CN110072531A - 用于治疗心血管相关疾病的爱帕琳的新型聚乙二醇化的脂质体制剂 - Google Patents

Abstract

本公开内容一般地涉及组合物，其包括用于治疗心血管相关疾病的爱帕琳的聚乙二醇化的脂质体制剂。

Description

用于治疗心血管相关疾病的爱帕琳的新型聚乙二醇化的脂质 体制剂

优先权声明

本申请要求2016年10月19日提交的美国临时申请62/410,160和2017年2月28日提交的美国临时申请62/464,594的优先权，其通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开内容提供了爱帕琳(apelin)的组合物，例如，爱帕琳的聚乙二醇化的脂质体制剂，和用于治疗心血管相关疾病和病症的方法。

背景技术

爱帕琳是G-蛋白质-偶联APJ受体的内源配体，其调节各种生物功能，包括体液稳态、血压、心脏发育和功能，以及多血管重塑。爱帕琳肽的治疗性用途已经受到由于体内生物活性肽的快速代谢的其显著短的血浆半衰期的限制。

因此，仍需要具有增强的稳定性和治疗效力的爱帕琳制剂。

发明内容

在一些方面中，本文提供了一种组合物，其包括有效量的至少部分封装在脂质体中的治疗剂，该脂质体包括一定量的至少一种泊洛沙姆、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和聚乙二醇(PEG)。

在一些方面中，本文提供了在需要其的受试者中治疗或预防心血管相关疾病的方法，该方法包括施用治疗有效量的根据本公开内容的实施方式的组合物。

在一些方面中，本文提供了制备根据本公开内容的实施方式的组合物的方法，该方法包括将DSPC和DPPC溶于乙醇中并且超声处理直到溶解以形成第一组合物；将PEG和泊洛沙姆溶于甲醇中并且超声处理直到溶解以形成第二组合物；由第一组合物和第二组合物形成脂质膜；和将治疗剂与脂质膜混合以形成脂质体。

在一些方面中，本文提供了一种试剂盒，其包括根据本公开内容的实施方式的组合物和用于治疗或预防心血管相关疾病或病症的说明书。

在一些实施方式中，治疗剂是爱帕琳肽。

在一些实施方式中，至少一种泊洛沙姆是泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆331和泊洛沙姆407、或其任何组合。

在一些实施方式中，PEG的平均分子量为约200至约20000道尔顿(PEG200至PEG20000)，例如，PEG 8000。

在一些实施方式中，爱帕琳肽占约15wt％和约60wt％之间。在一些实施方式中，泊洛沙姆占约1wt％和约20wt％之间。在一些实施方式中，DSPC占约5wt％和约30wt％之间。在一些实施方式中，DPPC占约5wt％和约30wt％之间。在一些实施方式中，PEG占约10wt％和约20wt％之间。

在一些实施方式中，该组合物进一步包括胆固醇。在一些实施方式中，胆固醇占约1wt％和约10wt％之间。

在一些实施方式中，该组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，该组合物进一步包括至少一种另外的治疗剂，例如，血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、松弛素、利尿钠肽、生长素释放肽或其他生物活性肽。

在一些实施方式中，该组合物包括约25wt％的爱帕琳肽、约17wt％的泊洛沙姆188、约25wt％的DSPC、约25wt％的DPPC和约8wt％的PEG 8000。在其他实施方式中，该组合物包括约45wt％的爱帕琳肽、约15wt％的泊洛沙姆188、约10wt％的DSPC、约10wt％的DPPC、约15wt％的PEG 8000和约5wt％的胆固醇。

在一些实施方式中，心血管相关疾病是肺动脉高压、心力衰竭、心肌梗死、糖尿病性肾病、慢性肾病、急性肾病、勃起功能障碍、糖尿病或代谢相关的病症。

在一些实施方式中，通过静脉内、皮下、口服或经吸入施用该组合物。

在一些实施方式中，脂质体是冷冻干燥的。

附图说明

参考下述附图可更好地理解本公开内容的许多方面。

图1A和1B显示了假手术(sham)(PBS)、对照(无爱帕琳)、制剂B(仅爱帕琳)或制剂C(爱帕琳脂质体)的手术之前和手术之后1天、7天和14天的射血分数(EF)的改变，其中每周一次施用(两周；在第1天和第7天)。

图2A和2B显示了假手术(PBS)、对照(无爱帕琳)、制剂B(仅爱帕琳)或制剂C(爱帕琳脂质体)的手术之前和手术之后1天、7天和14天的左心室收缩分数(FS)的改变，每周一次施用(两周；在第1天和第7天)。

图3A和3B显示了假手术(PBS)、对照(无爱帕琳)、制剂B(仅爱帕琳)或制剂C(爱帕琳脂质体)的手术之前和手术之后1天、7天和14天的左心室收缩直径(LVID)的改变，每周一次施用(两周；在第1天和第7天)。

图4A和4B显示了假手术(PBS)、对照(无爱帕琳)、制剂B(仅爱帕琳)或制剂C(爱帕琳脂质体)的手术之前和手术之后1天、7天和14天的左心室舒张直径(LVIDd)的改变，每周一次施用(两周；在第1天和第7天)。

图5A和5B显示了假手术(PBS)、对照(无爱帕琳)、制剂B(仅爱帕琳)或制剂C(爱帕琳脂质体)的手术之前和手术之后1天、7天和14天的舒张左心室后壁厚度(LVPWd)的改变，每周一次施用(2周；在第1天和第7天)。

图6A显示了心脏超声检查第1天的变化(第1天/基线(％))。

图6B显示了心脏超声检查第7天的变化(第7天/基线(％))。

图6C显示了心脏超声检查第14天的变化(第14天/基线(％))。

图7A-7D显示了代表性H&E染色图，该染色图显示心脏结构完整性。

图8A-8D显示了代表性MASSON染色图，该染色图显示心脏结构完整性。

图9A-9D显示了代表性生物活性肽。

具体实施方式

本公开内容涉及用于治疗心血管相关疾病的方法和用于这些方法的组合物。

所有数值赋值，例如，pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，是在合适的情况下改变(+)或(-)增量为0.1或1.0的近似值。应理解，尽管未必明确指出，但是所有的数值赋值前面有术语“约”。也应理解，尽管未必明确指出，但是本文所述的试剂仅是示例性的并且这种的等同物是本领域已知的。

必须注意，如本文和所附的权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“脂质体”包括多个脂质体。

如本文使用的，下述术语具有下述含义。

当术语“约”在数值赋值，例如，温度、时间、数量、浓度等，包括范围之前使用时，指示可改变(+)或(-)20％、10％、5％或1％的近似值。

也如本文所使用，“和/或”指和包括一个或多个相关列举项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选方式(“或”)解释时，缺少组合。

术语“施用(administering)”、“施用(administer)”等指将试剂(例如，爱帕琳)引入受试者中。典型地，施用由治疗医生等确定的有效量。可使用任何施用的途径，比如局部、皮下、腹膜、静脉内、动脉内、吸入、阴道、直肠、含服、引入至脑脊髓液中，或滴注至身体区室。术语和短语“施用(administering)”和“施用(administration of)”，当与组合物(和语法等效形式)连接使用时，都指直接施用，其可通过医学专业人员或通过患者的自身施用而施用至患者，和/或指间接施用，其可为对药物开处方的动作。例如，指导患者自身施用试剂(例如，爱帕琳)和/或为患者提供药物处方的医生将试剂施用至患者。“定期施用”或“定期地施用”指以每天一次、每周一次或每月一次进行的多次治疗。定期施用也可指每天施用试剂一次、两次、三次或更多次。

“有效量”是足够实现有益的或期望的结果的试剂或化合物(例如，爱帕琳)的量。有效量可为一次或多次施用、施加或给药。这些参数的确定是本领域技术人员熟知的。这些考虑，以及有效的制剂和施用程序是本领域熟知的并且描述在标准教科书中。

“受试者”、“个体”或“患者”在本文中替换使用并且指脊椎动物，例如灵长类、哺乳动物或优选人。哺乳动物包括，但不限于马、犬科动物、牛科动物、羊、鼠、大鼠、猿、人、农场动物、竞技动物和宠物。

就蛋白质或氨基酸序列(或DNA或RNA序列)而言，术语“序列同一性”指在比对序列和如果必要引入空隙，以实现最大百分数序列同一性，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分之后，在候选序列中，与指定蛋白质或氨基酸序列(或指定DNA或RNA序列中的核苷酸残基)的氨基酸残基相同的氨基酸残基(或核苷酸残基)的百分数。可通过本领域技术人员已知的任何方法实现比对，例如，通过使用公众可用的程序，比如BLAST和EMBOSS。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适的参数，包括需要的任何算法，以实现待比较的全长序列内的最大比对。

本文使用的短语“药学上可接受的”，指下述那些化合物，材料，组合物，和/或剂型：其在合理的医学判断范围内，适合用于接触人类和动物组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相当。

组合物和制剂

本文提供了包括至少一种至少部分封装在脂质体中的治疗剂的组合物和制剂。

在一些实施方式中，治疗剂是爱帕琳肽。在一些实施方式中，爱帕琳肽包括选自下列的氨基酸序列：如下面表1中阐释的SEQ ID NOS：1-7，或与其具有至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％序列同一性的序列。合适的爱帕琳肽亚型的非限制性实例包括爱帕琳-12、爱帕琳-13、焦谷氨酰爱帕琳-13([Pyr1]-爱帕琳-13])、爱帕琳17、爱帕琳-19和爱帕琳36。在一些实施方式中，爱帕琳肽为焦谷氨酰爱帕琳-13。在美国专利公开号2016/0058705中描述了合适的爱帕琳肽和生物活性突变体，其通过引用以其整体并入。

表1：爱帕琳肽序列

在一些实施方式中，治疗剂(例如，爱帕琳肽)和/或至少一种另外的治疗剂占约15wt％和约60wt％之间。

在一些实施方式中，治疗剂占约5wt％和约30wt％之间、约10wt％和约25wt％之间、或约15wt％和约20％之间。在一些实施方式中，治疗剂占约5wt％、约10wt％、约15wt％、约20wt％、约21wt％、约22wt％、约23wt％、约24wt％、约25wt％、约26wt％、约27wt％、约28wt％、约29wt％或约30wt％。在一些实施方式中，治疗剂占小于约30wt％、小于约29wt％、小于约28wt％、小于约27wt％、小于约26wt％、小于约25wt％、小于约24wt％、小于约23wt％、小于约22wt％、小于约21wt％、小于约20wt％、小于约19wt％、小于约18wt％、小于约17wt％、小于约16wt％、小于约15wt％、小于约14wt％、小于约13wt％、小于约12wt％、小于约11wt％、小于约10wt％、小于约9wt％、小于约8wt％、小于约7wt％、小于约6wt％、小于约5wt％、小于约4wt％、小于约3wt％、小于约2wt％或小于约1wt％。

在一些实施方式中，治疗剂占约35wt％和约60wt％之间、约35wt％和约55wt％之间、约35wt％和约50％之间、约35wt％和约45％之间、或约35wt％和约40％之间。在一些实施方式中，治疗剂占约40wt％和约60wt％之间、约40wt％和约55wt％之间、约40wt％和约50％之间、或约40wt％和约45％之间。在一些实施方式中，治疗剂占约35wt％、约36wt％、约37wt％、约38wt％、约39wt％、约40wt％、约41wt％、约42wt％、约43wt％、约44wt％、约45wt％、约46wt％、约47wt％、约48wt％、约49％、约50wt％、约51wt％、约52wt％、约53wt％、约54wt％、约55wt％、约56wt％、约57wt％、约58wt％、约59％或约60wt％。在一些实施方式中、治疗剂占大于约35wt％、大于约36wt％、大于约37wt％、大于约38wt％、大于约39wt％、大于约40wt％、大于约41wt％、大于约42wt％、大于约43wt％、大于约44wt％、大于约45wt％、大于约46wt％、大于约47wt％、大于约48wt％、大于约49wt％、大于约50wt％、大于约51wt％、大于约52wt％、大于约53wt％、大于约54wt％、大于约55wt％、大于约56wt％、大于约57wt％、大于约58wt％、大于约59wt％或大于约60wt％。

在一些实施方式中，治疗剂至少部分封装在包括一定量的至少一种泊洛沙姆、至少一种脂质和聚乙二醇(PEG)的脂质体中。

合适的泊洛沙姆的非限制性实例包括泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆331和泊洛沙姆407，或其任何组合。在一些实施方式中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。

在一些实施方式中，泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)占约1wt％和约20wt％。

在一些实施方式中，泊洛沙姆占约1wt％和约14wt％、约2wt％和约12wt％之间、约4wt％和约10％之间、或约6wt％和约8％之间。在一些实施方式中，泊洛沙姆占约1wt％、约2wt％、约3wt％、约4wt％、约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％、约10wt％、约11wt％、约12wt％、约13wt％或约14wt％。在一些实施方式中，泊洛沙姆占小于约14wt％、小于约13wt％、小于约12wt％、小于约11wt％、小于约10wt％、小于约9wt％、小于约8wt％、小于约7wt％、小于约6wt％、小于约5wt％、小于约4wt％、小于约3wt％、小于约2wt％或小于约1wt％。

在一些实施方式中、泊洛沙姆占约12wt％和约20wt％之间、约12wt％和约18wt％之间、约12wt％和约16％之间、或约12wt％和约14％之间。在一些实施方式中、泊洛沙姆占约12wt％、约13wt％、约14wt％、约15wt％、约16wt％、约17wt％、约18wt％、约19wt％、或约20wt％。在一些实施方式中、泊洛沙姆占大于约12wt％、大于约13wt％、大于约14wt％、大于约15wt％、大于约16wt％、大于约17wt％、大于约18wt％、大于约19wt％、或大于约20wt％。

在一些实施方式中，至少一种脂质(例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPSC)和/或1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC))占约5wt％和约30wt％之间。合适的脂质的非限制性实例包括大豆磷脂酰胆碱(SPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵鞘磷脂(ESM)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰基磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)。

在一些实施方式中，DSPC占约20wt％和约30wt％之间、约22wt％和约28wt％之间、或约24wt％和约26％之间。在一些实施方式中，DSPC占约20wt％、约21wt％、约22wt％、约23wt％、约24wt％、约25wt％、约26wt％、约27wt％、约28wt％、约29wt％或约30wt％。在一些实施方式中、DSPC占大于约20wt％、大于约21wt％、大于约22wt％、大于约23wt％、大于约24wt％、大于约25wt％、大于约26wt％、大于约27wt％、大于约28wt％、大于约29wt％或大于约30wt％。

在一些实施方式中，DSPC占5wt％和约15wt％之间、约7wt％和约13wt％之间、或约9wt％和约11％之间。在一些实施方式中，DSPC占约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％、约10wt％、约11wt％、约12wt％、约13wt％、约14wt％或约15wt％。在一些实施方式中，DSPC占小于约15wt％、小于约14wt％、小于约13wt％、小于约12wt％、小于约11wt％、小于约10wt％、小于约9wt％、小于约8wt％、小于约7wt％、小于约6wt％或小于约5wt％。

在一些实施方式中，DPPC占约5wt％和约30wt％之间。

在一些实施方式中，DPPC占约20wt％和约30wt％之间、约22wt％和约28wt％之间、或约24wt％和约26％之间。在一些实施方式中，DPPC占约20wt％、约21wt％、约22wt％、约23wt％、约24wt％、约25wt％、约26wt％、约27wt％、约28wt％、约29wt％或约30wt％。在一些实施方式中，DPPC占大于约20wt％、大于约21wt％、大于约22wt％、大于约23wt％、大于约24wt％、大于约25wt％、大于约26wt％、大于约27wt％、大于约28wt％、大于约29wt％或大于约30wt％。

在一些实施方式中，DPPC占约5wt％和约15wt％之间、约7wt％和约13wt％之间、或约9wt％和约11％之间。在一些实施方式中，DPPC占约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％、约10wt％、约11wt％、约12wt％、约13wt％、约14wt％或约15wt％。在一些实施方式中，DPPC占小于约15wt％、小于约14wt％、小于约13wt％、小于约12wt％、小于约11wt％、小于约10wt％、小于约9wt％、小于约8wt％、小于约7wt％、小于约6wt％或小于约5wt％。

在一些实施方式中，PEG的平均分子量为约200至约20000道尔顿。合适的PEG的非限制性实例包括PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 1000、PEG 1540、PEG 4000、PEG 5000、PEG6000、PEG 7000、PEG 8000、PEG 9000或PEG 10000。在一些实施方式中，PEG为PEG 8000。在一些实施方式中，PEG占约10wt％和约20wt％之间，约12wt％和约18wt％之间，约12wt％和约16％之间，或约12wt％和约14％之间。在一些实施方式中，PEG占约10wt％、约11wt％、约12wt％、约13wt％、约14wt％、约15wt％、约16wt％、约17wt％、约18wt％、约19wt％或约20wt％。在一些实施方式中，泊洛沙姆占大于约10wt％、大于约11wt％、大于约12wt％、大于约13wt％、大于约14wt％、大于约15wt％、大于约16wt％、大于约17wt％、大于约18wt％、大于约19wt％或大于约20wt％。在一些实施方式中，PEG占小于约20wt％、小于约19wt％、小于约18wt％、小于约17wt％、小于约16wt％、小于约15wt％、小于约14wt％、小于约13wt％、小于约12wt％、小于约11wt％或小于约10wt％。

在一些实施方式中，该组合物进一步包括胆固醇。在一些实施方式中，胆固醇占约1wt％和约10wt％之间、约2wt％和约8wt％之间、或约4wt％和约6％之间。在一些实施方式中，胆固醇占约1wt％、约2wt％、约3wt％、约4wt％、约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％或约10wt％。在一些实施方式中，泊洛沙姆占小于约10wt％、小于约9wt％、小于约8wt％、小于约7wt％、小于约6wt％、小于约5wt％、小于约4wt％、小于约3wt％、小于约2wt％或小于约1wt％。

在一些实施方式中，该组合物包括治疗剂(例如，爱帕琳)，其量在约5wt％和约30wt％之间、约10wt％和约25wt％之间、或约15wt％和约20％之间；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，其量在约1wt％和约14wt％之间、约2wt％和约12wt％之间、约4wt％和约10％之间、或约6wt％和约8％之间；DSPC，其量在约20wt％和约30wt％之间、约22wt％和约28wt％之间、或约24wt％和约26％之间；DPPC，其量在约20wt％和约30wt％之间、约22wt％和约28wt％之间、或约24wt％和约26％之间；和PEG(例如，PEG 8000)，其量在约10wt％和约20wt％之间、约12wt％和约18wt％之间、约12wt％和约16％之间、或约12wt％和约14％之间。在一些实施方式中，该组合物包括约25wt％的爱帕琳肽、约17wt％的泊洛沙姆188、约25wt％的DSPC、约25wt％的DPPC和约8wt％的PEG 8000。

在一些实施方式中，该组合物包括治疗剂(例如，爱帕琳)，其量在约35wt％和约60wt％之间、约35wt％和约55wt％之间、约35wt％和约50％之间、约35wt％和约45％之间、或约35wt％和约40％之间；泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)，其量在约12wt％和约20wt％之间、约12wt％和约18wt％之间、约12wt％和约16％之间、或约12wt％和约14％之间；DSPC，其量在约5wt％和约15wt％之间、约7wt％和约13wt％之间、或约9wt％和约11％之间；DPPC，其量在约5wt％和约15wt％之间、约7wt％和约13wt％之间、或约9wt％和约11％之间；PEG(例如，PEG 8000)，其量在约10wt％和约20wt％之间、约12wt％和约18wt％之间、约12wt％和约16％之间、或约12wt％和约14％之间；和胆固醇，其量在约1wt％和约10wt％之间、约2wt％和约8wt％之间、或约4wt％和约6％之间。在一些实施方式中，该组合物包括约45wt％的爱帕琳肽、约15wt％的泊洛沙姆188、约10wt％的DSPC、约10wt％的DPPC、约15wt％的PEG 8000和约5wt％的胆固醇。

在一些实施方式中，该组合物包括治疗剂(例如，爱帕琳肽)和泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)。

在一个实施方式中，该组合物是如下面阐释的“制剂1”。在另一个实施方式中，该组合物是如下面阐释的“制剂2”。在其他实施方式中，组合物包括与制剂1或2相同的组分和重量％，但是重量不同。

表2：制剂1和制剂2

在一些实施方式中，组合物进一步包括至少一种另外的治疗剂。合适的另外的治疗剂包括强心药(inotrope)、β肾上腺素能受体阻断剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻断剂(CCB)、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、利尿剂、ApoA-1模拟物、抗糖尿病药剂、减肥剂、醛固酮受体阻断剂、内皮素受体阻断剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝血剂、松弛素、BNP(奈西立肽)和/或NEP抑制剂。在一些实施方式中，另外的治疗剂是ACE抑制剂、松弛素、利尿钠肽、生长素释放肽或其他生物活性肽。合适的生物活性肽的非限制性实例包括图9A-D中的生物活性肽中的任一种(还参见例如，Erdmann 2008；Chakrabarti 2016)。

在一个实施方式中，另外的治疗剂选自强心药、β肾上腺素能受体阻断剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻断剂(CCB)、内皮素拮抗剂、肾素抑制剂、利尿剂、ApoA-l模拟物、抗糖尿病药剂、减肥剂、醛固酮受体阻断剂、内皮素受体阻断剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝血剂、松弛素、BNP(奈西立肽)、NEP抑制剂和血管紧张素转化酶-2(ACE-2)。术语“与第二药剂或治疗组合”包括与第二药剂或治疗共同施用本文公开和描述的组合物(例如，爱帕琳脂质体)，施用本文公开和描述的组合物，随后施用第二药剂或治疗，和首先施用第二药剂或治疗，随后施用本文公开和描述的组合物。如本文使用的强心药包括例如多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、甲氰吡酮、氨吡酮、左西孟旦、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和地高辛。如本文使用的β肾上腺素能受体阻断剂包括例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。如本文使用的抗凝血剂包括达肝素、达那肝素、依诺肝素、肝素、亭扎肝素(Tinzaparin)和华法林(Warfarin)。术语“HMG-Co-A还原酶抑制剂”(也称为β-羟基-β-甲基戊二酰-辅酶-A还原酶抑制剂)包括可用于降低血液中包括胆固醇的脂质水平的活性剂。实例包括阿托伐他汀、西立伐他汀、康帕丁(compactin)、达伐他汀、二氢康帕丁(dihydrocompactin)、氟仑多他汀(fluindostatin)、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、rivastatin、辛伐他汀、velostatin，和其药学上可接受的盐。术语“ACE-抑制剂”(也称为血管紧张素转化酶抑制剂)包括中断血管紧张素I酶促降解为血管紧张素II的分子。这样的化合物可用于调节血压和治疗充血性心力衰竭。实例包括阿拉普利、苯那普利、苯那普利拉、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫西普利、莫维普利(moveltopril)、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利(spirapril)、替莫普利和群多普利、佐芬普利或其药学上可接受的盐。术语“内皮素拮抗剂”包括波生坦、替唑生坦(tezosentan)和其药学上可接受的盐。在PCT公开号WO/2013/111110中描述了可接受的另外的治疗剂的另外的实例，其通过引用以其整体连同其中引用的对比文件并入。

在一些实施方式中，另外的治疗剂包括缬沙坦、坎地沙坦或氯沙坦。

在一些实施方式中，该组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体或其任何组合。在一些实施方式中，该组合物可溶于药学上可接受的赋形剂中。在一些实施方式中，该组合物可溶于药学上可接受的赋形剂中并且不会从其沉淀出，持续约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约1周、约2周、约3周、约1个月或更长的时间段。

该组合物可包括药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的盐、稀释剂、载体、媒介和技术人员熟知的这样的其他非活性剂。通常用于药物制剂的媒介和赋形剂包括例如滑石、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、可可脂、水性或非水性溶剂、油、石蜡衍生物、乙二醇等。可以使用水或生理上相容的有机溶剂比如乙醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇、二甲亚砜、脂肪醇、甘油三酯、丙三醇的偏酯，等来制备溶液。组合物可以使用常规技术来制备，该组合物可包括无菌等渗盐水、水、1,3-丁二醇、乙醇、1,2-丙二醇、与水混合的聚乙二醇、林格氏溶液等。在一个实施方式中，添加着色剂以便于将组合物定位和合适地放置到期望的治疗位点。

该组合物可包括防腐剂和/或稳定剂。防腐剂的非限制性实例包括甲基-、乙基-、丙基-对羟基苯甲酸酯、苯甲酸钠、苯甲酸、山梨酸、山梨酸钾、丙酸、苯扎氯铵、苯甲醇、硫柳汞、苯基汞盐、氯已定、苯酚、3-甲酚、季胺化合物(QAC)、氯丁醇、2-乙氧基乙醇和咪脲。

为了控制肌肉弹性，该组合物可包括生理盐，比如钠盐。优选的是氯化钠(NaCl)，其可以以1和20mg/ml之间存在。可能存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁和氯化钙。

组合物可包括一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；三羟甲基氨基甲烷缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸盐缓冲液。典型地将包括浓度在5-20mM范围内的缓冲液。组合物的pH将通常在5和8之间，和更典型地在6和8之间，例如在6.5和7.5之间，或在7.0和7.8之间。

在一些实施方式中，该组合物可包括冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括二醇(例如，乙二醇、丙二醇和甘油)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、蔗糖、海藻糖、右旋糖和其任何组合。

该组合物可以包括在可植入装置中。本发明考虑的合适的可植入装置包括血管内支架(例如，自膨胀支架、球囊可扩张支架和支架-移植物)、支架(scaffold)、移植物等。可以将根据本文公开和描述的实施方式的组合物涂布或浸渍在这种可植入装置的至少一个表面上。

治疗方法

本文提供了在需要其的受试者中治疗或预防心血管相关疾病的方法。在一些实施方式中，该方法包括向受试者施用本文公开和描述的治疗有效量的组合物。

合适的心血管相关疾病的非限制性实例包括心脏疾病、血管疾病和代谢疾病。本文公开和描述的组合物可用于治疗的其他合适的病况包括水潴留和烧伤。心脏疾病的非限制性实例包括慢性心力衰竭、急性失代偿性心力衰竭、心肌梗死后、心房颤动、布鲁加综合征(Brugada Syndrome)、心室性心动过速(Ventricular Tachycardia)、动脉粥样硬化、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心脏缺血性/再灌注损伤、心律失常和淀粉样变性病。血管疾病的非限制性实例包括高血压、顽固性高血压(Resistant Hypertension)、肺动脉高压、外周动脉疾病、勃起功能障碍、再狭窄和先兆子痫。代谢疾病的非限制性实例包括2型糖尿病、1型糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变、慢性肾病、急性肾病、肾纤维化、肾缺血性/再灌注损伤、多囊性肾病、血液透析和肥胖。

在一些实施方式中，心血管相关疾病选自肺动脉高压、心力衰竭、心肌梗死、糖尿病性肾病、慢性肾病、急性肾病、勃起功能障碍、糖尿病和代谢相关的病症。

可以通过任何合适的模式和途径将组合物施用于受试者。非限制性实例包括内部、肺的、直肠、阴道、舌、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮内和皮下途径。在一些实施方式中，组合物被静脉内或皮下施用。组合物也适合作为乳霜、凝胶或贴剂的一部分，用于经皮递送。其他剂型包括片剂、胶囊、丸剂、散剂(powder)、气溶胶、栓剂、注射剂(parenteral)和口服液，包括悬浮液、溶液和乳液。也可以使用缓释或加速释放剂型。

在一个实施方式中，向患有心血管相关疾病的受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括量为约25wt％的DSPC、量为约25wt％的DPPC、量为约8.33wt％的泊洛沙姆188、量为约16.67wt％的PEG 8000和量为约25wt％的[Pyr1]-爱帕琳-13。

在一个实施方式中，向患有心血管相关疾病的受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括量为约10wt％的DSPC、量为约10wt％的DPPC、量为约15wt％的泊洛沙姆188、量为约15wt％的PEG 8000、量为约45wt％的[Pyr1]-爱帕琳-13和量为约5wt％的胆固醇。

在一个实施方式中，通过静脉内、皮下、口服或经吸入向患有心血管相关疾病的受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括量为约25wt％的DSPC、量为约25wt％的DPPC、量为约8.33wt％的泊洛沙姆188、量为约16.67wt％的PEG 8000和量为约25wt％的[Pyr1]-爱帕琳-13。

在一个实施方式中，通过静脉内、皮下、口服或经吸入向患有心血管相关疾病的受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包括量为约10wt％的DSPC、量为约10wt％的DPPC、量为约15wt％的泊洛沙姆188、量为约15wt％的PEG 8000、量为约45wt％的[Pyr1]-爱帕琳-13和量为约5wt％的胆固醇。

在一个实施方式中，向受试者施用本公开内容的组合物，该组合物的量足以提供治疗剂的每日剂量，该治疗剂的每日剂量为约1mg至约10,000mg、约25mg至约5000mg、约50mg至约3000mg、约75mg至约2500mg或约100mg至约1000mg，例如约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1100mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg、约2400mg、约2425mg、约2450mg、约2475mg或约2500mg。

在一个实施方式中，向受试者施用本公开内容的组合物，该组合物的量足以提供治疗剂的每周剂量和/或每两周剂量，该治疗剂的每周剂量和/或每两周剂量为约1mg至约10,000mg、约25mg至约5000mg、约50mg至约3000mg、约75mg至约2500mg或约100mg至约1000mg，例如约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1100mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg、约2400mg、约2425mg、约2450mg、约2475mg或约2500mg。

在一个实施方式中，向受试者施用本公开内容的组合物，该组合物的量足以提供治疗剂的每月剂量，该治疗剂的每月剂量为约1mg至约10,000mg、约25mg至约5000mg、约50mg至约3000mg、约75mg至约2500mg或约100mg至约1000mg，例如约75mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、约200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1100mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg、约2400mg、约2425mg、约2450mg、约2475mg或约2500mg。

实施例

实施例1：心肌肥大和心力衰竭的小鼠模型中爱帕琳制剂的药效学

动物.将6至8周龄和8至10周龄的C57BL/6J小鼠用作横向主动脉缩窄(TAC)-诱导的心脏肥大和心力衰竭的药效动物模型。将小鼠相应地分组为如下面表3所显示的治疗组。小鼠接受腹膜内注射的100μL的PBS(假手术组)、仅赋形剂(脂质体)对照组，仅爱帕琳(制剂B组)，或爱帕琳脂质体(制剂C组)。

表3：小鼠治疗组

治疗组	动物的数量
		假手术组	6
对照组–仅脂质体	6
		制剂B组–仅爱帕琳	7
仅制剂C–爱帕琳脂质体	7

TAC手术过程。将手术区域消毒用于双目立体操作。制备切口，以显示心脏和左心耳。然后，在立体显微镜下，仔细观察自由头臂茎和左颈总动脉之间的主动脉弓区域。将主动脉放置在头臂茎和左颈总动脉之间的4-号针(直径0.4mm)上，导致主动脉狭窄。将手术位点缝合并且观察小鼠的正常胸腔起伏。将小鼠随机分成上表列出的四组。简而言之，对照组(腹膜内注射没有药物的空白赋形剂)、制剂B组(仅爱帕琳)、制剂C组(爱帕琳脂质体)；其他组是假手术组，其具有相应的小鼠的手术操作，但是没有主动脉的变窄。

超声心动图功能的评估。在第一次给药之前1小时、第一次给药之后1小时和在手术之后1周和2周，评估小鼠。简而言之，M型超声心动图用于检测术后小鼠的心脏功能的改变。通过M型超声和2D图像记录左心室前后壁的改变。M-曲线显示了心内膜的位置和动态，以测量收缩期和舒张期左心室前后直径尺寸的端点。计算左心室收缩直径(LVID)、左心室末期舒张直径(LVIDd)、左心室射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)、左心室后壁厚度(LVPWd)并且测量其他参数。

病理学评估。在研究结束时，将动物处死并且进行开胸手术，以去除心脏。将心脏在常用的生理盐水中冲洗并且固定在新鲜的4％低聚甲醛中。在用Masson染色处理之后，将样品石蜡包埋并且进行显微镜观察。用HE染色进行类似的过程。评估指标：病理学描述，主要研究肥大。

统计分析。通过平均值±标准偏差描述每组的实验数据。单因素ANOVA用于比较正常组和方差组之间的区别。LSD检验用于比较两个组之间的区别。Kruskal-Wallis H检验(KW)用于检验两个组之间的区别以及正态分布或方差。Mann-Whitney U方法用于组之间的多重比较。p<0.05的区别是统计上显著的。所有的统计分析使用Windows软件的SPSS 22.0进行。

按照上述方法，超声引导的M型超声检查用于测量胸骨左心室的EF、FS、LVIDs、LVIDd和LVPWd，以便确定心脏功能的改变。

射血分数(EF)是每次心跳，从心脏的心室喷射的血液的分数。通过将心博量除以舒张末期体积来计算EF，并且是心脏的泵送效率的体积测量。射血分数是心脏功能的重要指标。如图1A和1B中显示，手术后一天(1D)，假手术组具有稍微下降的EF值，推测是由于胸廓损伤；但是在手术后七天(7D)，EF值已经恢复并且然后保持在相对稳定状态。在对照组中，7天之后EF值继续下降并且7天之后下降更严重。推测在主动脉收缩之后立即出现了心脏损伤并且损伤之后7D的补偿效应随着后续的损伤继续而更明显。在两个施用组中，EF水平的下降在1D后慢慢缓和。

左心室收缩分数(FS)与EF类似并且是心脏收缩功能的重要指标。如图2A和2B中显示，在1D之后，假手术组具有稍微下降的FS值，推测是由于胸廓损伤。在第7D，FS值已经恢复然后保持在稳定状态。在对照组中，7D之后FS值继续下降并且在7D之后下降更严重。推测在主动脉收缩之后立即出现了心脏损伤并且损伤之后7D的补偿效应随着另外损伤的出现更明显。在两个施用组中，1D之后，FS水平的下降慢慢减弱。

左心室收缩直径(LVIDs)改变可反映心脏重塑。从图3A和3B，在1D之后，假手术组的LVIDs稍微增加，推测是由于胸廓损伤。在7D，LVIDs已经恢复然后保持在稳定状态。7天之后，对照组的LVIDs继续增加。推测在主动脉收缩之后立即出现了心脏损伤，并且损伤之后7D的补偿效应随着另外损伤的出现更明显。对于两个施用组，在术后1D观察到了LVIDs的增加，但是该增加在持续14D中减弱。

左心室舒张直径(LVIDd)改变可反映心脏重塑。如图4A和4B中显示，7D之后，假手术组的LVIDd稍微增加，推测是由于胸廓损伤。在7D之后，该LVIDd开始下降。手术之后对照组的LVIDd持续增加，表明在主动脉收缩之后立即出现损伤并且出现进一步的损伤。在两个施用组中，LVIDd水平在1D增加，但是该升高的水平接着消失。

左心室舒张末期壁厚(LVPWd)改变可反映心脏重塑。如图5A和5B中显示，在1D之后，假手术组LVPWd值相对稳定；这在7D之后稍微升高，推测是由开胸术损伤造成的。手术之后对照组的LVPWd增加。在两个施用组中，LVPWd在1D时增加，但是增加在此后逐渐减弱。

在所有组中，在手术之后1D，LVIDs、LVIDd和LVPWd增加，并且EF和FS值在所有组中在手术之后1D下降(见图6A)。推测损伤主要是由主动脉收缩造成的。另外，在假手术组和制剂C组之间观察到了最小的改变，其表明对于治疗损伤，制剂C(爱帕琳脂质体)比制剂B(仅爱帕琳)更有效。图6B显示，在7D之后，LVIDs、LVIDd、LVPWd在各自组中增加，其中假手术组的增加最少。这表明外科创伤在施用组中逐渐恢复，其中制剂C组增加较少。该结果也表明爱帕琳在D7继续起作用。假手术组EF和FS与基线持平，表明由外科创伤造成的降低的心脏功能已经恢复。最后，如图6C中可见，在14D，假手术组LVIDs、LVIDd、LVPWd、EF和FS与基线持平，表明由外科创伤造成的心脏功能障碍已经恢复。如预期的，对照组中改变最大。在两个治疗组中，所有的指数显示药物是有效的并且制剂C组的改变最接近假手术组。该结果表明，对于治疗损伤，爱帕琳脂质体优于单独爱帕琳。

在实验结束时，处死所有小鼠并且进行组织学分析。利用HE染色，如图7A-7D中显示，假手术组具有有序的和均匀分布的心肌以及薄的血管壁(图7A)。相反，对照组具有损伤的心脏结构完整性、心肌心率失常、肿胀以及增厚的血管壁(图7B)。用制剂B治疗的小鼠显示具有保持完整性的心脏结构，有序排列的心肌，但是也显示大的心肌间质，其显示多发性心肌梗死或出血(图7C)。用制剂C治疗的小鼠也显示具有保持完整性的心脏结构，有序排列的心肌，展示多发性心肌梗死或出血(图7D)。与制剂B(单独爱帕琳)相比，制剂C组(爱帕琳脂质体)的心肌梗死或出血的量较少。利用Masson三色染色，如图8A-8D中显示，假手术组具有以规律顺序排列的心肌——心肌细胞，具有完整、紧凑、薄的血管壁的(图8A)。存在少量的胶原沉积。相反，对照组具有大区域的胶原沉积(图8B)。用制剂B治疗的小鼠显示大量的心肌胶原沉积(图8C)，但是不如对照组中观察到的多。与制剂B相比，用制剂C治疗的小鼠显示仅少量的胶原沉积(图8D)。爱帕琳脂质体比单独爱帕琳更大程度地减弱纤维化。

在诱导心力衰竭之后施用制剂B(单独爱帕琳)和制剂C(爱帕琳脂质体)二者恢复收缩性(EF和FS)。此外，它们抑制肥大性生长，如通过主动脉收缩后LVID、LVIDd和LVPWd的增加的减弱所证明。在直接比较中，与制剂B(单独爱帕琳)相比，制剂C(爱帕琳脂质体)提供了更有利的治疗益处。

总之，这些数据表明爱帕琳脂质体可用于治疗心脏肥大和心力衰竭。

实施例2：爱帕琳制剂对于心肌梗死的治疗

动物实验方案。从标准来源获得重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠(年龄，8岁)。在12小时明暗循环下将大鼠维持在温度控制(20-22℃)的环境中。将大鼠分成三组(n＝6/组)，如下：假手术；左前降支动脉(LAD)结扎组；和LAD+爱帕琳组。爱帕琳组接受根据下列表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

表4：治疗制剂

LAD组中的大鼠经历LAD结扎手术(Patten 1998；Ahn 2004)。简而言之，经由腹膜内注射用10％的水合氯醛(3.5ml/kg)来麻醉大鼠。在仰卧位，进行气管内插管，并使用啮齿动物呼吸机对大鼠进行通气(速率，80次呼吸/分钟；潮气量，6-8ml/kg)。然后打开胸腔并暴露心脏。使用7-0丝将LAD结扎。通过心肌漂白确认成功的LAD结扎，并且胸腔是逐层关闭的。在LAD结扎手术后，大鼠接受2.5×104U青霉素的肌肉内注射。假手术组的大鼠接受相同的手术，但没有结扎。LAD+爱帕琳组中的大鼠在LAD结扎手术后接受腹膜内注射，每天给药爱帕琳，持续4周。假手术组和LAD组中的大鼠接受等量的生理盐水。在4周后，用10％的水合氯醛麻醉每组中的大鼠。测量左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室最大压力上升速率(LV+dp/dtmax)和左心室最大压力下降速率(LV-dp/dtmax)。用10％的水合氯醛(3.5ml/kg；腹膜内注射)麻醉大鼠。收集血液并在室温下储存2-4小时，并以4,000rpm离心10分钟。收集上清液并获得血清。所有动物实验均根据实验动物护理和使用指南进行。

预期用爱帕琳脂质体治疗将导致一种或多种以下结果：缓解心肌梗死诱导的左心室功能障碍(例如，LVSP、LVEDP)；减轻心肌梗死诱导的心肌纤维化(通过Masson三色染色测量)；减少纤维化标记物(例如，TGF-β、CTGF、Col-1、MMP-2和MMP-9)；并降低血管紧张素II和NF-κB水平。

实施例3：爱帕琳制剂对于肺动脉高压(PAH)的治疗

患有PAH的20名患者将参与右心脏导管插入术期间，爱帕琳脂质体和匹配的盐水安慰剂注射液的随机双盲安慰剂对照研究(Vestbo 2013；Vestbo 2015)。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的相同配方的爱帕琳脂质体。

测量平均肺动脉压、肺动脉楔压和心输出量。预期用爱帕琳脂质体治疗将导致心输出量的增加。

实施例4：爱帕琳制剂对于糖尿病的治疗

健康的超重男性参加随机双盲安慰剂对照交叉研究，该研究相继考虑两种剂量的爱帕琳脂质体的效力和耐受性。第一组受试者将接受爱帕琳脂质体的给药，并且在检查安全性数据后，第二组将接受更高的剂量(n＝8)。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

使每个志愿者经历两次高胰岛素-正葡萄糖钳夹，其中测量从第90分钟到第120分钟的葡萄糖输注速率(GIR)的基础水平(水平1)。然后开始连续地静脉注射施用爱帕琳或安慰剂，持续2小时，最后评估从第210分钟到第240分钟的GIR(水平2)。初步评估终点是水平2和水平1之间的GIR的差(ΔGIR)。预期用爱帕琳脂质体治疗将导致ΔGIR相对于对照的增加。

实施例5：爱帕琳制剂对于糖尿病性肾病的治疗

获得在C57BL/6背景上繁殖的成对的Akita(胰岛素2+/-)小鼠。

在12小时的明暗循环的温度受控的房间(22±2℃)中，将动物饲养在通风的微型隔离笼中，自由获取水和食物。在本研究中使用雄性Akita小鼠(胰岛素2+/-)和它们的非糖尿病同窝小鼠(胰岛素2+/+，野生型(WT))。

将小鼠分成四组：PBS处理的WT小鼠(WT)；爱帕琳处理的WT小鼠(WT+Ap)；PBS处理的Akita小鼠(AK)；和爱帕琳处理的Akita小鼠(AK+Ap)。实验从9周龄开始，因为雄性Akita小鼠在4-7周龄时开始显示高血糖症。因此，在实验开始时动物的症状与早期糖尿病患者的症状相似。经由尾静脉注射向Akita小鼠施用爱帕琳脂质体，每天两次。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

在本研究中，经由尾静脉将爱帕琳脂质体或PBS从最远端注射到尾根。动物将在19周时用水合氯醛(IP，500mg kg-1)经历终末(terminal)麻醉，以便能够收集肾脏和血清，其通过放血导致随后的死亡。

预期用爱帕琳脂质体治疗将导致一种或多种以下结果：抑制糖尿病引起的肾功能障碍(例如，肾重量、肾指数(KI)、蛋白尿、白蛋白/球蛋白(A/G))、肾小球滤过率(GFR)和肾组织学变化；通过上调HDAC抑制肾脏中糖尿病诱导的组蛋白高度乙酰化(例如，ac-H3K9、ac-H3K18和ac-H3K23)；抑制Akita小鼠中糖尿病诱导的肾脏炎症(例如，MCP-1、ICAM-1和iNOS)。进一步预期用爱帕琳脂质体治疗将导致一种或多种以下结果：抑制肾肥大；抑制肾小球肥大；减少蛋白尿；减少单核细胞浸润；减少肾脏炎症(例如，MCP1和VCAM1量减少)；并恢复抗氧化剂过氧化氢酶水平。

实施例6：爱帕琳制剂对于慢性肾病的治疗

获得7周龄雄性C57Bl/6j小鼠(重约20-22g)。将动物随机分为四组(n＝5)：(1)假手术+载体，(2)UUO(单侧输尿管梗阻)+载体，(3)UUO+爱帕琳脂质体，和(4)假手术+爱帕琳脂质体。使用已制定的方案(Jones 2009)进行UUO。

简而言之，将小鼠用戊巴比妥钠(50mg/kg体重)麻醉并且将左输尿管双重结扎。假手术的小鼠将暴露它们的输尿管，而不结扎。手术当天开始，通过腹膜内注射，小鼠接受爱帕琳脂质体或单独载体，每24小时一次。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

2周之后，将小鼠杀死并且去除它们的肾组织，用于各种分析。预期用爱帕琳脂质体治疗将产生一个或多个下述结果：减轻肾间质性纤维化(根据Masson三色染色减少纤维区域，减少纤连蛋白和胶原I沉积)；抑制上皮间叶细胞转化(EMT)标记物的表达(保持层粘连蛋白，保持上皮E-钙粘着蛋白，和抑制α-SMA(平滑肌肌动蛋白)表达)；抑制TGF-β1和SMAD2途径(降低TGF-β和TGF-β受体水平和p-SMAD2水平)。

实施例7：爱帕琳制剂对于急性肾病的治疗

获得动物和肾缺血/再灌注(I/R)模型雄性Wistar大鼠并且饲养在通风的微型隔离笼中，自由获取水和食物。使用重180±20g的大鼠并且将其分至下述的一个组中：CT组，载体施用的未受损大鼠；I/R组，载体施用的经历I/R损伤的大鼠；I/R+Ap组，用爱帕琳脂质体的经历I/R损伤的大鼠。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

如先前描述进行I/R损伤(Supavekin 2003)。简而言之，将大鼠麻醉并作出中线腹部切口，通过夹子将它们的左肾蒂直接夹30分钟(单侧的肾闭塞)。在去除夹子之后，缝合创伤并且使动物恢复3天，然后处死。将对照动物进行假手术。

预期用爱帕琳脂质体的治疗将导致一种或多种下述结果：防止肾I/R损伤诱导的形态学变化和功能改变(来自HE染色的形态学变化；肾功能障碍包括增加的尿量、蛋白尿和肌酸酐排出)；抑制I/R损伤诱导的肾脏炎症和细胞凋亡(减少炎症标记物MCP-1和ICAM-1，减少细胞凋亡标记物半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-8)；抑制肾脏中的组蛋白超甲基化(减少H3K4me2和H3K79me1)；和抑制I/R诱导的Tgf-β1上调(降低Tgf-β1水平)。

实施例8：爱帕琳制剂对于勃起功能障碍(ED)的治疗

在该研究中将使用雄性C57BL/6J小鼠。两种不同的血管源性ED模型可用于检查阴茎海绵体组织中爱帕琳和APJ的差异基因表达。一种模型是由髂内动脉的双侧闭塞诱导的急性海绵状局部缺血模型。另一种模型是慢性血管源性ED模型，其中高胆固醇血症或糖尿病分别通过进食高胆固醇饮食或通过腹膜内注射STZ诱导。

对于急性海绵状局部缺血模型，用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)肌肉内麻醉12周龄的C57BL/6J小鼠，并将其仰卧放置在温控手术台上。在作出低中线腹部切口后，将髂内动脉夹紧并刚好在髂总动脉分叉处的远端双侧结扎。

对于慢性血管源性ED模型，对8周龄的C57BL/6J小鼠进食包含4％的胆固醇和1％的胆酸的饮食，持续3个月，或如前所述，接受腹膜内注射多个低剂量的STZ(在pH 4.5的0.1M柠檬酸盐缓冲液中50mg/kg体重)，连续5天(参见例如，Jin 2009；Ryu 2009)。

在开始高胆固醇饮食后3个月，用市售试剂盒(例如，Boehringer Mannheim GmBH，Mannheim，Germany)和自动分析仪(例如，HITACHI 7600，Hitachi Koki Co.，Hitachinaka，Japan)测定血清总胆固醇水平。在腹膜内注射STZ之前和之后2个月，用标准血糖仪(例如，Accu-check，Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)测量空腹和餐后血糖水平。通过使用半定量RT-PCR，在每个血管源性ED模型的阴茎海绵体组织(在髂内动脉双侧闭塞之后0、1、3、6、12、24和72小时；在开始高胆固醇饮食后3个月；和腹膜内注射STZ后2个月)和年龄匹配的对照组中测定爱帕琳和APJ的信使RNA(mRNA)水平。

还将确定爱帕琳蛋白在高胆固醇血ED的小鼠模型中恢复勃起功能的效力。在开始高胆固醇饮食后3个月，基于在用爱帕琳治疗的高胆固醇血的小鼠中具有最高勃起功能恢复的剂量来确定在单次海绵窦内注射爱帕琳脂质体后1天勃起功能恢复的爱帕琳的最佳剂量。

在该初始研究的基础上，将动物分成三组：第1组，年龄匹配的对照；第2组，接受单次海绵窦内注射PBS(20mL)的高胆固醇血的小鼠；和第3组，接受单次海绵窦内注射爱帕琳脂质体的高胆固醇血的小鼠。爱帕琳组接受根据上面表4中阐释的配方的爱帕琳脂质体。

通过在治疗后1天电刺激海绵状神经(每组N＝6)和阴茎来确定勃起功能，然后收集样品用于组织学检查。来自单独动物组的海绵状样品将用于蛋白质印迹分析(每组N＝4)。

预期用爱帕琳脂质体治疗将导致一种或多种下述的结果：与接受PBS的高胆固醇血的小鼠(或其他对照)相比，接受爱帕琳脂质体的高胆固醇血的小鼠对海绵状神经刺激的勃起反应显著增加；通过减少活性氧类(ROS)，比如超氧阴离子的产生，增加海绵状eNOS磷酸化并减少海绵状内皮细胞凋亡。

实施例9：爱帕琳制剂

使用下述方案形成爱帕琳脂质体。在下面表5中概述了脂质体组分。

表5：脂质体组分

简而言之，将DSPC(450mg)和DPPC(450mg)溶解在乙醇(最小量)中，超声处理直至完全溶解。将PEG 8000(300mg)和泊洛沙姆188(150mg)置于甲醇中，超声处理直至完全溶解。将两种溶液混合在一个小瓶中。然后鼓入氮气以除去溶剂。将最终固体在真空中干燥3小时。将脂质膜溶解在柠檬酸(300mmol)溶液中。将膜悬浮15分钟并用0.2nm大小的聚碳酸酯过滤。通过透析使混合物与蒸馏水交换，并且然后冷冻干燥。然后将爱帕琳(180mg)溶解在蒸馏水中并加入到脂质膜中，在缓慢混合期间加入另外的水，持续约30分钟至1小时。并且然后将脂质体在37℃下孵育90分钟。并且然后冷冻干燥。

本技术的实施方式的以上详细描述并不旨在穷举的或将该技术限于上面公开的精确形式。尽管出于说明性目的在上面描述了本技术的具体实施方式和实施例，但是各种等同修改在该技术的范围内都是可能的，如相关领域的技术人员将认识到的。还可以组合本文描述的各种实施方式以提供进一步的实施方式。

从前述内容可以认识到，本文已经出于说明的目的描述了该技术的具体实施方式，但是没有详细显示或描述熟知的结构和功能以避免不必要地模糊该技术的实施方式的描述。在上下文允许的情况下，单数或复数术语也可以分别包括复数或单数术语。

还将认识到，本文已经出于说明的目的描述了具体实施方式，但是在不脱离本技术的情况下可以进行各种改进。此外，虽然已经在那些实施方式的上下文中描述了与该技术的某些实施方式相关的优势，但是其他实施方式也可以展现出这样的优势，并且并非所有实施方式都必须展现出落入该技术的范围内的这样的优势。因此，本公开内容和相关技术可以包含未在此明确示出或描述的其他实施方式。

参考文献

1.Ahn et al.Am J Physiol Heart Circ Physiol 286(3):H1201-1207(2004)

2.Chakrabarti et al.Food Sci Human Wellness 5(1):1-7(2016)

3.Erdmann et al.J Nutr Biochem 19(10):643-654(2008)

4.Jin et al J Sex Med 6(12):3289-3304(2009)

5.Jones et al Nephrol Dial Transplant 24(10):3024–3032(2009)

6.Patten et al.Am J Physiol 274(5 Pt 2):H1812-H1820(1998)

7.Ryu et al J Sex Med 6(7):1893-1907(2009)

8.Supavekin et al.Kidney Int 63(5):1714-1724(2003

9.Vestbo et al.Eur Respir J 41(5):1017-1022(2013)

10.Vestbo et al.,"Study to understand mortality and morbidity in COPD(SUMMIT),"Eur Respir J 46:Suppl.59(2015)

序列表

<110> 阿维夫公司

J·拉贾达斯

<120> 用于治疗心血管相关疾病的爱帕琳的新型聚乙二醇化的脂质体制剂

<130> 126583-8001.WO00

<150> US 62/410,160

<151> 2016-10-19

<150> US 62/464,594

<151> 2017-02-28

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 77

<212> PRT

<213> 智人

<300>

<308> NP_059109.3

<309> 2017-10-03

<313> (1)..(77)

<400> 1

Met Asn Leu Arg Leu Cys Val Gln Ala Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser

1 5 10 15

Leu Thr Ala Val Cys Gly Gly Ser Leu Met Pro Leu Pro Asp Gly Asn

20 25 30

Gly Leu Glu Asp Gly Asn Val Arg His Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser

35 40 45

Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg

50 55 60

Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe

65 70 75

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是任意氨基酸

<400> 4

Xaa Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro Phe

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro Met Pro

1 5 10 15

Phe

<210> 6

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly Pro

1 5 10 15

Met Pro Phe

<210> 7

<211> 36

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Leu Val Gln Pro Arg Gly Ser Arg Asn Gly Pro Gly Pro Trp Gln Gly

1 5 10 15

Gly Arg Arg Lys Phe Arg Arg Gln Arg Pro Arg Leu Ser His Lys Gly

20 25 30

Pro Met Pro Phe

35

Claims (24)

1.一种组合物，其包括至少部分封装在脂质体中的有效量的治疗剂，所述脂质体包括一定量的至少一种泊洛沙姆、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)和聚乙二醇(PEG)。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述治疗剂是爱帕琳肽。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种泊洛沙姆是泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆184、泊洛沙姆188、泊洛沙姆331和泊洛沙姆407，或其任何组合。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PEG的平均分子量为约200至约20000道尔顿(PEG 200至PEG 20000)。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述PEG的平均分子量为约8000道尔顿(PEG8000)。

6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述爱帕琳肽占约15wt％和约60wt％之间。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述泊洛沙姆占约1wt％和约20wt％之间。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述DSPC占约5wt％和约30wt％之间。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述DPPC占约5wt％和约30wt％之间。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述PEG占约10wt％和约20wt％之间。

11.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括胆固醇。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述胆固醇占约1wt％和约10wt％之间。

13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，进一步包括药学上可接受的赋形剂。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述组合物在所述药学上可接受的赋形剂中是可溶的。

15.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括至少一种另外的治疗剂。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述至少一种另外的治疗剂选自：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、松弛素、利尿钠肽、生长素释放肽或其他生物活性肽。

17.一种组合物，其包括约25wt％的爱帕琳肽、约17wt％的泊洛沙姆188、约25wt％的DSPC、约25wt％的DPPC和约8wt％的PEG 8000。

18.一种组合物，其包括约45wt％的爱帕琳肽、约15wt％的泊洛沙姆188、约10wt％的DSPC、约10wt％的DPPC、约15wt％的PEG 8000和约5wt％的胆固醇。

19.一种在需要其的受试者中治疗或预防心血管相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的组合物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述心血管相关疾病是肺动脉高压、心力衰竭、心肌梗死、糖尿病性肾病、慢性肾病、急性肾病、勃起功能障碍、糖尿病或代谢相关的病症。

21.根据权利要求19所述的方法，其中静脉内、皮下、口服或经吸入施用所述组合物。

22.一种制备根据权利要求1至18中任一项所述的组合物的方法，其包括：

将DSPC和DPPC溶于乙醇中并且超声处理直到溶解，以形成第一组合物；

将PEG和泊洛沙姆溶于甲醇中并且超声处理直到溶解，以形成第二组合物；

由所述第一组合物和所述第二组合物形成脂质膜；和

将所述治疗剂与所述脂质膜混合，以形成脂质体。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述脂质体是冷冻干燥的。

24.一种试剂盒，其包括根据权利要求1所述的组合物和用于治疗或预防心血管相关疾病或病症的说明书。