧剂、稳定剂、缓冲盐。

上述的包载水溶性药物的脂质体粒径可以是微米级或纳米级。

上述的包载水溶性药物的脂质体可以进一步通过透析、离心、层析的处理方法去除脂质碎片和多余盐离子。

上述的包载水溶性药物脂质体可以进一步加工，形成口服、黏膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。

上述的包载水溶性药物脂质体的制备方法具有以下优点：

1.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法提高水溶性药物在脂质体的包封率，明显减少包载水溶性药物的渗漏。

2.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法减少包载水溶性药物脂质体的突释效应，延长水溶性药物的释放，达到缓释效果。

3.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法适于包裹多种水溶性药物，尤其适用于包载易氧化的药物、热不稳定的药物和具有生物活性的氨基酸、多肽、蛋白类药物。

4.本发明制备的包载水溶性药物脂质体成品为固态，稳定性高，适用剂型广泛，可以进一步加工，形成口服、黏膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。

注：突释效应(dumping或burst effect)，药物释放首先是粘附在微粒表面的少量药物发生初期的快速释放，称为突释效应。中华人民共和国药典(2005版)规定，脂质体等载药微粒在开始0.5h内的释放量应低于40％。

【具体实施方式】

现结合下列实例来进一步描述本发明。

以下通过几个实施例来进一步说明本发明。

实施例1：双氯芬酸钠脂质体

本发明的第一个实施方案采用双氯芬酸钠为靶药，两亲性高分子材料选用聚维酮(PVP)，脂质体成膜材料选用氢化大豆磷脂、胆固醇、吐温80和十六醇，制备包载双氯芬酸钠的脂质体。

实验组：20mg聚维酮(PVP)溶解于6ml水中，加入8mg双氯芬酸钠完全溶解，装于西林瓶中，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，20h)得到双氯芬酸钠固态冻干品。20mg氢化大豆磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80和2mg十六醇共同溶于20ml叔丁醇，在65℃水浴中溶解，加入双氯芬酸钠固态冻干品，完全溶解，加入120mg甘露醇(PVP)，分散均匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载双氯芬酸钠的脂质体固态冻干品。

对照组：20mg氢化大豆磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80和2mg十六醇共同溶于20ml叔丁醇，在65℃水浴中溶解，加入8mg双氯芬酸钠微粉(粒径在15μm以下)分散均匀，加入120mg甘露醇，完全混匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载双氯芬酸钠的脂质体固态冻干品。

实验组和对照组分别注入蒸馏水5ml，轻微摇动，即得到包载双氯芬酸钠的脂质体混悬液，然后进行以下测定。

包封率测定：取双氯芬酸钠脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取含有游离双氯芬酸钠的上层溶液2ml，用紫外-可见分光光度计于274nm测吸收度，代入双氯芬酸钠标准曲线，利用“包封率(％)＝[(双氯芬酸钠总量-游离双氯芬酸钠量)/双氯芬酸钠总量]×100”公式计算双氯芬酸钠脂质体的包封率。双氯芬酸钠脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

双氯芬酸钠标准曲线：精密称取双氯芬酸钠标准品，用蒸馏水配制成0.1、0.2，0.5，1.0，2.5mg/ml的系列标准溶液，于274nm测吸收度，得到双氯芬酸钠浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算双氯芬酸钠的浓度。

结果：实验组双氯芬酸钠脂质体包封率平均值为82％，而对照组包封率平均值为51％。25℃放置0.5h后实验组双氯芬酸钠脂质体包封率平均值为68％，0.5h内的释放量低于40％，避免了脂质体的突释效应。而对照组25℃放置0.5h后包封率平均值降为28％，0.5h内的释放量超过40％，脂质体存在突释效应。结果表明本发明制备的双氯芬酸钠脂质体有效提高了双氯芬酸钠的包封率，避免了脂质体的突释效应，从而延长了双氯芬酸钠脂质体的释放作用。

实施例2：盐酸阿霉素脂质体

本发明的第二个实施方案采用盐酸阿霉素为靶药，两亲性高分子材料聚乙二醇(PEG 2000)，脂质体成膜材料选用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)和司盘85，制备包载盐酸阿霉素的脂质体。

实验组：15mg聚乙二醇(PEG 2000)溶解于6ml水中，加入5mg盐酸阿霉素完全溶解，装于西林瓶中，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，20h)得到盐酸阿霉素固态冻干品。5mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1mg聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、2mg司盘85加入20ml叔丁醇中，在65℃水浴中溶解，加入盐酸阿霉素固态冻干品，加入100mg聚乙二醇(PEG 2000)，分散均匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载盐酸阿霉素的脂质体固态冻干品。

对照组：5mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、1mg聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、2mg司盘85加入20ml叔丁醇中，在65℃水浴中溶解，加入5mg盐酸阿霉素微粉(粒径在15μm以下)分散均匀，加入100mg聚乙二醇(PEG 2000)，完全混匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载盐酸阿霉素的脂质体固态冻干品。

实验组和对照组分别注入蒸馏水5ml，轻微摇动，即得到包载盐酸阿霉素的脂质体混悬液，然后进行以下测定。

包封率测定：取盐酸阿霉素脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取0.5ml含有游离盐酸阿霉素的上层溶液，用紫外-可见分光光度计于480nm测吸收度，代入盐酸阿霉素标准曲线，利用“包封率(％)＝[(盐酸阿霉素总量-游离盐酸阿霉素量)/盐酸阿霉素总量]×100”公式计算盐酸阿霉素脂质体的包封率。盐酸阿霉素脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

盐酸阿霉素标准曲线：精密称取盐酸阿霉素标准品，用蒸馏水配制成0.25、0.5，1.0，2.0，5.0mg/ml的系列标准溶液，于480nm测吸收度，得到盐酸阿霉素浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算盐酸阿霉素的浓度。

结果：盐酸阿霉素脂质体包封率平均值为84％，而对照组包封率平均值为42％。25℃放置0.5h后盐酸阿霉素脂质体包封率平均值为73％，未显示突释效应。而对照组25℃放置0.5h后包封率平均值降为16％，具有明显突释效应。结果表明本发明制备的盐酸阿霉素脂质体有效提高药物的包封率，避免了脂质体的突释效应，提高其制剂的安全性和稳定性。

实施例3：重组人生长激素脂质体

本发明的第三个实施方案采用蛋白类药物重组人生长激素为对象，两亲性高分子材料选用泊洛沙姆(Poloxamer 188)，脂质体成膜材料选用氢化大豆磷脂、胆固醇、吐温80和丙二醇，制备包载重组人生长激素的脂质体。

实验组：20mg泊洛沙姆(Poloxamer 188)溶解于6ml水中，加入1ml重组人生长激素(5mg/ml)完全混匀，装于西林瓶中，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，20h)得到重组人生长激素固态冻干品。20mg氢化大豆磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80和4mg丙二醇共同溶于20ml叔丁醇，在65℃水浴中溶解，加入重组人生长激素固态冻干品，完全溶解，加入150mg甘露醇(PVP)，分散均匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载重组人生长激素的脂质体固态冻干品。

对照组：20mg氢化大豆磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80和4mg丙二醇共同溶于20ml叔丁醇，在65℃水浴中溶解，加入1ml重组人生长激素(5mg/ml)分散均匀，加入150mg甘露醇，完全混匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载重组人生长激素的脂质体固态冻干品。

实验组和对照组分别注入蒸馏水2ml，轻微摇动，即得到包载重组人生长激素的脂质体混悬液，然后进行以下测定。

包封率测定：包载重组人生长激素的脂质体混悬液经过Sephadex G-75凝胶柱洗脱，将游离重组人生长激素与包载到脂质体中的重组人生长激素分离，以考马斯亮蓝G-250染色法测定收集的游离重组人生长激素溶液的含量，利用“包封率(％)＝[(重组人生长激素总量-游离重组人生长激素量)/重组人生长激素总量]×100”公式计算重组人生长激素脂质体的包封率。重组人生长激素脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

结果：实验组重组人生长激素脂质体包封率平均值为88％，而对照组包封率平均值为38％。25℃放置0.5h后实验组重组人生长激素脂质体包封率平均值为80％，0.5h内的释放量低于40％，避免了脂质体的突释效应。而对照组25℃放置0.5h后包封率平均值降为18％，0.5h内的释放量超过40％，脂质体存在突释效应。结果表明本发明制备的重组人生长激素脂质体有效提高了重组人生长激素的包封率，避免了脂质体的突释效应，从而延长了重组人生长激素脂质体的释放作用。

实施例4：盐酸伊立替康脂质体

本发明的第四个实施方案采用盐酸伊立替康为靶药，两亲性高分子材料泊洛沙姆(Poloxamer 188)，脂质体成膜材料选用氢化蛋黄磷脂、胆固醇、吐温80，制备包载盐酸伊立替康的脂质体。

实验组：15mg泊洛沙姆(Poloxamer 188)溶解于6ml水中，加入5mg盐酸伊立替康完全溶解，装于西林瓶中，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，20h)得到盐酸伊立替康固态冻干品。20mg氢化蛋黄磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80加入20ml叔丁醇中，在65℃水浴中溶解，加入盐酸伊立替康固态冻干品，加入100mg泊洛沙姆(Poloxamer 188)，分散均匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载盐酸伊立替康的脂质体固态冻干品。

对照组：20mg氢化蛋黄磷脂、6mg胆固醇、2mg吐温80加入20ml叔丁醇中，在65℃水浴中溶解，加入5mg盐酸伊立替康微粉(粒径在15μm以下)分散均匀，加入100mg1泊洛沙姆(Poloxamer 188)，完全混匀，装于西林瓶中-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，24h)得到包载盐酸伊立替康的脂质体固态冻干品。

实验组和对照组分别注入蒸馏水5ml，轻微摇动，即得到包载盐酸伊立替康的脂质体混悬液，然后进行以下测定。

包封率测定：取盐酸伊立替康脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取2ml含有游离盐酸伊立替康的上层溶液，用紫外-可见分光光度计于370nm测吸收度，代入盐酸伊立替康标准曲线，利用“包封率(％)＝[(盐酸伊立替康总量-游离盐酸伊立替康量)/盐酸伊立替康总量]×100”公式计算盐酸伊立替康脂质体的包封率。盐酸伊立替康脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

盐酸伊立替康标准曲线：精密称取盐酸伊立替康标准品，用蒸馏水配制成0.25、0.5，1.0，2.0，5.0mg/ml的系列标准溶液，于370nm测吸收度，得到盐酸伊立替康浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算盐酸伊立替康的浓度。

结果：盐酸伊立替康脂质体包封率平均值为81％，而对照组包封率平均值为35％。25℃放置0.5h后盐酸伊立替康脂质体包封率平均值为69％，未显示突释效应。而对照组25℃放置0.5h后包封率平均值降为12％，具有明显突释效应。结果表明本发明制备的盐酸伊立替康脂质体有效提高药物的包封率，避免了脂质体的突释效应。

实施例5：盐酸伊立替康脂质体注射剂

本发明的第五个实施方案采用实施例3制备的盐酸伊立替康脂质体进一步加工制备盐酸伊立替康脂质体注射剂。

将实施例3实验组制得的盐酸伊立替康脂质体混悬液通过0.8μm的微孔滤膜进行整粒，整粒后的脂质体经葡聚糖凝胶柱洗脱，将游离的盐酸伊立替康与包载盐酸伊立替康的脂质体分开。将包载盐酸伊立替康脂质体封装于5ml的安瓿中，⁶⁰Co辐射灭菌(RAD＝150～180万)，制成盐酸伊立替康脂质体注射剂。盐酸伊立替康脂质体注射剂取样进行电镜形态观察，包载盐酸伊立替康的脂质体形态圆整，均匀，无聚团，粒径分布600-800nm。结果表明包载盐酸伊立替康的脂质体可以制成注射剂等具体制剂，形态保持较好，稳定性较高。

在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。

Claims

1.一种载药脂质体的制备方法，其特征在于：将水溶性药物与两亲性高分子材料溶解于水相体系中，进行第一次冷冻干燥处理，然后将包含水溶性药物的冻干粉与脂质体成膜材料均匀分散于有机相体系中，进行第二次冷冻干燥方法，制成包载水溶性药物的脂质体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的水溶性药物是指不溶于中等或弱极性有机溶剂的亲水性强的药物，包括发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的中药有效成分、化学药物、氨基酸、多肽或蛋白药物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的两亲性高分子材料是指药学上公认的天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料，包括聚乙二醇、泊洛沙姆、聚维酮和聚乙烯醇。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的脂质体成膜材料包括氢化磷脂或合成磷脂、胆固醇和表面活性剂，氢化磷脂包括：氢化蛋黄磷脂或氢化大豆磷脂；合成磷脂是指药学已公知的合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物，包括：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸其中一种或几种以及它们的聚乙二醇修饰衍生物；表面活性剂包括：吐温系列、司盘系列、油酸、十六醇、十八醇、甘油、丙二醇。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的有机相是指碳数在10以内的直链、支链的醇。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的有机相是叔丁醇。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的水相体系和有机相体系中还含有药学公知的表面活性剂、多元醇或糖类、高分子骨架支持剂、抗氧剂、稳定剂、缓冲盐中的一种或几种。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的包载水溶性药物的脂质体粒径是微米级或纳米级。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的包载水溶性药物的脂质体进一步通过透析、离心、层析的处理方法去除脂质碎片和多余盐离子。