CN101953792A - 伊立替康纳米长循环脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了伊立替康的一种新型载体——长循环纳米脂质体，及其制备新方法——乙醇注入联合硫酸铵主动载药法。制备过程如下：a、将用于形成脂质体的脂质物质溶于乙醇中形成溶液；b、将聚乙二醇类化合物溶解于硫酸铵溶液中作为水化介质；c、将a所得溶液在水浴搅拌下注入b所得水化介质中，通N₂条件下保温搅拌一定时间，形成长循环空白脂质体；d、将c所得空白脂质体在生理盐水中透析；e、将伊立替康溶液加入空白脂质体中，调节外相pH值，在一定温度下孵育载药即得伊立替康长循环纳米脂质体。该工艺过程简单，粒径80-150nm，包封率达95%以上，且易得无菌制剂，可满足产业化的要求。

Description

伊立替康纳米长循环脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备伊立替康长循环纳米脂质体的新方法。

背景技术

伊立替康(羟基喜树碱-11，CPT-11)系我国天然特有的珙桐科植物喜树中提取分离的左旋微量生物碱，为半合成的可溶性喜树碱衍生物，是DNA拓扑异构酶I（Topo-1）抑制剂^[1]，伊立替康与其代谢物SN-38通过与DNA-Topo-1复合体的稳定结合引起DNA单链的断裂，使DNA产生不可逆的损伤而死亡。研究表明，多种肿瘤细胞，特别是结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等细胞内的Topo-1含量大大高于正常组织，由于伊立替康独特的作用机制，对上述肿瘤细胞有着较高的选择性，从而发挥其特异性抗肿瘤的活性，并降低其对正常细胞的毒性。作为一种新型的抗肿瘤药物，自从上世纪90年代被发现以来，在世界范围内已引起了临床的广泛关注，被誉为90年代抗癌药物的三大发现之一^[2]。      

目前国内上市的伊立替康产品仅为其盐酸盐的注射剂，该药在剂量较大时可引起严重的腹泻和骨髓抑制^[3]，这两种不良反应被认为是与剂型相关的毒性。因此该药在临床上更广泛地使用存在一定的局限性。

脂质体是一种微粒分散体系，粒径在100-1000nm之间，物理、化学稳定性都较差。由于肿瘤的血管间隙可以达到100-780nm，正常血管内皮细胞之间的间隙通常在2nm左右。静脉注射给药后，大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除。小粒径的脂质体在血液循环过程无法进入正常组织，但可有效的穿透肿瘤区的血管，因此纳米脂质体(<200nm)可以被动的聚集在肿瘤区，更好的发挥治疗作用，是人们设计的较理想的脂质体药物载体。纳米颗粒作为药物载体的研究已有20年历史，它是一种应用领域广泛、性能突出的新型药物载体，是国际药剂学界研究的热点领域之一。大量的研究表明它在靶向给药领域有巨大的潜在应用价值。由于纳米颗粒具有可改变药物体内分布、药物释放速度、生物利用度、药物对生物膜的透过性及药物在局部的滞留性等优点^[4]，使其可以载带多种药物，用于器官靶向、胞内靶向、骨髓靶向等药物传递系统中，或用于注射剂、口服制剂、眼用制剂、透皮制剂中。

Messerer^[5]等以二硬脂酰磷脂酰胆碱和胆固醇为膜材，采用MnSO₄梯度装载法制备了伊立替康脂质体。发现脂质体可以有效保护药物的活性内酯结构，使伊立替康活性内酯形式在血浆中的清除明显降低。   

PharmaEngine公司对伊立替康的剂型进行改良，开发出了新的脂质体剂型，通过脂质体膜对药物的包封和缓释作用，不仅可以增加药物在受试者体内的靶向性和延长作用时问。更降低了药物毒性，增加了用药安全性。美国FDA 于2008年l2月 3日同意PharmaEngine公司在代谢性胰腺癌受试者体内进行伊立替康脂质体注射液的II期临床试验。美国肿瘤学会2008年度会议的报告表明，在台湾进行的I期临床试验中。该药对晚期顽固性肿瘤受试者呈现出良好的药代动力学、有效性和耐受性。

但是，目前脂质体应用程度受限的主要因素之一就是稳定性问题。虽然脂质体制备方法有多种，但尚未制备出在体内外均稳定的脂质体。脂质体进入体内后，由于血中的白蛋白、调理素、抗体等各种因素作用，脂质体发生破裂，包封药物快速渗漏，很快被网状内皮系统识别、吸收，限制了它的“导弹”功能。为此，人们从各种途径想办法解决脂质体的体内外稳定性，制备稳定的长循环在脂质体。通过高分子物质来改变脂质体表面亲水性亚结构，形成表面有高分子材料包裹的脂质体，，尤其是用聚乙二醇(PEG)修饰的长循环脂质体(long—circulationliposomes，LCL)，表面暴露的亲水性基团所产生的空间位阻可以增加脂质体在血液中的稳定性，不但提高了对靶向组织的选择性，而且能够逃避网状内皮系统的捕获，以获得更充足的时间到达靶向部位，被称为“隐形脂质体”(stealth liposomes, S-liposomes)，又称立体稳定脂质体或空间稳定脂质体(sterically stabilized liposomes)。由于聚乙二醇价廉易得、可以大规模生产、分子量易于控制、物理化学性质良好，可以事先将其制备成聚乙二醇－磷脂衍生物，同时制剂工艺相对简单，已成为目前高分子修饰脂质体的研究重点。

 Sadzuka^[6]等制备了PEG修饰的脂质体，小鼠体内研究发现，PEG修饰的脂体可提高药物在肿瘤的聚集，使伊立替康向活性代谢产物SN-38的转变提高而增加治疗效果。此外，由于胆汁中药物浓度的下降，伊立替康的胃肠道的不良反应减少。 

因此，将纳米长循环脂质体作为药物载体，结合伊立替康研制一种伊立替康的长循环纳米脂质体，对肿瘤的治疗具有重要意义。

制备脂质体的方法有很多，分为被动载药法和主动载药法两种，其中被动载药法在制备含药脂质体时，根据药物性质首先将药物溶于水相或有机相中，然后按适宜的方法制备含药脂质体，该法适于脂溶性强的药物，所得脂质体具有较高包封率，而对于水溶性药物通常包封率不理想。

被动载药法大致可以分为四类：

第一类是以薄膜分散法为基础的。将磷脂溶解在有机溶剂中减压蒸发，得到干燥的磷脂膜。水化磷脂膜则可以得到多层脂质体。但是此时得到的多层脂质体由于“溶剂挤出”效应，层与层之间溶质分布不均匀，需要反复冻融处理。为了减小脂质体的粒度，超声或微射流等手段通常是必需的。这类方法是制备脂质体最基本的方法，尤其适用于实验室的小规模制备。但是迄今为止也没有应用于工业化大生产。追究其原因主要在于:(1)需要特殊的设备，如挤出仪、微射流及交叉流注射等，这些设备有的还无法买到，无法放大生产；(2)很难得到无菌(无热原)的脂质体产品；(3)由于氯仿、甲醇等有毒溶媒的使用，限制了其应用于工业生产。

第二类方法要求形成W/0的乳剂或W/O/W的复乳。这类方法主要包括反相

蒸发法和二次乳化法。其中二次乳化法己经成功的应用于工业化生产。但是应用此类方法，在生产过程中仍然需要使用有毒溶媒氯仿。

第三类方法是去污剂透析法。采用该方法制备脂质体必须先形成胶束。这类方法最主要的应用就是包封膜蛋白。通过此类方法可以将病毒或其它病原体的膜蛋白重建在脂质体双层膜上，制成脂质体疫苗或者是膜融合脂质体。通常这种方法不适合小分子药物或极性较强的生物大分子。

第四类方法基本上都和注入技术尤其是乙醇注入法有关系。根据药物的性质，将类脂质（和脂溶性药物）溶于有机溶剂中（油相），然后把油相均速注射到水相（含水溶性药物）中，搅拌挥尽有机溶剂，再乳匀或超声得到脂质体。根据溶剂的不同可分为乙醇注入法和乙醚注入法。目前这类方法在工业上应用最广，设备简单，无需“整粒”即可得到亚微米、单分散的单室脂质体;工艺简单，易于放大；且容易得到无菌制剂。

主动载药法，是利用两亲性的药物能以电中性的形式跨越脂质双层，但其电离形式却不能跨越的原理来实现的。通过形成脂质体膜内、外水相的pH梯度差异，使脂质体外水相的药物自发地向脂质体内部聚集。此法通常用脂质体包封酸性缓冲盐，然后用碱把外水相调成中性，建立脂质体内外的pH 梯度。药物在外水相的pH环境下以亲脂性的中性形式存在，能够透过脂质体双层膜。而在脂质体内水相中药物被质子化转为离子形式，不能再通过脂质体双层回到外水相，因而被包封在脂质体中。主动载药法广义上就是指pH 梯度法。人们把其细分为：（1）pH梯度法；（2）硫酸铵梯度法；（3）醋酸钙梯度法。其中硫酸铵梯度法和醋酸钙梯度法只是pH梯度法的两种特殊形式。

因盐酸伊立替康化合物以盐酸盐的形式存在，在水溶液中以两种形式呈动态平衡：一种是内酯形式；另一种是羧基形式。在酸性环境下，偏向内酯形式。而在生理条件下(37 ℃，pH 7.4)会转变为羧酸盐形式，但其内酯环却是抗肿瘤活性的必须结构^[7]。故采取硫酸铵梯度法这种主动载药法，依靠内外水相硫酸铵梯度产生的较高驱动力来进行载药，既解决了采用传统的被动载药法包封率低的问题，同时用硫酸铵梯度法将药物载入具有酸性环境的内水相中，可以保持其内酯形式不发生转变，从而更好地保持其抗癌活性。韩婷^[8]，张俭俭^[9]，张自强^[10]等采用薄膜分散、逆向蒸发、乙醇注入与薄膜分散-硫酸铵梯度法制备伊立替康脂质体，并比较各种方法制得的脂质体粒径与包封率，发现硫酸铵梯度法制得的包封率明显优于其他方法，可达到90%以上。

因盐酸伊立替康为一种酸式盐，水溶性较好，实验室采用被动载药方法如薄膜分散，逆向蒸发，乙醇注入制备脂质体粒径分布不均，包封率不高，不稳定；为得到小粒径的脂质体往往需要采用超声、研磨或者挤出的方法，这往往造成工艺复杂，其过程中产生的热量也会造成磷脂的氧化和分解，且制备无菌制剂困难；薄膜分散联合硫酸铵梯度法的制备方法目前也仅限于实验室操作，不易于生产放大。

综上所述，只有真正解决了上述问题，才能获得有效的伊立替康长循环脂质体。

发明内容

针对现有技术制备脂质体粒径分布不均，包封率不高，不稳定的缺陷，本发明提供一种乙醇注入法和硫酸铵梯度主动载药法相结合制备伊立替康长循环纳米脂质体药物的新方法。 

本发明中一种伊立替康长循环纳米脂质体，其特征在于，该脂质体成分包括伊立替康、磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188和聚乙二醇类化合物；组成比例为磷脂：胆固醇：泊洛沙姆188：聚乙二醇类化合物：伊立替康=100:(20-50):(10-40):(8-15):(5-20)；活性成分为盐酸伊立替康；泊洛沙姆188为增溶剂和分散剂；聚乙二醇类化合物为PEG-DSPE或PEG2000。

制备本发明中一种伊立替康长循环纳米脂质体的具体实施方案包括以下步骤：

a、 采用乙醇注入法制备长循环空白脂质体：将浓度为75-150mg/ml的磷脂、胆固醇和泊洛沙姆188按照一定质量比溶于乙醇中形成溶液A，其中磷脂与胆固醇质量比为5:1-2:1，磷脂与泊洛沙姆188质量比为10:1-5:2；在水浴搅拌下将溶液A注入溶解了聚乙二醇类化合物的浓度为0.15-0.25mol/L的硫酸铵溶液水化介质中，其中磷脂与聚乙二醇类化合物质量比为20:1-5:1，乙醇溶液与水化介质的体积比为1:5-1:2；一定温度通N₂条件下保温搅拌一定时间，形成空白脂质体；

b、 将a所得空白脂质体在生理盐水中透析8-12 h；

c、 将伊立替康药物浓度按磷脂/伊立替康质量比为20:1-10:1配制成伊立替康溶液加入空白脂质体中，调节外相pH 7.0-7.5，在一定温度下孵育8-12 min载药即得伊立替康长循环纳米脂质体。

本发明中，在步骤a形成的水化介质中加入蔗糖或甘露醇等冻干保护剂，将所得的伊立替康长循环纳米脂质体在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机上干燥，用于制备其冻干粉针剂；磷脂与保护剂的质量比为1/10-1/5；采用微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。

具体操作要求： 

实施本发明时，步骤a中磷脂浓度为75-150 mg/ml，浓度过高形成脂质体过程中分散不好，易形成多室脂质体，形态不好，浓度过低形成的脂质体浓度也低，载药量同时也就减少，不符合生产和市场要求；乙醇溶液/水化介质的体积比应控制在1:5-2:5之间，乙醇比例过低所得脂质体分散不好，粒径分布不均，比例过高又不易于很好的除去乙醇，造成有机溶媒残留过高。

步骤a中泊洛沙姆188是一种表面活性剂，可作为增溶剂和分散剂增加脂质体的溶解度以减小粒径并使形成的脂质体粒径分布窄而均匀；同时，泊洛沙姆188和聚乙二醇类化合物均可作为附加剂制备长循环纳米脂质体；其中磷脂与泊洛沙姆188质量比控制在10:1-5:2之间，聚乙二醇类化合物可采用PEG2000-DSPE、PEG2000，磷脂与聚乙二醇类化合物质量比控制在20:1-5:1之间，所得空白脂质体粒径在80-150nm之间，电镜检查结果显示脂质体形态圆整，分布均匀。为提高脂质体抗氧化能力，可于步骤a中制备脂质的乙醇溶液中加入脂溶性抗氧化剂vitamin E。

本发明的成功实施，以获得高包封率的伊立替康长循环纳米脂质体，采用硫酸铵溶液作水化介质，透析后调节外相pH以获得主动载药的浓度梯度是必要的，硫酸铵溶液的浓度控制在0.15-0.25mol/L之间时，包封率较理想。

实施本发明时，在步骤a形成的水化介质中加入蔗糖、甘露醇等载体物质作为冻干保护剂，将所得的伊立替康长循环纳米脂质体在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机上干燥即可获得该脂质体的冻干粉针剂，载体物质的加入可使所得冻干物不易吸潮，可长期保存。同时通过调节载体物质的比例，可以控制脂质体的粒径分布均匀，避免形成多层次的多室脂质体，影响脂质体的质量。磷脂/载体物质质量比在1/10-1/5之间效果较好。

本发明具有以下优点：1、本发明由于采用长循环脂质体作为药物载体，结合伊立替康制备而成，因而能够明显提高药物的体内外稳定性，延长药物作用时间，提高靶向性。2、本发明伊立替康长循环脂质体注射给药，伊立替康在肿瘤组织的停留时间明显延长，有利于肿瘤病灶部位的吸收。3、本发明伊立替康纳米脂质体的粒径范围为80-150 nm，能有效的穿透肿瘤区的血管，被动的聚集在肿瘤区，无法进入正常组织，同时避免传统大粒径的脂质体很容易被体内的单核巨噬系统所吞噬，从而被迅速清除掉的缺点。4、本发明用乙醇注入法制备空白脂质体，较薄膜分散法更容易实现产业化，并解决了脂质体粒径分布不均的问题。5、本发明用硫酸铵梯度法主动载药，解决了水溶性药物包封率低的问题，同时其酸性内水相的环境可使伊立替康保持其内酯环活性结构，更好的发挥其抗癌效应。

根据中华人民共和国药典2005年版第二部，对本发明伊立替康长循环纳米脂质体及其制剂的质量进行检查，结果表明，伊立替康长循环纳米脂质体形态粒径分布均一，包封率达90%以上，渗漏率低，氧化指数低，稳定性良好。

本发明具体制备方法，由以下实施实例举例说明，但本发明保护范围，不局限于此。

  

附图说明

图-1是伊立替康长循环纳米脂质体粒径分布图。

图-2是伊立替康长循环纳米脂质体与盐酸伊立替康注射剂体外释放曲线。

 

具体实施方式      

实施例1：伊立替康长循环纳米脂质体的制备。

选取PEG-DSPE作为制备长循环脂质体的附加剂，将磷脂，胆固醇，泊洛沙姆188，V_E溶解于乙醇溶液中，在55℃水浴搅拌条件下注入溶解了PEG-DSPE的硫酸铵溶液中，磷脂浓度为100mg/ml，磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188、PEG-DSPE质量比为3:1:0.6:0.3，通N₂条件下保温搅拌0.5-1h，所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜，调节外相pH为7-7.5，在55℃水浴条件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂质量比1:10)孵育5-15min，即得伊立替康长循环纳米脂质体。

本实施例制备的伊立替康长循环纳米脂质体进行质量检测结果如下：

该批次制得的伊立替康长循环纳米脂质体粒径为80-150nm（图1），表面光滑圆整，且粒度均一，分布均匀。透析法测包封率，采用紫外风光光度计于370 nm处检测，测定吸光度。本实施例制备的伊立替康长循环纳米脂质体经检验测定计算，其包封率为95.3%，载药量为9.53 %。  

进行伊立替康长循环纳米脂质体体外释放测定，并与盐酸伊立替康溶液比较，计算体外累积释放度。以PBS（pH 7.0）为释放介质，分别精密吸取一定量盐酸伊立替康脂质体和注射剂溶液(含主药10mg)，加至经预处理过的透析袋（截留分子量1000）中，将袋口扎紧，固定于桨上，置于装有500mL PBS缓冲液的溶出杯中，37℃恒速100r/min，定时吸取4mL透析液，并及时补充等量恒温的PBS。分别测定3批样品，体外释放曲线见图2。结果如图可知，盐酸伊立替康溶液释放较快，1h释放32%左右，9h即释放87%，一天即释放完全；而脂质体释放较慢，2h释放23%左右，具有突释效应，12h释放55%，12h后进入释放相对平稳的缓释相，2天释放率为75%，7天后累计释放率达到90%，具有明显的缓释效应，表明制得的长循环脂质体具有缓释释放药物的特征，可以延长药物在体内的作用时间，有长效的作用。

脂质体初步稳定性考察：4℃冰箱贮存脂质体，定期取样，用测定包封率的方法测定脂质体包封量，与贮存前包封的药量比较，计算渗漏率，实施例制备的伊立替康长循环纳米脂质体经检验测定计算，其渗漏率为14.5%。

实施例2、伊立替康长循环纳米脂质体的制备

选取PEG2000作为制备长循环脂质体的附加剂，将磷脂，胆固醇，泊洛沙姆188，V_E溶解于乙醇溶液中，在55℃水浴搅拌条件下注入溶解了PEG2000的硫酸铵溶液中，磷脂浓度为100mg/ml，磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188、PEG2000质量比为10:5:2:1，通N₂条件下保温搅拌0.5-1h，所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜，调节外相pH为7.5，在55℃水浴条件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂质量比1:10)孵育5-15min，即得伊立替康长循环纳米脂质体。

本实施例所得伊立替康长循环纳米脂质粒径在80-150nm，表面光滑圆整，且粒度均一，分布均匀。包封率为92.7%，载药量为9.27%，渗漏率为15.4%。

 实施例3、伊立替康长循环纳米脂质体注射剂的制备

    将实施例1和2制备所得伊立替康长循环纳米脂质体经微孔滤膜过滤除菌后，充氮气灌装于安剖瓶中，即得伊立替康长循环纳米脂质体的注射液。

 实施例4、伊立替康长循环纳米脂质体冻干粉针剂的制备

本实施例制备脂质体时，将磷脂，胆固醇，泊洛沙姆188，V_E溶解于乙醇溶液中，在55℃水浴搅拌条件下注入补加了蔗糖(蔗糖/磷脂质量比为5:1)的溶解了PEG-DSPE的硫酸铵溶液中，磷脂浓度为100mg/ml，磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188、PEG-DSPE质量比为10:5:2:1，通N₂条件下保温搅拌0.5-1h，所得长循环空白脂质体在生理盐水中透析过夜，调节外相pH为7.5，在55℃水浴条件下加入伊立替康溶液(伊立替康/磷脂质量比1:15)孵育5-15min，将所得伊立替康长循环脂质体溶液经微孔滤膜过滤除菌后，置于安剖瓶中，预冻48h后经冷冻干燥，充氮气封口后即得伊立替康长循环纳米脂质体的冻干粉针剂。

 

参考文献

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[8]韩婷.盐酸伊立替康脂质体的制备[J].中国医药指南,2008,6(17):36-38.

[9]张俭俭,张佳佳,杨建坤.盐酸伊立替康脂质体的制备及体外释药特性研究[J].中国药房,2008,19(10):762-764.

[10]张自强，朱家璧，姚静等.pH梯度法制备伊立替康脂质体[J].中国药科大学学报，2008,39(4):312-316.

Claims (5)

1.一种伊立替康长循环纳米脂质体，其特征在于，该脂质体成分包括伊立替康、磷脂、胆固醇、泊洛沙姆188和聚乙二醇类化合物；组成比例为磷脂:胆固醇:泊洛沙姆188:聚乙二醇类化合物:伊立替康=100:(20-50):(10-40):(8-15):(5-20)；活性成分为盐酸伊立替康；泊洛沙姆188为增溶剂和分散剂；聚乙二醇类化合物为PEG-DSPE或PEG2000。

2.根据权利要求1所述的一种伊立替康的长循环纳米脂质体，其特征在于：所述伊立替康长循环纳米脂质体的粒径在80-150nm之间，包封率达90%以上，载药量在8%-15%。

3.一种制备权利要求1所述伊立替康长循环纳米脂质体的方法，其特征在于，采用乙醇注入联合硫酸铵主动载药法制备，制备过程包括以下步骤：

采用乙醇注入法制备长循环空白脂质体：将浓度为75-150mg/ml的磷     脂、胆固醇和泊洛沙姆188按照一定质量比溶于乙醇中形成溶液A，其中磷脂与胆固醇质量比为5:1-2:1，磷脂与泊洛沙姆188质量比为10:1-5:2；在水浴搅拌下将溶液A注入溶解了聚乙二醇类化合物的浓度为0.15-0.25mol/L的硫酸铵溶液水化介质中，其中磷脂与聚乙二醇类化合物质量比为20:1-5:1，乙醇溶液与水化介质的体积比为1:5-1:2；一定温度通N2条件下保温搅拌0.5-1h，形成空白脂质体；

b、 将a所得空白脂质体在生理盐水中透析8-12h；

c、 将伊立替康药物浓度按磷脂/伊立替康质量比为20：1-10:1配制成伊立替康溶液加入空白脂质体中，调节外相pH7.0-7.5，在一定温度下孵育8-12min进行载药即得伊立替康长循环纳米脂质体。

4.根据权利要求书4所述的一种伊立替康长循环纳米脂质体的制备方法，其特征在于：在步骤a形成的水化介质中加入蔗糖或甘露醇等冻干保护剂，将所得的伊立替康长循环纳米脂质体在液氮或低温装置冻结，然后在冻干机上干燥，用于制备其冻干粉针剂；磷脂与保护剂的质量比为1/10-1/5。

5.根据权利要求书4所述的一种伊立替康长循环纳米脂质体的制备方法，其特征在于：采用微孔滤膜过滤除菌得到无菌制剂。

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