CN112891318A

CN112891318A - 一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途

Info

Publication number: CN112891318A
Application number: CN201910950783.2A
Authority: CN
Inventors: 叶丽; 库德莱迪·库尔班; 张慧; 刘嘉扬
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2021-06-04

Abstract

本发明属医药技术领域，涉及载药纳米粒，具体涉及一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途。本发明提供了一种采用减毒肺炎克雷伯菌来源的细菌外膜囊泡OMVs包载肿瘤化疗药物阿霉素DOX，制备细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒DOX‑OMV，经抗非小细胞肺癌作用试验研究显示，该DOX‑OMV纳米粒能同时发挥肺癌细胞靶向作用和诱导抗肿瘤免疫效应，延长药物半衰期，从而显著增强化疗药物阿霉素抗非小细胞肺癌疗效，并具备良好的安全性。本发明制备的DOX‑OMV纳米粒可用于制备抗非小细胞肺癌的药物。

Description

一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途

技术领域

本发明属医药技术领域，涉及载药纳米粒，具体涉及一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途。

背景技术

据统计，肺癌的发病率占全球癌症新发病例的11.6％，死亡率占全球癌症死亡人数的18.4％；在中国，肺癌是在男性和女性中发病率和死亡率最高的癌种。调查显示，较常见的肺癌类型是非小细胞肺癌(NSCLC)，其在所有肺癌中占比达到85％。临床实践中，根据肺癌的不同分期，可对患者采取手术切除治疗、放射治疗和化学治疗等治疗手段。近年来，免疫治疗和靶向治疗为改善NSCLC的治疗效果做出了重大贡献，然而，联合化疗仍然是IV期NSCLC患者的一线治疗方法，由于NSCLC患者易产生多药耐药性，最终导致其预后不良并具有较低的五年总生存率。

阿霉素(Doxorubicin,DOX)属于蒽环类抗生素，是目前最有效且应用最广泛的抗肿瘤药物之一，其抗肿瘤的作用机制主要是通过抑制I型和II型拓扑异构酶，并嵌入DNA中，从而诱导DNA断裂并抑制核酸的合成；作为广谱化疗药物，DOX适用于多种癌症的治疗，包括肺癌、急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌以及胃癌等，但是，实践显示，DOX对肿瘤细胞缺乏靶向性，因此会引起许多严重的毒副反应，例如，DOX具有较大的心脏毒性，易导致心电变化和充血性心衰，并且其能够造成骨髓抑制和免疫抑制等，这种非特异性的作用方式极大地限制了其临床应用。

为了提高化疗药物的组织细胞渗透性和选择性，延长体内循环时间，从而减轻其对正常组织的细胞毒性，本领域的研究者们开发了多种药物递送系统，如，脂质体是由卵磷脂和神经酰胺等双分子层包裹形成的囊泡，其组成成分与生物细胞膜类似，对机体具有很强的亲和力，同时具有良好的靶向性和缓释性；美国食品药品监督管理局于1995年11月17日批准了第一个聚乙二醇修饰的脂质体DOX药物(Doxil)，用于乳腺癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤和艾滋病相关卡波氏肉瘤的一线治疗；Doxil的药效与DOX普通制剂相当，但可以改善其药代动力学和体内分布，并且明显降低心脏毒性。由于Doxil具有纳米粒的高渗透长滞留效应(EPR)，可以对肿瘤产生被动靶向性，因此与邻近的正常组织相比，其在肿瘤组织中表现出相对较高的药物浓度，然而，Doxil尚存在皮肤毒性和生物利用度较低的问题，所以在临床上未得到广泛的应用，因此，本领域研究者们仍在不断探索更加有效且具有低细胞毒性的药物递送系统，以期改善DOX的治疗效果。

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌和少量革兰氏阳性菌中普遍存在的球形、双层膜囊泡状结构，直径20-250nm，参与细胞间通讯、DNA转移、细胞代谢物和毒力因子的运输等多种生物学过程。研究显示，OMVs携带大量的细菌抗原，能够有效激活体内免疫系统，所以它可以作为良好的疫苗候选并应用于免疫治疗，其中，脑膜炎奈瑟菌B群OMVs疫苗已被欧盟、加拿大和澳大利亚批准用于2个月以上的人群，它是全球首个用于帮助所有年龄段人群预防B型脑膜炎的疫苗，高达8千万单位的使用剂量证实了它的安全性。据文献报道，OMVs可以将致病菌的细菌肽聚糖递送至宿主细胞，并且以免疫识别受体NOD1和RIP2激酶依赖的方式诱导上皮细胞中自噬体的形成和IL-8的产生，从而促进细胞自噬以及炎症信号的传导；同时，OMVs能够诱导树突状细胞的成熟，这需要LPS和髓样分化初级应答蛋白88(MyD88)的参与，从而实现OMVs抗原向CD8+T细胞的呈递。

目前为止，OMVs已被广泛用作蛋白质、质粒、小干扰RNA(siRNA)和其他治疗药物的递送载体；利用基因工程大肠杆菌可以获得具有低免疫原性且与人表皮生长因子受体2(HER2)特异性结合的OMVs，其可以通过递送靶向纺锤体驱动蛋白(KSP)的siRNA，对HER2+肿瘤发挥杀伤作用，实现肿瘤细胞特异性的治疗效果，然而，上述研究中OMVs仅作为药物递送载体，并没有发挥诱导免疫效应的能力；细菌及其相关产物通常被认为具有一定的致病性，安全性问题使它们的临床应用受到限制；尽管如此，研究者仍然认为，一定程度上保留OMVs的免疫原性将有助于癌症的免疫治疗。

经文献检索等，迄今为止，尚未发现有减毒肺炎克雷伯氏菌的OMVs制备装载阿霉素的OMVs载药系统(DOX-OMV纳米粒)，并进行抗非小细胞肺癌作用研究的相关报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途，尤其是肺炎克雷伯菌外膜囊泡包载的阿霉素用于制备抗非小细胞肺癌药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒及其用途，尤其是肺炎克雷伯菌外膜囊泡包载的阿霉素用于制备抗非小细胞肺癌药物中的用途。

本发明从肺炎克雷伯菌中分离细菌外膜囊泡(OMVs)，并采用该囊泡包载肿瘤化疗药物阿霉素(DOX)，制备细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒(OMV-DOX)，该纳米粒能够通过被动靶向作用和诱导抗肿瘤免疫效应增强阿霉素抗非小细胞肺癌作用。

本发明采用超滤浓缩法和超速离心从减毒肺炎克雷伯菌培养液中分离OMVs，制备DOX-OMV纳米粒，平均粒径93.09nm；经试验显示，在体外该纳米粒能快速有效的被NSCLC细胞摄取，诱导肿瘤细胞凋亡，IC50为11.92μg/ml(游离DOX为35.51μg/ml)；在NSCLC移植瘤小鼠模型中，DOX-OMV治疗组小鼠肿瘤几乎消失，肿瘤组织切片Tunel染色结果表明DOX-OMV显著诱导肿瘤细胞凋亡，HE染色表明DOX-OMV引起广泛的肿瘤坏死，并且能够诱导抗肿瘤免疫效应；体内安全性评价表明能降低DOX的心脏毒性，具有很好的耐受性；药代动力学表明能延长DOX体内半衰期。本发明为在肿瘤治疗中同时实现化疗、靶向治疗和免疫治疗提供一种全新的策略。

更具体的，本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一部分DOX-OMV纳米粒的制备和表征

1.OMVs的制备

减毒K.pneumonia ACCC 60095(购自中国农业微生物菌种保藏中心)接种于LB培养基，于37℃、180r/min摇床培养，菌体OD值达到1.0后收集菌液。离心除去菌体后，超滤浓缩法和超速离心制备OMVs，Detoxi-Gel凝胶柱脱去内毒素，-20℃分装冻存，透射电镜和ζ电位分析仪进行观察以及粒径测定；

2.OMVs包载盐酸阿霉素

盐酸阿霉素(DOX)固体粉末溶解于PBS中(药物浓度为500μg/ml)，与OMVs的PBS溶液均匀混合，37℃孵育4h；0.22μm无菌滤头过滤除去杂质，再用截留分子量为100KDa的超滤管离心浓缩，加无菌PBS溶液洗涤并重复此步骤重复2～3次，得到DOX-OMV制剂；LC-MS检测包封率，透射电镜和ζ电位分析仪进行观察以及粒径测定。

第二部分DOX-OMV的抗非小细胞肺癌和抗肿瘤免疫作用及机制

1.细胞实验

1)细胞毒性检测：采用MTT实验检测DOX-OMV对非小细胞肺癌A549细胞的杀伤作用，计算IC50；

2)细胞凋亡检测：采用流式细胞分选仪检测DOX-OMV对A549细胞的凋亡诱导作用，western-blot检测凋亡相关蛋白的表达；

3)细胞摄取实验：采用激光共聚焦显微镜观察A549细胞对DOX-OMV阿霉素的摄取效率。

2.体内实验

1)建立小鼠NSCLC皮下移植瘤模型；

2)通过肿瘤体积、重量以及HE染色评价DOX-OMV体内抗NSCLC效果，肿瘤组织切片Tunel染色检测凋亡诱导作用；

3)肿瘤组织切片免疫组化检测免疫效应相关细胞因子以及巨噬细胞F4/80的表达水平，体内评价DOX-OMV的免疫诱导效应与抗肿瘤作用相关性。ELSA检测血清中炎症因子IL-6、IFN-γ、TNF-α水平。

第三部分药代动力学和体内安全性评价

1.药代动力学实验

DOX-OMV静脉注射新西兰兔，给药后于0h、1h、2h、4h、6h、12h和24h静脉采血,抗凝处理和血清样本的准备，通过LC-MS检测血清中的药物浓度，数据积分转换后使用DAS 2.0软件计算药代动力学参数；

2.安全性评价

1)大鼠连续用药15d后，检测血清中的乳酸脱氢酶(同工酶)LDH-L，肌酸激酶CK-MB的水平。大鼠眼眶取血或下腔静脉取血，储存于促凝管中，静置30min后，3500r/min离心5min，取上清按试剂盒方法，检测血清LDH、CK、AST的水平；

2)心、肝、脾、肺、肾的组织损伤观察：各组织制作蜡块和切片，HE染色观察组织损伤情况。

本发明的细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒尤其是肺炎克雷伯菌外膜囊泡包载的阿霉素可用于制备抗非小细胞肺癌的药物。

本发明提供了一种采用减毒肺炎克雷伯氏菌的OMVs制备装载阿霉素的DOX-OMV纳米粒，经抗非小细胞肺癌作用试验研究显示，该DOX-OMV纳米粒能同时发挥肺癌细胞靶向作用和诱导抗肿瘤免疫效应，延长药物半衰期，从而显著增强化疗药物阿霉素抗非小细胞肺癌疗效，并具备良好的安全性。本发明为在肿瘤治疗中同时实现化疗、靶向治疗和免疫治疗提供一种全新的方法。

本发明的细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒具有如下优点：

采用减毒肺炎克雷伯氏菌来源的OMVs包载阿霉素制备DOX-OMV纳米粒，并进行体内外抗非小细胞肺癌活性和抗肿瘤免疫效应研究，以及体内药代动力学和安全性评价；采用纳米尺寸的细菌外膜囊泡作为药物递送载体，不仅能通过高渗透长滞留效应(EPR效应)将化疗药物阿霉素靶向至肿瘤，而且能发挥生物纳米载体的诸多优势，如生物可降解性、能够逃避宿主免疫系统延长体内半衰期、以及选择性靶向作用等；减毒肺炎克雷伯氏菌来源的OMVs具有一定的免疫原性，能在体内诱导抗肿瘤免疫效应，本发明制备的DOX-OMV纳米粒可用于制备抗非小细胞肺癌的药物，能同时实现肿瘤的化疗、靶向治疗和免疫治疗。

附图说明

图1，DOX-OMV纳米粒的制备和表征。

图2显示OMVs能显著增强肿瘤细胞对阿霉素的摄取效率。

图3，DOX-OMV体外抗非小细胞肺癌作用，其中，

图3A表明DOX，DOX-LIPO和DOX-OMV的IC50值及western-blot检测凋亡相关蛋白的表达，图3B表明DOX-OMV能显著诱导凋亡相关蛋白caspase 3以及其下游关键蛋白PARP的剪切活化；图3C表明DOX-OMV显著诱导肿瘤细胞凋亡。

图4，DOX-OMV体内抗非小细胞肺癌作用，其中，

图4A表明DOX-OMV组小鼠肿瘤几乎消失，图4B，4C表明DOX-OMV显著诱导肿瘤细胞凋亡，图4D表明DOX-OMV引起广泛的肿瘤坏死，图4E，4F表明DOX-OMV能上调巨噬细胞表面糖蛋白F4/80表达水平。

图5，：DOX-OMV体内免疫诱导效应，其中，

图5A显示DOX-OMV和OMVs能显著提升血清中TNF-α和IL-6水平，之后随着时间的推移逐渐下降，24h后IL-6水平恢复到接近基础水平；图5B显示，经过11天反复给药后，所有组血清TNF-α,IL-6和IFN-γ水平均在较低水平，其中DOX-OMV和OMVs此三种细胞因子水平相对较高。

图6：DOX-OMV体内安全性评价，其中。

图6A表明相比于游离DOX，OMVs和DOX-OMV组显示低的上述3种心脏毒性标志物的水平；，图6B显示游离DOX组显示一定程度的肺泡损伤、细胞凋亡和微量出血。

图7显示：DOX-OMV体内药代动力学结果。

具体实施方式

实施例1：DOX-OMV纳米粒的制备和表征

OMVs和DOX-OMV纳米粒的制备方法如上述，透射电镜和ζ电位分析仪观察表明，减毒肺炎克雷伯氏菌来源的OMVs平均粒径为71.23nm，包载DOX后粒径增大为93.09nm，当DOX和OMVs的质量比为1:45时，LC-MS检测包封率达到78％(图1)。

实施例2：非小细胞肺癌细胞对DOX-OMV中药物的摄取

将非小细胞肺癌A549细胞接种于confocal板，培养过夜后，分别用OMVs,游离DOX(20μg/ml),以及等量药物的DOX-OMV纳米粒或DOX脂质体纳米粒(DOX-LIPO)处理12h；或者DOX-OMV处理0h,6h,12h和24h。Hoechst33342染料染色后，激光共聚焦显微镜观察细胞对药物的摄取。图2结果表明OMVs能显著增强肿瘤细胞对阿霉素的摄取效率。

实施例3：DOX-OMV体外抗非小细胞肺癌作用

将A549细胞(5×10³/孔)接种于96孔板，培养过夜，分别用不同浓度的DOX、DOX-OMV和DOX-LIPO处理24h后，MTT法检测细胞存活率并计算IC50值。图3A结果表明DOX，DOX-LIPO和DOX-OMV的IC50值分别为35.51,12.19和11.92μg/ml。western-blot检测凋亡相关蛋白的表达，图3B结果表明DOX-OMV能显著诱导凋亡相关蛋白caspase 3以及其下游关键蛋白PARP的剪切活化。流式细胞术检测结果也表明DOX-OMV能显著诱导肿瘤细胞凋亡(图3C)。

实施例4：DOX-OMV体内抗非小细胞肺癌作用

体外培养A549细胞至对数生长期，胰酶消化后PBS洗2遍，生理盐水调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。SPF级BALB/c裸鼠饲养至18～20g，随机分成5组(每天腹腔注射)：1)PBS；2)游离DOX(2mg/kg)；3)等量药物的DOX-OMV；4)等量药物的DOX-LIPO；5)OMVs。每天测定肿瘤体积和小鼠体重，11d断颈椎处死小鼠，取小鼠肿瘤称重。图4A结果表明DOX-OMV组小鼠肿瘤几乎消失，肿瘤组织切片Tunel染色结果表明DOX-OMV显著诱导肿瘤细胞凋亡(图4B，4C)，HE染色表明DOX-OMV引起广泛的肿瘤坏死(图4D)。

值得注意的是未载药的OMVs显示比游离DOX更强的体内抗肿瘤活性(图4A)，肿瘤组织免疫组化结果表明DOX-OMV能够上调巨噬细胞表面糖蛋白F4/80表达水平(图4E，4F)，提示OMVs能引起肿瘤组织巨噬细胞的募集，从而诱导抗肿瘤免疫效应。

实施例5：DOX-OMV体内免疫诱导效应

进一步在C57BL/6小鼠体内检测DOX-OMV免疫诱导效应。在初次给药1-3h，DOX-OMV和OMVs能显著提升血清中TNF-α和IL-6水平，之后随着时间的推移逐渐下降，24h后IL-6水平恢复到接近基础水平(图5A)。经过11天反复给药后，所有组血清TNF-α,IL-6和IFN-γ水平均在较低水平，其中DOX-OMV和OMVs此三种细胞因子水平相对较高(图5B)。上述结果表明DOX-OMV不会引起严重的炎症细胞因子反应，因此具有很好的耐受性；而适当上调的宿主免疫效应有利于发挥抗肿瘤免疫效应。

实施例6：DOX-OMV体内安全性评价

经过11天的用药后，取小鼠血清检测心脏毒性的主要指标乳酸脱氢酶(LDH)、天冬氨酸转氨酶(AST)和CK-MB水平。图6A结果表明相比于游离DOX，OMVs和DOX-OMV组显示低的上述3种心脏毒性标志物的水平。同时对主要组织器官病理分析结果表明，OMVs和DOX-OMV未对这些组织器官造成明显损伤，而游离DOX组显示一定程度的肺泡损伤、细胞凋亡和微量出血(图6B)。证实OMVs是一种安全有效的化疗药物递送载体。

实施例7：DOX-OMV体内药代动力学

DOX-OMV静脉注射新西兰兔，给药后于0h、1h、2h、4h、6h、12h和24h静脉采血,抗凝处理和血清样本的准备，通过LC-MS检测血清中的药物浓度。图7结果显示DOX-OMV比游离DOX的半衰期提高2倍以上，DOX、DOX-LIPO和DOX-OMV的AUCfen别为684.125、936.594和1234.364(mg·h/L)。

Claims

1.一种细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒，其特征在于，通过下述方法制备：

减毒K.pneumonia ACCC 60095接种培养，菌体OD值达到1.0后收集菌液；离心除去菌体后，超滤浓缩法和超速离心制备OMVs，Detoxi-Gel凝胶柱脱去内毒素，-20℃分装冻存；

盐酸阿霉素(DOX)固体粉末溶解于PBS中，药物浓度为500μg/ml，与OMVs的PBS溶液均匀混合，孵育，过滤除杂质，超滤离心浓缩，洗涤，得DOX-OMV制剂。

2.按权利要求1所述的细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒，其特征在于，所述的细菌外膜囊泡来源于减毒的肺炎克雷伯菌。

3.权利要求1所述的细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。

4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的纳米粒通过靶向作用和诱导抗肿瘤免疫效用增强化疗药物阿霉素抗非小细胞肺癌疗效。

5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的细菌外膜囊泡包载的阿霉素纳米粒用于制备同时实现肿瘤的化疗、靶向治疗和免疫治疗的制剂中的用途。