CN102370987B

CN102370987B - 一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体

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Publication number: CN102370987B
Application number: CN 201010263759
Authority: CN
Inventors: 郭良然; 蒋新国; 范丽
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2010-08-26
Filing date: 2010-08-26
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2030-08-26
Also published as: CN102370987A

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明以脂质体同时包载凋亡素和化疗药物，利用脂质体对药物的保护作用提高凋亡素的稳定性；利用脂质体的长循环作用，显著延长凋亡素和化疗药物的体内滞留时间；利用脂质体对于肿瘤的增强渗透和滞留效应，使更多凋亡素和化疗药物被动靶向而浓集于肿瘤组织；利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用，提高对于肿瘤的治疗效果，降低药物的毒副作用。

Description

一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。本发明的注射用脂质体同时包载抗肿瘤蛋白（基因）药物凋亡素和抗肿瘤化学药物，将药物靶向递送至肿瘤组织，通过药物不同的作用机理和协同作用，提高肿瘤治疗效果，降低药物的毒副作用。

背景技术

恶性肿瘤是人类最难对付的顽症之一。近年来，肿瘤的发病率急剧上升，其治疗难度大、死亡率高，己成为人类死亡的第二大病因。据报道，全世界每年约有600 万人死于恶性肿瘤；中国癌症患者约450 万人，死亡率逾30％，已成为严重的社会问题。目前，临床上常采用的治疗恶性肿瘤的手段包括手术、化疗及放疗等。对于早期肿瘤，手术切除辅以其它疗法往往可取得较好的治疗效果；而对于晚期肿瘤，多以放、化疗综合治疗以延缓病情的发展，但均伴随严重的免疫系统抑制或毒副作用，难以有效提高患者的生存率和生活质量。因而，探寻疗效好、不良反应较小的治疗手段或药物一直是肿瘤治疗的研究热点和努力方向。

作为肿瘤坏死因子超家族的一员，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL）近年来受到诸多研究者和制药公司的关注。现有技术公开了TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源三聚体。与其他肿瘤坏死因子或化疗药物相比，TRAIL可快速启动细胞凋亡信号途径，强力、广谱诱导肿瘤和转化细胞凋亡，对正常组织细胞则基本无影响。有研究显示，随着TRAIL浓度的增加，其对人胶质瘤U87细胞的诱导凋亡作用明显增强，对正常细胞基本无杀伤作用（参见Henning Walczak等，Nat Med，2002，8：808-815）。TRAIL的这一优点使其在肿瘤治疗方面有着广阔的应用前景。由美国Gentech和Immunex公司联合研制开发的TRAIL已于2001年经FDA批准进入I期临床研究。基于TRAIL的潜在应用优势，国内外已有研究者通过生物工程技术，利用工程菌重组表达产生TRAIL全分子N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，称之为重组人凋亡素2配体。

本发明下文中统称人TRAIL全分子、重组人凋亡素2配体或表达上述2种蛋白的基因为凋亡素。

尽管凋亡素在抗肿瘤方面有着诸多优势，但治疗实践显示其仍存在以下缺陷：① 某些肿瘤细胞对凋亡素不敏感。本发明在前期研究中发现，凋亡素对某些神经胶质瘤和黑色素瘤细胞株基本无杀伤作用，这一结果极大限制了凋亡素的临床应用范围；② 半衰期很短（人体的T_1/2 < 0.6 h），凋亡素进入体循环后和肿瘤细胞没有充分的作用时间，疗效持续时间短，需要频繁给药；③ 组织分布广泛，对肿瘤细胞无靶向治疗作用，一定程度上减弱了其抗肿瘤效果。

目前尚未有相关专利或文献报道能够同时克服上述缺陷，即在增强肿瘤细胞对凋亡素敏感性的同时增加凋亡素的体内滞留时间，提高其抗肿瘤效果。例如，美国专利“Use of TRAIL Polypeptides to Treat Cancer”（专利申请号为496632），“DNA encoding a cytokine that induces apoptosis”（专利号为08/5763223），“Cytokine that induces apoptosis”（专利号为6284236），“Use of TRAIL polypeptides to induce apoptosis”（专利号为7736637）；中国专利“人截短型重组可溶性TRAIL-180蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用”（专利申请号为02116262.X），“人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用”（专利申请号为02116263.8），“重组人可溶性TRAIL蛋白、其制备方法及其应用”（专利申请号为02148672.7），“一种重组人可溶性凋亡素2配体的构建与纯化工艺”（专利申请号为01144948.9），“新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法”（专利申请号为02110880.3），“人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物”（专利申请号为 01132158.X）等。上述专利主要涉及凋亡素的制备、纯化工艺及其抗肿瘤作用的初步研究。少量文献报道凋亡素与化疗药物合用可增加其对肿瘤细胞的治疗效果（参见Naka T等，Cancer Res，2002，62：5800-5906；Heather Wahl等，Gynecol Oncol，2007，105：104-112；Thomas J等，Cancer Immunol Immun，2006，55：76-84）。联合用药虽然提高了凋亡素对肿瘤细胞的杀伤作用，但增加的效率有限，且凋亡素体内滞留时间短的问题仍无法解决。

凋亡素作为一种蛋白（基因）药物，亲水性强、稳定性极差，以脂质体包载时存在包封率低，易泄露，活性难以保持等缺点。目前，尚未见有效地以脂质体包载凋亡素的文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种新的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，特别是一种同时包载抗肿瘤蛋白（基因）药物凋亡素和抗肿瘤化学药物，且能提高肿瘤治疗效果，降低毒副作用的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体。

本发明以脂质体同时包载凋亡素和化疗药物，利用脂质体对药物的保护作用提高凋亡素的稳定性；利用脂质体的长循环作用，延长凋亡素和化疗药物的体内滞留时间；利用脂质体对于肿瘤的增强渗透和滞留效应（EPR效应），使更多凋亡素和化疗药物被动靶向而浓集于肿瘤组织；利用凋亡素和化疗药物不同的抗肿瘤机理，发挥强力的协同作用，提高对于肿瘤的治疗效果，降低药物的毒副作用。

本发明在制备技术上解决了现有技术存在的技术难点，以聚乙二醇修饰的脂质体包载凋亡素，通过调节处方和工艺使得脂质体对凋亡素有较高的包封率，并保持凋亡素的活性。本发明注射用脂质体经实验，结果显示，所述的凋亡素被脂质体包载后，其体内循环时间显著延长。

具体而言，本发明的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质采用具有长循环特性和肿瘤被动靶向功能的脂质体为载体，同时包载抗肿瘤蛋白（基因）药物凋亡素和抗肿瘤化学药物紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素等，将药物靶向递送至肿瘤组织，通过两类药物不同的作用机理和强力的协同抗肿瘤作用，提高肿瘤治疗效果，降低药物的毒副作用。

本发明制剂由长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物及药剂学上必要的辅料制成，其中脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为85～99.97 %，0.01～10 %，0.01～14 %，0.01～1 %。所述的注射用脂质体是以脂质体同时包载凋亡素和抗肿瘤化学药物，或以脂质体分别包载凋亡素或抗肿瘤化学药物后，再将两种脂质体以一定比例均匀混合制得；本发明注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比均为200：1～40000。

所述的长循环脂质体以磷脂、胆固醇、长循环辅料和必要的制剂辅料为材料制成的脂质双分子囊泡。

所述的磷脂可以是蛋黄卵磷脂（EPC）、大豆磷脂（SPC）、氢化豆磷脂（HSPC）、二月桂酰卵磷脂（DLPC）、二硬脂酰卵磷脂（DSPC）、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂（MPPC）、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂（PMPC）、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂（PSPC）、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂（SPPC）、二油酰基卵磷脂（DOPC）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二棕榈酰甘油（DPPG）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二棕榈酰神经鞘磷脂（DPSP）、二棕榈酰卵磷脂（DPPC）、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸（DPPS）、二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、脑磷脂酰丝氨酸（PS）、二肉豆蔻酰卵磷脂（DMPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、脑神经鞘磷脂（BSP）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二硬脂酰神经鞘磷脂（DSSP）或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）中的一种或多种。其中优选EPC、SPC和HSPC。所选用的磷脂占脂质体的质量比为40～99.5%，优选的比例为49～90%。

本发明所述的长循环辅料包括聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇。其中，优选PEG-DSPE ；PEG-DSPE中PEG的分子量范围为800～5000，优选的PEG分子量范围为1000～4000。。

所述的的PEG-DSPE所占脂质体的质量比为1～25%，优选的比例为3～15%；

本发明所述的必要辅料主要为抗氧化剂如维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸和L-异亮氨酸。其中，优选维生素E、维生素C和亚硫酸氢钠。

所述的凋亡素包括人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）、重组人凋亡素2配体（Recombinant Human Apo-2 ligand，Apo2-L）和表达TRAIL或Apo2-L的基因。

其中，TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域。TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源三聚体。Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，也可以是N-末端第95与114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子。所述的表达TRAIL或Apo2-L的基因可以通过工程菌表达TRAIl全分子或Apo2-L。

上述凋亡素被包载后，每次的凋亡素给药剂量为10～5000 μg/kg，优选的每次给药剂量为50～1000 μg/kg；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0.14～70 mg/kg，优选的每一疗程的给药剂量为0.7～14 mg/kg。

本发明所述的抗肿瘤化学药物包括阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、卡氮芥、卡铂、顺铂、环磷酰胺、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、正定霉素、丝裂霉素、阿克拉霉素、干扰素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、龟臼乙叉甙、三本氧胺、舒尼替尼、阿糖胞苷等。其中优选的药物为阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、卡铂、顺铂和放线菌素D。

本发明所述的阿霉素和盐酸阿霉素的每次给药剂量为0.5～4 mg/kg，优选的给药剂量为1.0～2.5 mg/kg；所述的紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为2～10 mg/kg，优选的给药剂量为3.0～6.0 mg/kg；所述的喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0.1～1.0 mg/kg，优选的给药剂量为0.125～0.4 mg/kg；所述的长春碱的给药剂量为0.05～0.4 mg/kg，优选的给药剂量为0.1～0.2 mg/kg；所述的长春新碱的给药剂量为5～100 μg/kg，优选的给药剂量为20～60 μg/kg；所述的长春地辛的给药剂量为0.05～0.4 mg/kg，优选的给药剂量为0.06～0.2 mg/kg；所述的长春瑞宾的给药剂量为0.2～2.0 mg/kg，优选的给药剂量为0.5～1.5 mg/kg；所述的顺铂的给药剂量为2.0～20 mg/kg，优选的给药剂量为2.5～12.0 mg/kg；所述的卡铂的给药剂量为1.0～20 mg/kg，优选的给药剂量为1.5～12.0 mg/kg；所述的放线菌素D的给药剂量为1.0～10 μg/kg，优选的给药剂量为2～7 μg/kg。

本发明采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备注射用脂质体，并用超声或高压均质控制粒径。

本发明所述的注射用脂质体，可以是静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它途径的注射给药。

本发明所述的注射用脂质体对人肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌、肠癌等的治疗效果均优于单独用药或非脂质体制剂（如实施例6～13所述）。

本发明注射用脂质体，通过增强肿瘤细胞对凋亡素的敏感性，显著延长凋亡素的稳定性和体内循环时间，提高其抗肿瘤效果。本发明避免了临床单用凋亡素注射剂的缺点，将脂质体制剂的靶向和长循环优势与两种药物协同的治疗优势融合，具有良好的临床实践意义。

本发明的注射用脂质体显著优点有：

1）对凋亡素有较高的包封率和载药能力，包载后凋亡素的活性保持良好；

2）显著提高了凋亡素在血液中的稳定性和滞留时间，增加了凋亡素和肿瘤细胞的作用时间，利于提高其抗肿瘤效果。

3）本发明以长循环脂质体作为载体，同时包载具有很强协同抗肿瘤作用的凋亡素和抗肿瘤化学药物，增加了肿瘤细胞对凋亡素的敏感性。

4）本发明的长循环脂质体可利用肿瘤部位的EPR效应，增加凋亡素和抗肿瘤化学药物在肿瘤组织的蓄积，利于发挥两种药物的协同抗肿瘤效果，降低对其它组织的毒副作用。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1，各制剂组给药后人肺癌A549瘤体体积与时间的关系。

图2，各制剂组给药后人乳腺癌MCF-7瘤体体积与时间的关系。

图3，各制剂组给药后人卵巢癌SKOV-3瘤体体积与时间的关系。

具体的实施方式

实施例1、

表1 包载凋亡素和紫杉醇等脂质体处方中各组分的比例（w/w %）

将表1处方1～30中的磷脂、胆固醇等脂溶性辅料和化学药物溶于适量氯仿中，于37℃水浴中旋转蒸发成膜；加入水溶性辅料和凋亡素的PBS溶液充分混合，冷水浴水化2小时，冰浴超声震荡5分钟，挤压过200 nm聚碳酯膜5～10次。将制得的脂质体过Sephadex G-50柱，用PBS缓冲液（pH7.4）作为流动相洗脱，收集脂质体部分，并将收集到的脂质体分装，加入5倍于脂质质量的葡萄糖或海藻糖，然后过0.22 μm微孔滤膜，分装，冷冻干燥即得。

实施例2、

表2 包载凋亡素和阿霉素脂质体处方中各组分的比例（w/w %）

分别将表2处方1～30中的脂溶性辅料溶于适量氯仿中，以适当比例分为两份A和B，均置于37℃水浴中旋转蒸发成A膜和B膜。A膜以凋亡素的PBS溶液充分混合，冷水浴水化2小时，冰浴超声震荡5分钟，挤压过200 nm聚碳酯膜5～10次。将制得的脂质体过Sephadex G-50柱，用PBS缓冲液（pH7.4）作为流动相洗脱，收集脂质体部分，即得包载凋亡素的脂质体。

B膜以120 mM的硫酸铵溶液于室温水化2小时，超声震荡5分钟，挤压过200 nm聚碳酯膜5～10次。将制得的脂质过Sephadex G-50柱，用生理盐水作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置60℃水浴中加热，加入处方量阿霉素粉末或盐酸阿霉素溶液并振摇孵育30分钟，得包载阿霉素的脂质体。

将包载凋亡素和阿霉素的脂质体混合均匀，即得同时包载凋亡素和阿霉素的脂质体。

实施例3、

表3 包载凋亡素和长春瑞宾等脂质体处方中各组分的比例（w/w %）

将表3处方1～30中的脂溶性成分溶于适量氯仿中，于37℃水浴中旋转蒸发成膜，以pH7.4 PBS溶解水溶性成分后加入磷脂膜中充分混合，冷水浴水化2小时，冰浴超声震荡5分钟，挤压过200 nm聚碳酯膜5～10次。将制得的脂质体过Sephadex G-50柱，生理盐水作为流动相洗脱，收集脂质体部分，即得。

实施例 4、

表4 包载凋亡素和顺铂等脂质体处方中各组分的比例（w/w %）

将表4处方1～30中的脂溶性辅料溶于适量氯仿中，于37℃水浴中旋转蒸发成膜，以pH7.4 PBS溶解凋亡素和药物后加入磷脂膜中充分混合，冷水浴水化2小时，冰浴超声震荡5分钟，挤压过200 nm聚碳酯膜5～10次。将制得的脂质体过Sephadex G-50柱，生理盐水作为流动相洗脱，收集脂质体部分，即得。

实施例 5、

表5 包载凋亡素和喜树碱等脂质体处方中各组分的比例（w/w %）

制备方法同实施例1。

实施例6、包载凋亡素和放线菌素D脂质体对肺癌的药效学试验

肿瘤细胞：人非小细胞肺腺癌细胞株A549，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：采用右腋皮下接种模型，无菌条件下取生长旺盛的A549细胞，以匀浆法制备成约2.0E7/ml细胞悬液，于每只裸鼠右腋皮下接种0.1ml癌细胞悬液。

抑瘤率的计算及数据处理：给药后每3日以游标卡尺测量各组裸小鼠肿瘤的长径及短径，根据公式计算肿瘤体积（肿瘤体积=[短径²×长径]/2）和抑瘤率（肿瘤抑制率％ =［(阴性对照组平均瘤重－给药组平均瘤重） / 阴性对照组平均瘤重)×100］。

给药方案为尾静脉注射，每天1次，连续14天。肿瘤重量等实验结果见表6，各制剂组给药开始后的肿瘤体积变化情况见图1。

表6. 包载凋亡素和放线菌素D脂质体抗肿瘤疗效试验结果

***P值＜0.01与生理盐水组相比

结果显示，各药物治疗组的肿瘤体积和重量均显著小于生理盐水组（p < 0.01），表明各制剂对A549细胞接种的皮下肿瘤均有一定的治疗效果。但相比单用凋亡素或放线菌素D，两种药物合用对肿瘤具有更强的治疗效果。以临床常用的溶液剂联合给药，其对肿瘤的抑制率为44.2%；若以脂质体同时包载两种药物，其对肿瘤的抑制率达到70.2%，两者具有极显著性差异（p < 0.001）（如图1和表6所示）。本发明所制得的脂质体比现有临床使用的溶液剂具有更好的治疗效果。

实施例7、

包载凋亡素和盐酸阿霉素脂质体对乳腺癌的药效学试验

肿瘤细胞：人乳腺癌MCF-7细胞（购自中国科学院上海细胞库），用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。

试验所用动物及肿瘤的接种方法同实施例6。给药方案见表7，肿瘤体积变化情况见图2。

表 7. 包载凋亡素和盐酸阿霉素脂质体对乳腺癌的药效学研究给药方案

结果显示，单用凋亡素脂质体和盐酸阿霉素脂质体对人乳腺癌肿瘤均有一定的治疗效果，但两种脂质体合用时，具有强烈的协同抗肿瘤效果（如图2所示），由肿瘤的体积变化曲线可以看到，给予（凋亡素+盐酸阿霉素）脂质体后，乳腺癌瘤体体积的增长速度显著慢于其他制剂组。对比两组合用药物的制剂组，可以看出（凋亡素+盐酸阿霉素）脂质体制剂组比对应的溶液剂组具有更高的肿瘤抑制效果。上述结果表明了本发明脂质体在肿瘤治疗上的优越性。

实施例8、

包载凋亡素和阿霉素脂质体对脑胶质瘤的药效学试验

肿瘤细胞：人脑胶质瘤U87细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

动物：Balb-c裸小鼠，4周龄，初始体重为18～20克，雌性。试验组及阴性对照组每组6只裸小鼠。

肿瘤细胞的接种：脑部原位接种模型，无菌条件下取生长旺盛的U87细胞，以匀浆法制备成约2.0E5/5

细胞悬液，于裸小鼠右脑纹状体接种细胞的数量为20万/鼠。

评价指标：以裸鼠的生存期为指标，评价各组制剂的抗肿瘤效果。

给药方案见及试验结果如表8所示。

表8. 包载凋亡素和阿霉素脂质体对脑胶质瘤的药效学研究给药方案

***P值＜0.01与生理盐水组相比，以下同

结果表明，凋亡素溶液组、阿霉素溶液组、凋亡素脂质体组、阿霉素脂质体组、（凋亡素 + 阿霉素）脂质体组的生存期分别为24、30、22、37和45天，与生理盐水组的生存期相比，具有显著性差异（P < 0.01）。容易看出，单用脂质体组的生存期比单用溶液组的生存期有显著延长（P < 0.01），脂质体合用后的生存期比单用时显著延长（P < 0.01）。因此，以脂质体作为载体，可显著提高药物的抗肿瘤效果，脂质体合用后，其抗肿瘤效果进一步增强。

实施例 9、

包载凋亡素和紫杉醇脂质体对卵巢癌的药效学试验

肿瘤细胞：人卵巢癌SKOV-3细胞（购自中国科学院上海细胞库），用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

实验所用动物及肿瘤的接种方法同实施例7。

给药方案如表9所示。各制剂给组药后肿瘤体积变化情况如图3所示。

表9. 包载凋亡素和紫杉醇脂质体对卵巢癌药效学研究给药方案

图3显示了凋亡素脂质体和紫杉醇脂质体对人卵巢癌肿瘤均有一定的治疗效果。目前，紫杉醇作为临床治疗卵巢癌的一线药物，其脂质体制剂的抑瘤效果显著优于凋亡素脂质体。但单用紫杉醇仍难以治愈或有效抑制卵巢癌。本发明以脂质体包载紫杉醇和凋亡素后，两种药物的协同抗肿瘤效果比单用脂质体和溶液剂进一步增强。由肿瘤的体积变化曲线可以看到，给予（凋亡素+紫杉醇）脂质体后，卵巢癌瘤体体积的增长速度显著低于单用制剂组，有效抑制了肿瘤体积的增加。本发明在临床上有望具有更好抗肿瘤效果。

实施例 10、

化疗药物剂量依赖性的药效学试验

试验药物：凋亡素、紫杉醇、顺铂

肿瘤细胞：人肝癌HepG-2（购自中国科学院上海细胞库），用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

实验所用动物及肿瘤的接种方法同实施例7。

给药方案为尾静脉注射，每4天给药1次，共给药4次。试验结果如表10所示。

表10. 化疗药物剂量依赖性的药效学研究

上述结果表明，无论合用还是单用，化疗药物对肿瘤的抑制作用均呈剂量依赖性。凋亡素和不同剂量化学药物合用均可增加对肿瘤的抑制效果。以顺铂为例，其和凋亡素合用后，低剂量顺铂的抑瘤效果与单用顺铂中剂量的抑瘤效果相当。在临床上，两药合用可大大降低化疗药物的给药剂量，降低药物的毒副作用。

实施例 11、

凋亡素剂量依赖性的药效学试验

试验方案见实施例10。

给药方案为尾静脉注射，每4天给药1次，共给药4次。试验结果如表11所示。

表11. 凋亡素剂量依赖性的药效学研究

结果表明，单用凋亡素脂质体，其对肿瘤的抑制作用呈现剂量依赖性。但其和化学药物合用后则无显著剂量依赖性现象。考虑到凋亡素低剂量组与高剂量组相比，疗效相当、毒性相对较低、以及治疗成本较少，在临床可尽量采用低剂量凋亡素和化学药物联合应用。

实施例 12、

脂质体增强凋亡素稳定性的试验

取适量凋亡素溶液和凋亡素脂质体，置于10%空白大鼠血浆中，调整凋亡素在血浆中终浓度为1000 ng/ml。将上述样品置于37℃水浴中4小时后取出，配置系列浓度样品，测定凋亡素对人胰腺导管癌SW1990细胞株的细胞毒作用。结果如表12所示。

表12. 脂质体增强凋亡素在血浆中的稳定性试验结果

试验结果表明，凋亡素溶液在孵育过程中受血浆中酶的代谢或降解作用，其活性受到显著影响，IC₅₀由13.2 ng/ml增加为47.9 ng/ml。凋亡素被包载后，脂质体的磷脂双分子膜对处于内水相的凋亡素具有良好的保护作用，血浆中的蛋白酶难以进入脂质体内部，利于保持凋亡素的结构稳定和活性。脂质体经孵育后，IC₅₀由15.1 ng/ml增加为18.2 ng/ml，增加倍数显著低于溶液剂（P < 0.01）。本发明脂质体进入人体循环系统后，可较长时间保持的凋亡素的稳定性，提高抗肿瘤效果。

实施例 13、

凋亡素脂质体裸小鼠体内药动学试验

荷人肺癌A549模型鼠的建立：同实施例5，在接种肿瘤细胞4周后进行试验。

给药方案：取96只模型裸小鼠，分成2组：凋亡素溶液组和凋亡素脂质体组。每组分别尾静脉注射给药0.4ml（相当于凋亡素2.5 mg/kg），于给药后的 0.083，0.25，0.5，1，4，8，12和24 h摘眼球取血0.5ml，置于肝素化的EP管中，5000 rpm离心10min分离血浆，取上清置于-70℃冰箱备用。取血后处死裸小鼠，剥离肿瘤瘤体，-70℃保存。每个时间点重复采集6只小鼠样品。实验结束后，以ELISA方法检测样品中凋亡素的含量。

数据的处理：采用DAS 2.1.1版软件，按房室模型拟合后求算各组的药动学参数，结果见表13。

表 13. 荷A549肿瘤裸小鼠尾静脉注射凋亡素脂质体后的主要药动学参数

模型鼠静脉注射凋亡素溶液和凋亡素脂质体后快速分布，较缓慢消除，药时曲线均符合三室模型。凋亡素溶液给药后5min内在血浆中浓度迅速降低，分布到全身的器官和组织，而凋亡素脂质体则可以在血中滞留1h以上，延长药物在体内的循环时间。给药后凋亡素溶液和凋亡素脂质体的AUC_0-24h分别为21.934mg·L^-1·h和178.635mg·L^-1·h，脂质体制剂的AUC_0-24h显著高于溶液剂。凋亡素脂质体的t_1/2α、t_1/2β、t_1/2γ和AUC分别是凋亡素溶液的18.4，0.43，1.24和25.58倍，而后者的CL是前者的10倍。可见脂质体能显著延长凋亡素在体内的循环时间，显著提高AUC和降低清除率，利于增强凋亡素的抗肿瘤效果。

24 h内凋亡素在瘤体内的浓度如表14所示，脂质体组于各时间点在肿瘤中的药物浓度均比溶液组高。在0.5 h时间点，脂质体组的药物浓度是溶液组的7.75倍，说明脂质体作为药物载体能显著提高凋亡素在肿瘤部位的蓄积。本研究也证实阿霉素脂质体在肿瘤部位存在类似的药物蓄积。因此，本发明制剂可将两种药物集中输送至肿瘤部位，发挥协同抗肿瘤作用。

表14. 凋亡素于不同时间点在肿瘤部位的药物浓度

Claims

1.一种包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述制剂由长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物及药剂学上必要的辅料制成，其中长循环脂质体、凋亡素、抗肿瘤化学药物和辅料所占的质量比分别为85～99.97%、0.01～10%、0.01～14%、0.01～1%；

所述的注射用脂质体是以脂质体为药物载体同时包载凋亡素和抗肿瘤化学药物，或以脂质体分别包载凋亡素和抗肿瘤化学药物后，再将两种脂质体以一定比例混合均匀；

所述的注射用脂质体所包载的凋亡素和抗肿瘤化学药物的质量比均为200：1～40000；

所述的长循环脂质体是以磷脂、胆固醇、长循环辅料和必要的辅料为材料制成的脂质双分子囊泡，其中，所述的长循环辅料选自聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、神经节苷脂、聚丙烯酰胺、壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇；所述的必要的辅料选自抗氧化剂，包括维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠和偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸；

所述的抗肿瘤化学药物选自阿霉素、盐酸阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞宾、顺铂、卡铂或放线菌素D。

2.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的凋亡素选自人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体、重组人凋亡素2配体或表达TRAIL或Apo2-L的基因。

3.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的TRAIL全分子由281个氨基酸组成，分子量约为32000道尔顿，其N-末端第15～40位氨基酸为疏水区域形成的跨膜结构，N-末端第95～281位或114～281位氨基酸组成的C-末端胞外区域为亲水性区域；TRAIL的活性形式为胞外亲水性区域与锌离子络合形成的同源三聚体；

所述的Apo2-L是由工程菌重组表达产生的TRAIL全分子的N-末端第95～281位或第114～281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子，或是N-末端第95与114位之间任何一位氨基酸到第281位氨基酸所形成的亲水性蛋白分子。

4.根据权利要求2所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的表达TRAIL或Apo2-L的基因通过工程菌表达TRAIL全分子或Apo2-L。

5.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的凋亡素被包载后，每次凋亡素的给药剂量为10～5000μg/kg，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程的给药剂量为0.14～70mg/kg。

6.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的凋亡素被包载后，每次凋亡素的给药剂量为50～1000μg/kg；给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程的给药剂量为0.7～14mg/kg。

7.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的抗肿瘤化学药物中，阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为0.5～4.0mg/kg，紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为2.0～10.0mg/kg，喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0.1～1.0mg/kg，长春碱的给药剂量为0.05～0.4mg/kg，长春新碱的给药剂量为5.0～100.0μg/kg，长春地辛的给药剂量为0.05～0.4mg/kg，长春瑞宾的给药剂量为0.2～2.0mg/kg，顺铂的给药剂量为1.0～20.0mg/kg，卡铂的给药剂量为1.0～20.0mg/kg，放线菌素D的给药剂量为1.0～10.0μg/kg。

8.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的抗肿瘤化学药物中，阿霉素和盐酸阿霉素的给药剂量为1.0～2.5mg/kg；紫杉醇和多烯紫杉醇的给药剂量为3.0～6.0mg/kg；喜树碱和羟基喜树碱的给药剂量为0.125～0.4mg/kg；长春碱的给药剂量为0.1～0.2mg/kg；长春新碱的给药剂量为20.0～60.0μg/kg；长春地辛的给药剂量为0.06～0.2mg/kg；长春瑞宾的给药剂量为0.5～1.5mg/kg；顺铂的给药剂量为2.5～12.0mg/kg；卡铂的给药剂量为1.5～12.0mg/kg；放线菌素D的给药剂量为2.0～7.0μg/kg。

9.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的磷脂是蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰神经鞘磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二月桂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的磷脂是蛋黄卵磷脂、大豆磷脂和氢化豆磷脂。

11.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所选用的磷脂在脂质体中所占的质量比为40～99.5%。

12.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所选用的磷脂在脂质体中所占的质量比为49～90%。

13.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的长循环辅料是聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。

14.根据权利要求13所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体中所占的质量比为1～25%，聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为1000～4000。

15.根据权利要求13所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在脂质体中所占的质量比为3～15%；聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇的分子量为1000～4000。

16.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的必要的辅料为维生素C、维生素E或亚硫酸氢钠。

17.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的脂质体以水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水为分散介质。

18.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的脂质体采用薄膜分散法或逆向蒸发法制备，并采用超声或高压均质控制粒径。

19.根据权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体，其特征在于，所述的脂质体通过静脉、皮下、肌内、膜内、腹膜内或其它静脉途径给药。

20.权利要求1所述的包载抗肿瘤药物组合物的注射用脂质体在制备治疗人肺癌、乳腺癌、卵巢癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺导管癌或肠癌药物中的用途。