CN102188378B - 包载水溶性药物脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包载水溶性药物脂质体的制备方法。该制备方法包括：将成盐形式的药物、磷脂材料溶于有机溶剂中，形成有机相体系；配制与有机相体系pH值不同的水溶液缓冲体系作为水相体系；有机相体系采用注入法与水相体系混合，形成脂质体，药物在从有机相体系混合到水相体系过程中因pH值的改变导致溶解度降低，从而包载于形成的脂质体中。本发明的制备方法将传统乙醇注入法结合pH梯度法，在内相注入外相同时利用内外相pH差异，一步完成脂质体的制备和药物包载，减少传统包载水溶性药物脂质体的制备方法的复杂性。

Description

包载水溶性药物脂质体的制备方法

【技术领域】

本发明属于药物制剂学领域，更具体地说，本发明涉及一种包载水溶性药物脂质体的制备方法。

【背景技术】

脂质体(liposomes)是一种由排列有序的脂质双分子层组成的单层或多层微囊。脂质体属于胶体系统，具有类似细胞的结构，与细胞膜亲和力强，可以增加被包封药物透过细胞膜的能力。脂质体生物相容性好，可实现药物体内靶向递送，具有延长药物作用时间、增加药物的体内外稳定性、降低药物毒性，增强药理作用等诸多优点。

制备脂质体的方法很多，有薄膜分散法、逆相蒸发法、冷冻干燥法、注入法、超声波分散法等，其中注入法操作较为简便。注入法是将磷脂与胆固醇等类脂质及脂溶性药物共溶于乙醚或乙醇中，然后将此药液经注射器缓缓注入于搅拌下的50℃磷酸盐缓冲液(可含有水溶性药物)中，加完后，不断搅拌，采用低温蒸发方法除去乙醚或乙醇，即制得脂质体。可以将脂质体混悬液通过高压乳匀方法，得到粒径均一的单室脂质体。该方法目前用于制备空白脂质体或包载脂溶性药物的脂质体，而制备包载水溶性药物的脂质体的包封率不高。目前采用薄膜分散法、逆相蒸发法等其它制备脂质体的方法包载水溶性药物，尽管有时包封率较高，但操作较为繁琐，重现性差，很难工业化批量制备。

提高脂质体包载水溶性药物的方法分为主动载药技术和被动载药技术。利用被动载药技术很难将水溶性的弱酸或弱碱药物包载入脂质体，人们采用主动载药技术进行这类药物的包载。主动载药技术是利用一些两亲性的弱酸或弱碱能够以电中性的形式跨越脂质双层，但其电离形势却不能跨越脂质双层的原理来实现的。主动载药技术中又分为pH梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法等。

主动载药技术中的pH梯度法过程如下：采用逆相蒸发法等方法制备包裹酸性缓冲盐(如柠檬酸缓冲盐)的空白脂质体，然后用碱把外相调成中性，建立脂质体内外的pH梯度。药物在外相的中性pH环境下以亲脂性的中性形式存在，能够透过脂质双层膜，而在脂质体内水相中被质子化转化成离子形式，不能再透过脂质双层回到外水相，从而包载到脂质体内。但已有的主动载药技术pH梯度法均是先形成空白脂质体，然后利用调整外相pH值，利用pH梯度将药物由外相转入内相体系，操作分为制备空白脂质体、调整pH值形成pH梯度后包载药物两个过程，较为复杂。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是针对现有pH梯度法制备包载水溶性药物脂质体的不足之处，提供一种快速方便的包载水溶性药物脂质体的制备方法。

本发明的目的是针对现有的pH梯度法制备包载水溶性药物脂质体的不足之处，提供一种解决方案。

我们在研究pH梯度法制备载药脂质体的实验中发现，有些弱酸或弱碱的药物成盐后可以溶解于甲醇、乙醇等有机溶剂中，而乙醇注入法是空白脂质体的一种常用制备方法。我们试将一些成盐后弱酸或弱碱的药物溶于乙醇，然后采用注入法转入到不同pH值的水性缓冲体系中，得到包载药物的脂质体。该方法将乙醇注入法制备空白脂质体和利用pH梯度包载药物两个过程合二为一，简化了操作过程，快捷方便。

经过多次试验，为提高载药脂质体制备效率，本发明采用了以下的技术方案：

本发明涉及一种包载水溶性药物脂质体的制备方法，是将成盐形式的药物、磷脂材料溶于有机溶剂中，形成有机相体系；配制与有机相体系pH值不同的水溶液缓冲体系作为水相体系；有机相体系采用注入法与水相体系混合，形成脂质体，药物在从有机相体系混合到水相体系过程中因pH值的改变导致溶解度降低，从而包载于脂质体中形成包载水溶性药物的脂质体。

上述的成盐形式的药物是指酸性药物与无机碱或有机碱盐形成的盐，或碱性药物与无机或有机酸形成的盐。

上述的磷脂材料包括氢化磷脂、合成磷脂、胆固醇和表面活性剂，氢化磷脂包括：氢化蛋黄磷脂和/或氢化大豆磷脂；合成磷脂是指药学已公知的合成磷脂及其聚乙二醇修饰衍生物，包括：二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸其中一种或几种以及它们的聚乙二醇修饰衍生物；表面活性剂包括：吐温、司盘、油酸、十六醇、十八醇、甘油、丙二醇、泊洛沙姆。

上述的有机溶剂是中等或强极性有机溶剂，优选乙醇。

上述的配制与有机相体系pH值不同的水溶液缓冲体系，是采用药学上公知的无机或有机缓冲对配制的水溶液，或采用无机或有机酸溶液，或采用无机或有机碱溶液。

上述的水溶液缓冲体系中可以含有药学公知的表面活性剂、多元醇或糖类、水溶性高分子聚合物、抗氧剂、稳定剂。

上述的包载水溶性药物的脂质体可以进一步通过高压均质方法得到粒径在10-1000nm范围内的单室脂质体。

上述的包载水溶性药物的脂质体可以进一步通过透析、离心、层析的处理方法去除脂质碎片和多余盐离子，然后经过干燥方法得到载药脂质体干燥品。

上述的包载水溶性药物脂质体可以进一步加工，形成口服、黏膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。

上述的包载水溶性药物脂质体的制备方法具有以下优点：

1.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法将传统乙醇注入法结合pH梯度法，在内相注入外相同时利用内外相pH差异，一步完成脂质体的制备和药物包载，减少传统包载水溶性药物脂质体的制备方法的复杂性。

2.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法提高水溶性药物在脂质体的包封率，明显减少包载水溶性药物的渗漏。

3.本发明的包载水溶性药物脂质体的制备方法适于包裹多种水溶性药物，结合减压蒸发技术，可以适用于包载易氧化的药物、热不稳定的药物。

4.本发明包载水溶性药物脂质体的制备方法适于包裹多种成盐形式的药物，所制备的载药脂质体可以进一步加工，形成口服、黏膜、注射、皮肤给药制剂的原料，制成发挥预防、治疗、保健、清洁、美容作用的具体制剂。

【具体实施方式】

现结合下列实例来进一步描述本发明。

以下通过几个实施例来进一步说明本发明。

实施例1：盐酸伊立替康脂质体

本发明的第一个实施方案制备强酸弱碱盐的脂质体，采用盐酸伊立替康为靶药，脂质体成膜材料选用二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、胆固醇和吐温85，有机相溶剂为乙醇，水相为含有水溶性高分子聚合物羟乙基淀粉的磷酸盐缓冲液(pH7.5-8.0)，制备包载盐酸伊立替康的脂质体。

制备方法：5mg盐酸伊立替康、5mg二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、0.5mg聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG2000)、2mg胆固醇和2mg吐温85加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相。0.4g羟乙基淀粉(型号130/0.4)加入pH＝8.0的50ml 0.025mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，溶解后构成水相。将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的(55±2)℃的水相中，保持1000r/min搅拌10min，形成脂质体混悬液，水浴35℃真空旋转蒸发除尽乙醇，浓缩至总体积50ml，得到包载盐酸伊立替康的脂质体混悬液。

包封率测定：取包载盐酸伊立替康的脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取2ml含有游离盐酸伊立替康的上层溶液，用紫外-可见分光光度计于370nm测吸收度，代入盐酸伊立替康标准曲线，利用“包封率(％)＝[(盐酸伊立替康总量-游离盐酸伊立替康量)/盐酸伊立替康总量]×100”公式计算盐酸伊立替康脂质体的包封率。盐酸伊立替康脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

盐酸伊立替康标准曲线：精密称取盐酸伊立替康标准品，用蒸馏水配制成0.25、0.5，1.0，2.0，5.0mg/ml的系列标准溶液，于370nm测吸收度，得到盐酸伊立替康浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算盐酸伊立替康的浓度。

结果：盐酸伊立替康脂质体包封率平均值为82％，25℃放置0.5h后盐酸伊立替康脂质体包封率平均值为69％，0.5h药物释放率低于40％。结果表明，本发明制备的盐酸伊立替康脂质体药物的包封率高，达到药典相应的规定，没有突释效应。

实施例2：双氯芬酸钠脂质体

本发明的第二个实施方案制备强碱弱酸盐的脂质体，采用双氯芬酸钠为靶药，脂质体成膜材料选用氢化大豆磷脂、胆固醇、司盘80和十六醇，有机相溶剂为乙醇，水相为醋酸-醋酸钠缓冲液，加入水溶性高分子聚合物聚乙烯醇(PVA)，制备包载双氯芬酸钠的脂质体。

制备方法：5mg双氯芬酸钠、40mg氢化大豆磷脂、10mg胆固醇脂质和3mg司盘80加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相。0.1g丙二醇和0.5g聚乙烯醇(PVA)加入pH＝5.5的30ml 0.035mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，溶解后构成水相。将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的60℃的水相中，55℃水浴中1000r/min搅拌，蒸发至无乙醇味，得到包载双氯芬酸钠的脂质体混悬液。

包封率测定：取双氯芬酸钠脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取含有游离双氯芬酸钠的上层溶液2ml，用紫外-可见分光光度计于274nm测吸收度，代入双氯芬酸钠标准曲线，利用“包封率(％)＝[(双氯芬酸钠总量-游离双氯芬酸钠量)/双氯芬酸钠总量]×100”公式计算双氯芬酸钠脂质体的包封率。双氯芬酸钠脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

双氯芬酸钠标准曲线：精密称取双氯芬酸钠标准品，用蒸馏水配制成0.05、0.1，0.25，1.0，2.0mg/ml的系列标准溶液，于274nm测吸收度，得到双氯芬酸钠浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算双氯芬酸钠的浓度。

结果：实验组双氯芬酸钠脂质体包封率平均值为81％，25℃放置0.5h后实验组双氯芬酸钠脂质体包封率平均值为68％，0.5h药物释放率低于40％。结果表明，本发明制备的盐酸阿霉素脂质体药物的包封率高，达到药典相应的规定，没有突释效应。

实施例3：盐酸阿霉素脂质体

本发明的第一个实施方案制备纳米级脂质体，采用盐酸阿霉素为靶药，脂质体成膜材料选用氢化蛋黄磷脂、胆固醇、吐温80，有机相溶剂为乙醇，水相为含稳定剂丙二醇和水溶性高分子聚合物泊洛沙姆(Poloxamer 188)的磷酸盐缓冲液(pH7.5-8.0)，通过高压均质方法得到粒径在纳米范围内的包载盐酸阿霉素的单室脂质体。

制备方法：5mg盐酸阿霉素、10mg氢化蛋黄磷脂、5mg胆固醇和3mg吐温80加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相。0.1g丙二醇和0.5g泊洛沙姆(Poloxamer 188)加入pH＝8.0的30ml 0.035mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，溶解后构成水相。将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的(55±2)℃的水相中，保持1000r/min搅拌10min，形成脂质体混悬液，水浴35℃真空旋转蒸发除尽乙醇，浓缩至总体积30ml，得到包载盐酸阿霉素的脂质体混悬液，经高压通过0.65μm滤膜，得到包载盐酸阿霉素的单室脂质体。

包封率测定：取包载盐酸阿霉素的脂质体混悬液经过10000r/min离心1min，吸取2ml含有游离盐酸阿霉素的上层溶液，用紫外-可见分光光度计于480nm测吸收度，代入盐酸阿霉素标准曲线，利用“包封率(％)＝[(盐酸阿霉素总量-游离盐酸阿霉素量)/盐酸阿霉素总量]×100”公式计算盐酸阿霉素脂质体的包封率。盐酸阿霉素脂质体混悬液样品25℃放置0.5h后再次测定包封率。

盐酸阿霉素标准曲线：精密称取盐酸阿霉素标准品，用蒸馏水配制成0.05、0.1，0.5，1.0，2.5mg/ml的系列标准溶液，于480nm测吸收度，得到盐酸阿霉素浓度与吸收度的标准曲线，利用该标准曲线计算盐酸阿霉素的浓度。

结果：经过激光粒径分析仪测定，盐酸阿霉素脂质体粒径分布400-650nm，粒子分布均匀。盐酸阿霉素脂质体包封率平均值为82％，25℃放置0.5h后盐酸阿霉素脂质体包封率平均值为65％，0.5h药物释放率低于40％。结果表明，本发明制备的盐酸阿霉素纳米级脂质体微粒形态好，药物的包封率高，达到药典相应的规定，没有突释效应。

例4：盐酸阿霉素脂质体注射剂

本发明的第四个实施方案采用实施例3制备的盐酸阿霉素脂质体进一步加工，制备盐酸阿霉素脂质体注射剂。

制备方法：将实施例3制得的盐酸阿霉素脂质体混悬液经葡聚糖凝胶柱洗脱，去除游离的盐酸阿霉素和脂质碎屑，分离出包载盐酸阿霉素的脂质体。将包载盐酸阿霉素脂质体定溶于5ml pH＝7.5磷酸盐缓冲液(PBS)中，加200mg甘露醇作为支持剂，分装于10ml的西林瓶中，-30℃冷冻5小时，冷冻干燥(5×10^-4Pa，20h)，制成盐酸阿霉素脂质体冻干注射剂。

结果：盐酸阿霉素脂质体冻干注射剂，以生理盐水溶解后进行电镜形态观察，包载盐酸阿霉素的脂质体形态圆整，粒径略有增加，范围500-700nm，分布均匀，无聚团现象。结果表明包载盐酸阿霉素的脂质体可以制成注射剂等具体制剂，形态保持较好，稳定性较高。

Claims (3)

1.一种盐酸伊立替康脂质体的制备方法，其中，采用盐酸伊立替康为靶药，脂质体成膜材料选用二硬脂酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇和吐温85，有机相溶剂为乙醇，水相为含有水溶性高分子聚合物羟乙基淀粉的磷酸盐缓冲液，其pH为7.5-8.0，制备包载盐酸伊立替康的脂质体，制备步骤如下：

1）将5mg盐酸伊立替康、5mg二硬脂酰磷脂酰胆碱、0.5mg聚乙二醇2000接枝的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、2mg胆固醇和2mg吐温85加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相；

2）将0.4g型号为130/0.4的羟乙基淀粉加入pH＝8.0的50ml 0.025mol/L磷酸盐缓冲液中，溶解后构成水相；

3）将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的55±2℃的水相中，保持1000r/min搅拌10min，形成脂质体混悬液，水浴35℃真空旋转蒸发除尽乙醇，浓缩至总体积50ml，得到包载盐酸伊立替康的脂质体混悬液。

2.一种双氯芬酸钠脂质体的制备方法，其中，采用双氯芬酸钠为靶药，脂质体成膜材料选用氢化大豆磷脂、胆固醇、司盘80和十六醇，有机相溶剂为乙醇，水相为醋酸-醋酸钠缓冲液，加入水溶性高分子聚合物聚乙烯醇，制备步骤如下：

1）将5mg双氯芬酸钠、40mg氢化大豆磷脂、10mg胆固醇脂质和3mg司盘80加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相；

2）将0.1g丙二醇和0.5g聚乙烯醇加入pH＝5.5的30ml 0.035mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，溶解后构成水相；

3）将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的60℃的水相中，55℃水浴中1000r/min搅拌，蒸发至无乙醇味，得到包载双氯芬酸钠的脂质体混悬液。

3.一种盐酸阿霉素脂质体的制备方法，采用盐酸阿霉素为靶药，脂质体成膜材料选用氢化蛋黄磷脂、胆固醇、吐温80，有机相溶剂为乙醇，水相为含丙二醇和型号为Poloxamer 188的泊洛沙姆的磷酸盐缓冲液，其pH为7.5-8.0，制备步骤如下：

1）将5mg盐酸阿霉素、10mg氢化蛋黄磷脂、5mg胆固醇和3mg吐温80加入到25ml无水乙醇中，60℃水浴中加热至完全溶解，构成有机相；

2）0.1g丙二醇和0.5g型号为Poloxamer 188的泊洛沙姆加入pH＝8.0的30ml 0.035mol/L磷酸盐缓冲液中，溶解后构成水相；

3）将有机相用注射器吸取，注入到1000r/min搅拌的55±2℃的水相中，保持1000r/min搅拌10min，形成脂质体混悬液，水浴35℃真空旋转蒸发除尽乙醇，浓缩至总体积30ml，得到包载盐酸阿霉素的脂质体混悬液，经高压通过0.65μm滤膜，得到包载盐酸阿霉素的单室脂质体。