CN115737565B

CN115737565B - 一种五味子乙素脂质体及其制备方法

Info

Publication number: CN115737565B
Application number: CN202211607478.1A
Authority: CN
Inventors: 王宁; 慈大正; 张�杰; 江岭; 钱沐阳
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2024-05-28
Anticipated expiration: 2042-12-14
Also published as: CN115737565A

Abstract

本发明提供了一种五味子乙素脂质体及其制备方法。本发明的五味子乙素脂质体的制备方法，包括如下步骤：S1：将五味子乙素与脂质类膜材溶于有机溶剂，制得油相；S2：将冻干保护剂溶于水或水溶液中，制得水相；S3：将油相与水相混合后乳化，制得O/W乳剂；S4：对O/W乳剂进行冷冻干燥，制得五味子乙素脂质体。本发明的制备方法包封率及载药量高，制备的五味子乙素脂质体平均粒径及平均PDI小，分散性好且分布均匀，水溶性好，有利于提高药物的生物利用度。

Description

一种五味子乙素脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种五味子乙素脂质体及其制备方法。

背景技术

传统中药五味子中含有多种成分，主要包括木脂素、多糖、有机酸、挥发油等，其中木脂素是最为主要的，含量大约为2-8%。目前，国内外研究学者已经从五味子植物中分离出了200多个组分，其中大约含有150多种木脂素化合物，主要包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子酚、五味子乙素、五味子酯甲等。五味子乙素是五味子中木脂素类的主要成分，它能降低肝细胞的转氨酶活性，抑制脂质过氧化，具有抗氧化、护肝、抗肿瘤等功效。五味子乙素的水溶性很差，不易被人体所吸收，因此其剂型的开发及应用受到了一定的限制。

脂质体是由类脂质双分子层形成的微型囊泡，其主要组成是一种人工膜，具有类脂质双分子层所具有的特性。当遇到非极性药物时，脂质体的疏水尾部与药物结合并聚集，将药物包裹在缝隙中，而亲水头部则分散在水相中形成直径为25-1000nm的微型囊泡。因此，脂质体可以作为载体将一些不容易被细胞膜吸收的药物和疫苗送入细胞膜，这使得脂质体在临床研究中具有比其它载体更好的药物代谢动力学和生物分布性质。同时，由于脂质体由可降解的双分子磷脂膜组成，因此还具有组织相容性好、安全无毒、能包裹各种药物分子、增强药物穿透细胞膜的能力、增强药物对细胞的亲和力并改变药物在动物体内的分布、改变药物的代谢及排泄等药代动力学特性等优势；此外，由于脂质体可以在体内缓慢释放，从而延长了药物在体内的滞留时间，还可以提高药物的稳定性，增强药物的治疗效果，减少药物对机体的毒副作用。

目前，制备脂质体的方法主要包括注入法、逆向蒸发法等，然而这些方法所需的实验环境和条件较为严苛，制备过程较为繁琐，在实际的大规模生产中成本较高，从而不利于实际应用。此外，现有方法在制备脂质体还存在包封率及载药量低，脂质体平均粒径较大，均匀度低，分散性较等缺陷，从而不利于药物生物利用度的提高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种五味子乙素脂质体及其制备方法，该制备方法的包封率及载药量高，制备的五味子乙素脂质体平均粒径及平均PDI小，分散性好且分布均匀，水溶性好，有利于提高药物的生物利用度。

本发明提供一种五味子乙素脂质体的制备方法，包括如下步骤：

S1：将五味子乙素与脂质类膜材溶于有机溶剂，制得油相；

S2：将冻干保护剂溶于水或水溶液中，制得水相；

S3：将油相与水相混合后乳化，制得O/W乳剂；

S4：对O/W乳剂进行冷冻干燥，制得五味子乙素脂质体。

在本发明中，对步骤S1中的脂质类膜材不作严格限制，脂质类膜材可以是磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物质通过常用方法氢化的物质；作为主要膜材可以只含一种磷脂，也可以含有多种磷脂；脂质类膜材中还可以加入其它成分，包括糖脂质、胆固醇、谷固醇类中的任意一种或多种成分。此外，含有上述组成的同时，还可以含有脂质体膜修饰材料，包括但不限于聚乙二醇（PEG）与磷脂或胆固醇的脂质连接所得到的PEG脂质衍生物，更优选为聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）衍生物。

在一实施方式中，脂质类膜材包括磷脂和胆固醇；磷脂与胆固醇的质量比（即膜材比）可以为（1-10）：1，优选为（3-8）：1，更优选为6：1。研究表明：当磷脂与胆固醇的质量比为6:1时，制得的脂质体产品的粒径更小，分布更加均匀。

此外，五味子乙素与脂质类膜材的质量比（即药脂比）可以为1：（3-20），优选为1：（4-6），更优选为1：6。研究表明：在药脂比为1：（4-6）时，包封率和载药量均较佳，特别是药脂比为1：6时的包封率和载药量最佳。

在本发明中，步骤S1中的有机溶剂可以采用与水不能互溶的有机溶剂，包括但不限于二氯甲烷、氯仿、乙醚等，优选为二氯甲烷。研究表明：以二氯甲烷作为有机溶剂制备的脂质体的粒径及均匀度远远优于以乙酸乙酯等其它有机溶剂的脂质体产品。

在本发明中，步骤S2中的冻干保护剂可以采用具有冻干保护作用的成分，包括但不限于蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、甘露糖、HAS等，优选为海藻糖。研究表明：以海藻糖作为冻干保护剂制备的脂质体产品的粒径最小、均匀度最高；同时，海藻糖具有较高的玻璃化转变温度（120℃），在低温环境下不容易形成冰晶，且海藻糖具有更好的水合性能，其分子周围具有较多的非冻水分子，制备的脂质体产品的性状等表现更好。

在本发明中，水相中冻干保护剂的质量含量可以为5-30%，优选为15-30%，更优选为15%。研究表明：冻干保护剂的质量含量低于15%时，脂质体冻干产品的复溶效果不佳，存在油相未完全乳化而发生贴壁等不良现象；冻干保护剂的质量含量在15%以上时，脂质体冻干产品的复溶效果较好。

此外，步骤S2中的水溶液可以含有等渗调节剂、酸碱调节剂、缓冲盐等成分；具体地，水溶液可以采用PBS缓冲溶液等。

在本发明步骤S3中，混合时水相与油相的质量比为（1-7）：1，优选为7：1。乳化可以采用超声乳化、高压乳匀机乳化、微射流乳化等可以达到高度分散的方式；在一实施方式中，乳化采用超声乳化，超声乳化的功率为200-800W，时间为3-30 分钟。

在本发明步骤S4中，在冷冻干燥之前先在-50℃至-80℃下预冻 1-4h；冷冻干燥时间为 24-48h。

本发明还提供一种五味子乙素脂质体，按照上述制备方法制得。

具体地，本发明的五味子乙素脂质体的平均粒径小于200nm，平均PDI小于0.2。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的制备方法解决了五味子乙素水溶性差的问题，通过上述特定的制备工艺能够将五味子乙素容易地包封于脂质体中，并且五味子乙素在脂质体中高度分散；

2、本发明的制备方法操作简单，包封率及载药量高，工艺流程易于放大，有利于大规模工业化生产；

3、本发明的五味子乙素脂质体中仅含有五味子乙素单体，化合物性质明确，有利于其实际应用；

4、本发明制备的五味子乙素脂质体平均粒径及平均PDI小，平均粒径小于200nm，平均PDI小于0.2，分散性好且分布均匀，水溶性好，有利于提高药物的生物利用度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1的五味子乙素脂质体的透射电子显微镜结果；

图2为实施例1的五味子乙素脂质体的扫描电子显微镜结果；

图3为实施例1的五味子乙素脂质体的粒径分布图；

图4为实施例1的五味子乙素脂质体的Zeta电位分布图；

图5为实施例1的不同脂质体冻干制品的DSC曲线；

图6为实施例1的不同脂质体水溶液的DSC曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将大豆磷脂51.4mg、五味子乙素10mg、胆固醇8.6mg按质量比5.14：1：0.86溶解于5mL二氯甲烷中（药脂比1：6），在常温下搅拌至均匀油相。将海藻糖溶于PBS缓冲溶液中，制得质量含量为15%的海藻糖溶液作为水相。将油相与水相按质量比1：7混合后，于300W超声25min，使得混合体系成为均匀乳液。将乳液在-50℃下快速冷冻1h，再置于冷冻干燥机中冻干48h，制得五味子乙素脂质体冻干制品，常温保存。

同时，以不加五味子乙素作为空白对照，以添加五味子乙素6mg作为少药对照组（药脂比1：10），以添加五味子乙素15mg作为多药对照组（药脂比1：4），制得空白脂质体冻干制品、少药脂质体冻干制品和多药脂质体冻干制品。

使用时，取一瓶五味子乙素脂质体冻干制品，加水至1mL，手动振摇分散复溶，即制得五味子乙素脂质体水溶液。

实施例2

将二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）50mg、胆固醇5mg、五味子乙素5mg按质量比10：1：1溶解于5mL二氯甲烷中，制得为油相。将海藻糖按15wt%的质量浓度溶于PBS缓冲溶液中，制得水相。将上述油相与水相按质量比1：3混合后，于600W超声20min，分装于3mL西林瓶中，每瓶1mL，-80℃下快速预冻 2h，再真空冷冻干燥24 h，制得五味子乙素脂质体冻干制品，常温保存。使用时，取一瓶五味子乙素脂质体冻干制品，加水至1mL，手动振摇分散，即制得五味子乙素脂质体水溶液。

实施例3

将大豆磷脂60mg、胆固醇10mg按质量比6：1溶解于5mL二氯甲烷中，在常温下搅拌至均匀油相。将海藻糖溶于PBS缓冲溶液中，制得质量含量为8%的海藻糖溶液作为水相。将油相与水相按质量比1：7混合后，于300W超声25min，使得混合体系成为均匀乳液。将乳液在-50℃下快速冷冻1h，再置于冷冻干燥机中冻干48h，制得脂质体冻干制品。

对照例1

将大豆磷脂51.4mg、五味子乙素6mg、胆固醇8.6mg按质量比5.14：0.6：0.86溶解于5mL二氯甲烷中（药脂比1：10），在常温下搅拌至均匀油相。将海藻糖溶于PBS缓冲溶液中，制得质量含量为15%的海藻糖溶液作为水相。将油相与水相按质量比1：7混合后，于300W超声25min，使得混合体系成为均匀乳液。将乳液在-50℃下快速冷冻1h，再置于冷冻干燥机中冻干48h，制得五味子乙素脂质体冻干制品。

对照例2

除采用乙酸乙酯替换实施例4的二氯甲烷之外，其余与实施例4相同。

试验例1

对实施例1的五味子乙素脂质体冻干制品进行如下质量检测：

1、包封率和载药量检测

取1mL五味子乙素脂质体水溶液加入至离心管中，于超速冷冻离心机中以10000r·min^-1转速离心25min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后用进样器吸取25μL进样至高效液相色谱中检测游离药物峰的面积；高效液相色谱条件为：岛津C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相：甲醇-水（90：10），流速：0.8mL·min^-1，检测波长254nm，进样量25μL。

按照如下公式计算包封率和载药量：

包封率%=（五味子乙素总质量-游离五味子乙素质量）/五味子乙素总质量×100%；

载药量W%=（五味子乙素总质量-游离五味子乙素质量）/五味子乙素脂质体质量×100%。

利用高效液相色谱连续3次进样进行试验，测得包封率及载药量的结果如表1、表2所示。

表1 包封率重复试验

表2 载药量重复试验

2、外观形态检测

采用透射电子显微镜和扫描电子显微镜对五味子乙素脂质体进行观察，其中样品处理过程如下：

透射电镜样品制备：

1）制片：取少量五味子乙素脂质体水溶液滴于火棉胶作为支持膜的铜网上，放置在红外灯下烘干；

2）观察：用透射电子显微镜在200kV电压下观察并记录结果。

扫描电子显微镜样品处理：

1）样品固定：将适量五味子乙素脂质体冻干制品置于扫描电子显微镜试样盘上，用导电胶固定；

2）导电处理：真空状态下用Pt蒸汽处理使样品导电；

3）观察：用扫描电子显微镜在30kV的加速电压下观察并记录结果。

结果见图1、图2。

由图1可见，在透射电子显微镜镜头下，五味子乙素脂质体呈类圆球状形态，视野中既有大单室脂质体，也有小单室脂质体，且均具有脂质体应具备的指中空状特征性结构，在脂质体内可以看到深色的药物被包裹在脂质体内，说明上述方法制备的五味子乙素脂质体具有良好的脂质体结构、形貌和纳米级粒径。

由图2可见，五味子乙素脂质体冻干制品形成了疏松的孔洞结构，但并没有形成脂质体的典型圆球状结构；结合透射电镜结果可以看到，脂质体的典型结构是在将冻干制品复水后才形成的。

3、粒径检测

将1mL五味子乙素脂质体水溶液置于粒径样品池中，放入马尔文激光粒度仪内，打开相应的测量软件测量其粒径分布及分布均匀度（PDI）；用针筒注射器将五味子乙素脂质体水溶液缓慢注入Zeta电位样品池中，将其放入马尔文激光粒度仪中，打开软件测量其Zeta电位。在软件中，将待测样品在25℃下重复测量3次并取平均值，记录下五味子乙素脂质体水溶液的粒径分布图和Zeta电位分布图。

结果见图3、图4及表3。

表3 粒径分析及Zeta电位值

由图3、图4可见，五味子乙素脂质体的粒径分布呈正态分布，峰值在100-200nm之间，分布范围窄；同时，五味子乙素脂质体的Zeta电位值的绝对值较小，分布较为均匀。

由表3可见，五味子乙素脂质体的平均粒径为129.0nm，小于200nm，达到了注射剂的要求，该脂质体能够透过血管壁进入组织间隙，进而提高药物在病灶部位的富集程度；同时，五味子乙素脂质体的平均PDI为0.170，小于0.2，说明该脂质体的分散性好且粒子在体系中分布均匀。

4、差示扫描量热法检测

将大豆磷脂、海藻糖、胆固醇、空白脂质体冻干制品及五味子乙素脂质体冻干制品分别置于坩埚中，在试验气体氮气、氧气流速均为50mL·min^-1的条件下，以10℃·min^-1的速度加热，设定温度范围为-80.19℃至200℃，并测定各个固体样品的DSC曲线。之后，分别取空白脂质体冻干制品、少药脂质体冻干制品和多药脂质体冻干制品在相同条件下复溶形成的脂质体水溶液，在同样的试验条件、加热速度、温度范围下，测定三份脂质体水溶液样品的DSC曲线，结果见图5、图6。

由图5可知，在空白脂质体的DSC曲线中，海藻糖、胆固醇、大豆磷脂的相转变峰消失，说明脂质体各成分在冻干过程中发生了相互作用，结合扫描电子显微镜结果来看，冻干过程中形成了含有孔洞的疏松均匀体系。

由图6可知，与空白脂质体相比，不论是少药脂质体还是多药脂质体都没有再出现五味子乙素的相转变峰，说明五味子乙素复溶后被包裹在了脂质体的磷脂层中，即形成了脂质体结构。

试验例2

采用试验例1方法对实施例和对照例的脂质体进行检测，结果见表4、表5。

表4 不同脂质体的包封率和载药量

表5 不同脂质体的粒径和PDI

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种五味子乙素脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将五味子乙素与脂质类膜材溶于有机溶剂，制得油相；

S2：将冻干保护剂溶于水或水溶液中，制得水相；

S3：将油相与水相混合后乳化，制得O/W乳剂；

S4：对O/W乳剂进行冷冻干燥，制得五味子乙素脂质体；

脂质类膜材包括磷脂和胆固醇，磷脂为大豆磷脂，磷脂与胆固醇的质量比为6：1，五味子乙素与脂质类膜材的质量比为1：6；有机溶剂为二氯甲烷；冻干保护剂为海藻糖，水相中冻干保护剂的质量含量为15％；混合时水相与油相的质量比为7：1；五味子乙素脂质体的平均粒径小于200nm，平均PDI小于0.2。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，水溶液为PBS缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，乳化采用超声乳化、高压乳匀机乳化或微射流乳化。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，超声乳化的功率为200-800W，时间为3-30分钟。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在冷冻干燥之前先在-50℃至-80℃下预冻1-4h；冷冻干燥时间为24-48h。

6.一种五味子乙素脂质体，其特征在于，按照权利要求1-5任一所述的制备方法制得。